AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO REPRODUTIVA DE CARNEIROS SANTA INÊS DURANTE O PRIMEIRO ANO DE VIDA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCAS AGRÁRIAS DEPARTAMENO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO REPRODUTIVA DE CARNEIROS SANTA INÊS DURANTE O PRIMEIRO ANO DE VIDA DESENVOLVIMENTO TESTICULAR, PRODUÇÃO ESPERMÁTICA E PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL Carlos Eduardo Azevedo Souza Médico Veterinário FORTALEZA-CE 2003

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCAS AGRÁRIAS DEPARTAMENO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO REPRODUTIVA DE CARNEIROS SANTA INÊS DURANTE O PRIMEIRO ANO DE VIDA DESENVOLVIMENTO TESTICULAR, PRODUÇÃO ESPERMÁTICA E PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL AUTOR: CARLOS EDUARDO AZEVEDO SOUZA ORIENTADOR: Prof ARLINDO DE ALENCAR ARARIPE N. MOURA, PhD. Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós- Graduação em Zootecnia, como prérequisito para obtenção do título de Mestre em Zootecnia Área de Concentração: Reprodução de Ovinos. FORTALEZA-CE Janeiro de

3 S714a Souza, Carlos Eduardo Azevedo Avaliação da função reprodutiva de carneiros santa inês durante o primeiro ano de vida: estudo do desenvolvimento testicular, produção espermática e caracterização das proteínas do plasma seminal. / Carlos Eduardo Azevedo Souza Fortaleza, xxii, 160f.:il. Orientador: Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura. 1. Ovinos - Puberdade 2. Ovinos - Sêmen. 3. Ovinos - Plasma seminal de ovinos CDD Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e classificação da Biblioteca Central da UFC 3

4 Esta dissertação foi submetida como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Zootecnia, outorgado pela Universidade Federal do Ceará, e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca Central da referida Universidade. A citação de qualquer trecho da dissertação é permitida, desde que seja feita de conformidade com as normas da ética científica. CARLOS EDUARDO AZEVEDO SOUZA DISSERTAÇÃO APROVADA EM 12/03/2003 Prof Dr. ARLINDO DE ALENCAR ARARIPE N. MOURA ORIENTADOR Prof. Dr. AIRTON ALENCAR DE ARAÚJO CONSELHEIRO (UECE/UFC) Prof. Dr. JOSÉ TADEU OLIVEIRA CONSELHEIRO (UFC) 4

5 EPÍGRAFE Apenas observando o que vemos na natureza podemos errar. Somente o experimento pode nos revelar a verdade. Galileu Galilei 5

6 Ao grande amor da minha vida, Alethéia, por todos os momentos bons e ruins que passamos sempre unidos. Por nunca me deixar desistir, mesmo diante dos maiores obstáculos. OFEREÇO Aos meus pais Augusto e Fátima, e minha querida avó Nair pelo apoio para superar e transpor as dificuldades que ocorreram durante mais uma conquista. Por terem sempre acreditado em mim, mesmo quando eu mesmo duvidava. DEDICO 6

7 AGRADECIMENTOS A Deus, pela força que me impulsionou nunca deixando desistir. Aos meus Pais (Augusto e Fátima) e irmãos (Lia, Rodrigo, Augusto Jr. e Ana), pela compreensão e amor em todos os momentos de renúncia, ausência e impaciência. À minha amada noiva e grande amiga Alethéia Carízia Baracho de Lima, pelo companheirismo e amor imprescindíveis, estando sempre ao meu lado, mesmo nas maiores turbulências. Que Deus possa abençoá-la em todos os seus desafios, pois, sem seu apoio incondicional, a realização desse trabalho não teria sido possível. Ao meu orientador prof. Arlindo Alencar Araripe Moura, pelos ensinamentos profissionais e de vida que me foram passados. Ao professor Airton Alencar Araújo, pela paciência e disponibilidade em colaborar com esse trabalho. Aos professores José Neuman Miranda Neiva e José Tadeu de Oliveira pelo grande apoio neste desafio. A todos os professores pelos conhecimentos, os quais posso me utilizar em favor dos animais. Aos meus amigos: Regiane Santos, Alexandre Rodrigues, Ana Kellen Lima, Noelita Melo, Arnaud e Danielle Azevedo, Ana Cristina Holanda, Josefa Deis, Diones Oliveira Santos, Almir Chalegre, Simone Aparecida e a todos com quem sempre pude contar. À banca examinadora pela atenção dispensada na correção deste trabalho. A todas as pessoas que estiveram comigo nesta longa jornada. Ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia UFC pela formação durante esse curso. E a todos os animais, a quem prometo especial dedicação. O meu sincero obrigado! 7

8 S U M Á R I O Página LISTA DE TABELAS...ix LISTA DE FIGURAS...x LISTA DE ABREVIAÇÕES... xiv RESUMO...xvii ABSTRACT... xx 1 - INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Desenvolvimento Testicular em Ovinos Estrutura Testicular Cinética e Quantificação da Espermatogênese Proteínas do Plasma Seminal Proteínas Ligadoras de Fosfolipídeos Proteínas Ligadoras de Heparina Prostaglandina D Sintetase Osteopontina Fosfolipase A Sistema Kalikreína-Cininas Clusterina Lactoferrina Proteínas não identificadas MATERIAL E MÉTODOS Localização do Experimento e Manejo dos Animais Desenvolvimento Corporal e Testicular

9 3.3. Estudo da Puberdade Avaliação do Sêmen Determinação da Concentração de Testosterona no Plasma Avaliação das Proteínas do Plasma Seminal Quantificação da Concentração de Proteína Total Caracterização das Proteínas por PAGE-SDS Avaliação Testicular Avaliação Morfológica Avaliação Histológica Análise Estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO Desenvolvimento Ponderal Peso Corporal Perímetro Torácico Biometria Testicular Circunferência Escrotal Comprimento e Diâmetro Testiculares Peso Testicular Volume Testicular Densidade Testicular Concentração Periférica de Testosterona Parâmetros Seminais Volume Ejaculado Motilidade Massal Motilidade Concentração Espermática

10 Patologias Espermáticas Parâmetros Bioquímicos do Sêmen ph Seminal Proteínas Seminais Totais Perfil Eletroforético do Plasma Seminal Puberdade Histologia Testicular Biometria dos Túbulos Seminíferos Tipos Celulares Relações entre os Tipos Celulares Diâmetro dos Tipos Celulares Correlações Desenvolvimento Ponderal Desenvolvimento Reprodutivo CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS

11 LISTA DE TABELAS Página TABELA 1. Biometria testicular de carneiros da raça Santa Inês abatidos às 50 semanas de idade...63 TABELA 2. Parâmetros produtivos e reprodutivos de carneiros da raça Santa Inês à puberdade...86 TABELA 3. Número por seção transversal e por testículo e produção diária de células germinativas de carneiros da raça Santa Inês abatidos às 50 semanas de idade

12 LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1. Variação do peso vivo em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...50 FIGURA 2. Variação do perímetro torácico em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...51 FIGURA 3. Variação da circunferência escrotal em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...52 FIGURA 4. Variação do comprimento testicular em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...58 FIGURA 5. Variação do diâmetro testicular em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...58 FIGURA 6. Variação da relação comprimento/diâmetro testicular em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...59 FIGURA 7. Concentrações plasmáticas basais de testosterona em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês...64 FIGURA 8. Volume ejaculado de sêmen colhido por eletroejaculação em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês...66 FIGURA 9. Variação na motilidade massal do sêmen em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...68 FIGURA 10. Variação na motilidade do sêmen em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês

13 FIGURA 11. Variação na motilidade progressiva do sêmen em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...70 FIGURA 12. Variação no vigor espermático em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...71 FIGURA 13. Variação na concentração espermática em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...72 FIGURA 14. Variação no percentual de alterações morfológicas do sêmen em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...73 FIGURA 15. Variação no ph do sêmen em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...74 FIGURA 16. Variação na concentração protéica do sêmen em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês...76 FIGURA 17. Perfil protéico do plasma seminal determinado em SDS-PAGE de ovinos da raça Santa Inês às 33 sem. de idade. As amostras A G correspondem a diferentes animais. H corresponde aos marcadores moleculares, variando de 10 a 250 kda...80 FIGURA 18. Perfil protéico do plasma seminal determinado em SDS-PAGE de ovinos da raça Santa Inês às 33 sem. de idade. As amostras A e D correspondem a animais com menor população de células de Sertoli. B, C, F e G são amostras pertencentes àqueles animais com maior população destas células. H corresponde aos marcadores moleculares, variando de 10 a 250 kda. A seta corresponde à banda do fragmento de 74,3 kda

14 LISTA DE ABREVIAÇÕES µg - micrograma µl - microlitro ABP proteína ligadora de andrógenos ACE enzima conversora da angiotensina BSA albumina sérica bovina BSP proteína seminal bovina C concentração espermática CE circunferência escrotal CES ciclo do epitélio seminífero cm - centímetro CS célula de Sertoli CT comprimento testicular CT50 comprimento testicular às 50 semanas DHT - dihidrotestosterona DT diâmetro testicular DT50 diâmetro testicular às 50 semanas DTM diâmetro tubular médio EDTA ácido etilenodiaminotetracético FAA antígeno associado à fertilidade FSH hormônio folículo estimulante g - grama g/d gramas por dia GAG - glicosaminoglicanos GnRH hormônio liberador de gonadotrofinas GSH - glutationa HAP proteína com afinidade pela heparina HBP proteína ligadora de heparina HDL lipoproteína de alta densidade HE hematoxilina-eosina IA inseminação artificial 14

15 IGF-I fator de crescimento semelhante à insulina I kda - kilodalton kg - quilograma L comprimento tubular total LF - lactoferrina LH hormônio luteinizante ma - miliampere ml - mililitro MM motilidade massal MMP-2 metaloproteinase 2 da matriz MOP motilidade espermática progressiva MOT motilidade espermática mrna ácido ribonucléico mensageiro N contagem celular real NC contagem celular por secção transversal de túbulo seminífero ng - nanograma nm - nanômetro NS contagem de células de Sertoli por secção tubular transversal NTS população real de células de Sertoli OPN - osteopontina P peso corporal PA peso ao abate PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida PB proteína bruta PCQ peso de carcaça quente PES proteína epididimal específica PGDS prostaglandina D sintetase ph potencial hidrogeniônico Pi pontos de interesse PLA2 fosfolipase A2 PROT concentração total de proteína no sêmen PT perímetro torácico Pt total de pontos PV peso vivo 15

16 RC rendimento de carcaça quente RCD relação comprimento/diâmetro testicular RIA - radioimunoensaio rpm rotações por minuto RT-PCR transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase SDS dodecil-sulfato de sódio Sem. semanas SRD sem raça definida T - testosterona TIMP-2 inibidor tecidual da metaloproteinase 2 TS secção transversal de túbulo seminífero V - volt VI volume intersticial Vt volume do compartimento de interesse VT volume testicular VTS volume dos túbulos seminíferos 16

17 RESUMO Este estudo teve como objetivos determinar as relações entre aspectos do desenvolvimento testicular, concentrações de testosterona, produção espermática e a expressão de proteínas no plasma seminal de carneiros da raça Santa Inês durante o primeiro ano de vida, bem como parâmetros quantitativos da espermatogênese aos 12 meses de idade. Entre 8 e 48 sem. de vida, 16 animais foram mantidos em confinamento, avaliando-se semanalmente o perímetro torácico (PT), a circunferência escrotal (CE), o comprimento (CT) e diâmetro testiculares (DT) e o processo de desprendimento entre o pênis e o prepúcio. Uma vez iniciado o desprendimento peniano, os animais foram submetidos semanalmente a coletas de sêmen por eletroejaculação e, com a produção dos primeiros espermatozóides, avaliou-se a motilidade massal (MM), motilidade (MOT), motilidade progressiva (MOP), vigor, concentração espermática e a percentagem de células com defeitos. Amostras de sêmen também foram centrifugadas, separando-se o plasma seminal para determinação da concentração protéica total e do perfil protéico através de eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Às 50 sem. de idade, os animais foram abatidos (56,3 ± 3,5 kg) e amostras dos testículos, fixadas em fluido de Bouin para avaliação dos túbulos seminíferos. O peso dos animais evoluiu de 12,3 ± 0,7 kg às 8 sem. para 54,3 ± 1,6 kg às 48 sem. e a CE, de 9,8 ± 0,5 para 32,1 ± 0,4 cm no mesmo período, apresentando evolução significativa somente até as 36 sem. de idade. Às 50 sem., o peso da carcaça quente foi de 24,5 ± 3,8 kg, correspondendo a um rendimento de 48,6% em relação ao peso ao abate. As concentrações de testosterona elevaram-se gradualmente de 0,37 ± 0,07 ng/ml às 9 sem. para 1,35 ± 0,23 ng/ml às 32 sem. e atingiu um valor máximo (2,99 ± 0,23 ng/ml) às 42 sem., mas com decréscimo após esta fase. Os primeiros espermatozóides foram detectados no ejaculado, em média, às 23,05 ± 0,94 17

18 sem., mas os primeiros espermatozóides móveis, somente às 23,94 ± 0,98 sem. O desprendimento entre o pênis e o prepúcio completou-se às 25,87 ± 0,72 sem. de vida. Os valores relativos à motilidade espermática (MM, MOT, MOP e VIG) mostraram uma fase de evolução rápida entre 18 e 30 sem. de idade, embora com maior estabilização após esta idade. A concentração espermática só apresentou crescimento significativo a partir de 30 sem., atingindo cerca de 1 x 10 9 células/ml entre 42 e 44 sem. de idade. O percentual de defeitos totais foi reduzido de cerca de 88% às 15 sem. para aproximadamente 15% às 36 sem., mas com decréscimos graduais ainda após esta idade. A concentração protéica total do plasma seminal elevou-se até às 48 sem., mas os aumentos foram mais pronunciados entre 15 e 18 sem. (3,0 ± 0,0 para 14,2 ± 3,5 mg/ml) e entre 38 e 48 sem. (14,9 ± 1,2 para 19,95 ± 0,9 mg/ml). Com relação à análise eletroforética unidimensional, uma ampla gama de proteínas foi detectada (de 5,9 a 170 kda). Em todas as idades, as proteínas de massa molecular abaixo de 10 kda foram as mais abundantes e aquelas com massa molecular de 8,7 a 9,5 kda; 16 a 16,6 kda e 21 kda estavam sempre presentes entre 15 e 33 sem. As proteínas com massa molecular acima de 70 kda apresentaram grande variação entre animais e entre idades. No entanto, uma banda de 86 kda foi detectada em animais a partir de 30 sem., quando os parâmetros seminais começaram a apresentar melhoras significativas. Às 28 sem., animais com maior motilidade massal e motilidade progressiva (acima de 2,5 e 62%, respectivamente) apresentaram uma banda de 64 kda e, às 30 sem., essa proteína passou a ser expressa por um maior número de animais, coincidindo com variações mais significativas dos parâmetros seminais. Uma outra banda (74,3 kda) foi secretada no plasma seminal às 33 sem. apenas pelos animais que apresentavam maior população de células de Sertoli por testículo. Às 50 sem. de idade, o epidídimo dos carneiros pesou 29,9 ± 1,2 g e o testículo, 191,2 ± 7,4 g. Os túbulos seminíferos representaram 79,7% do volume do parênquima testicular e, para cada secção transversal de túbulo, observou-se 18

19 em média 1,4 ± 0,1 espermatogônias A1, 5,2 ± 0,6 espermatogônias B; 21,7 ± 1,8 espermatócitos em leptóteno; 44,9 ± 1,9 espermatócitos em paquíteno e 145,7 ± 7,1 espermátides arredondadas e 14,9 ± 0,4 células de Sertoli (SC). Os animais apresentaram 7,7 x 10 9 SC por testículo e 41,05 x 10 6 células de Sertoli por g de parênquima testicular. O peso vivo correlacionou-se com a CE até 42 sem. de idade (r = 0,58 a 0,86) e, entre 33 e 48 sem., com os pesos testicular (r = 0,49 a 0,63) e epididimal (r = 0,50 a 0,55). A circunferência escrotal esteve correlacionada com a idade em que se completou o desprendimento peniano (r = -0,43 a -0,93), com a idade em que surgiram os primeiros espermatozóides no ejaculado (r = -0,48 a -0,93) e com vários parâmetros seminais a partir de 26 sem. (r > 0,50). Às 50 sem., foram identificadas associações significativas entre a população de células de Sertoli (r = 0,37 a 0,45) e germinativas (r = 0,46 a 0,61) e medidas testiculares. Além disso, animais mais precoces apresentaram melhor qualidade seminal e maior circunferência escrotal, mas as correlações envolvendo as concentrações de testosterona foram expressivas somente em idades próximas à puberdade. O aumento da concentração protéica no plasma seminal pode está relacionado às diversas funções exercidas por essas proteínas na maturação epididimal e metabolismo espermático. 19

20 ABSTRACT This study was conducted to determine the relationships among testicular development, blood testosterone concentrations, sperm production and the expression of seminal plasma proteins in Santa Inês hairy sheep during the first year of life, as well as the quantitative aspects of spermatogenesis at 12 months of age. Between 8 and 48 wk, sixteen lambs were confined and submitted to weekly measurements of thoracic perimeter (TP), scrotal circumference (SC), testicular length (TL) and diameter (TD), as well as the detachment between penis and prepuce. Once this process started, the semen of the rams was weekly collected by electroejaculation and, as sperm production started, we evaluated wave (WM) and progressive motility (PM), vigor, sperm concentration and the percentage of morphologically abnormal cells. Semen samples were also centrifuged, and seminal plasma was obtained to determine its protein concentration and to evaluate the electrophoretic profile in polyacrylamide gels (SDS-PAGE). At 50 wk, rams were slaughtered (56.3 ± 3.5 kg) and testicular samples, fixed in Bouin s fluid for evaluation of seminiferous tubules. The body weight of the animals increased from 12.3 ± 0.7 kg at 8 wk to 54.3 ± 1.6 kg at 48 wk. In the same period, SC also increased from 9.8 ± 0.5 to 32.1 ± 0.4 cm. These increases were significant only until 36 wk of age. At 50 wk, carcass weight was 24.5 ± 3.8 kg, yielding 48.6% of the slaughter weight. Testosterone concentrations increased gradually from 0.37 ± 0.07 ng/ml at 9 wk to 1.35 ± 0.23 ng/ml at 32 wk, reaching a maximum value of 2.99 ± 0.23 ng/ml at 42 wk, decreasing after this phase. The first spermatozoa in ejaculate were detected, on average, at ± 0.94 wk, but the firs motile spermatozoa, only at ± 0.98 wk. Penis detachment was complete by ± 0.72 wk of life. Values related to sperm motility (WM, PM and vigor) showed rapid increases between 18 and 30 wk, tending to show some stabilization thereafter. Sperm concentration increased significantly only 20

21 after 30 wk, reaching approximately 1 x 10 9 cells/ml between 42 and 44 wk. Total sperm defects were reduced with age, from almost 88% at 15 wk to approximately 15% at 36 wk, but with slower decreases, even after that age. Total protein concentration in seminal plasma increased until 48 wk, but increases were greater between 15 and 18 wk (3.0 ± 0.0 to 14.2 ± 3.5 mg/ml) and between 38 and 48 wk (14.9 ± 1.2 to ± 0.9 mg/ml). A wide variety of proteins was detected in the electrophoretic profile (5.9 to 170 kda). At all ages, proteins bellow 10 kda were the most abundant, and those with molecular weight of 8.7 to 9.5, and 21 kda were always present between 15 and 33 wk. Proteins with molecular weight higher than 70 kda showed large variation among ages and individuals. However, a protein of 86 kda was detected in the seminal plasma after 30 wk, when seminal parameters increased steadily. At 28 wk, rams with higher wave and progressive motility showed a protein of 64 kda. After 30 wk, this protein was expressed by a higher number of animals, coinciding with and improvement in the seminal parameters and was no longer exclusive of the best samples. Another protein, of 74.3 kda, was secreted in the seminal plasma at 33 wk, only in the animals that possessed the highest population of Sertoli cells per testis. At 50 wk, the epididymis and testis weighed 29.9 ± 1.2 g and ± 7.4 g, respectively. Seminiferous tubules represented 79.7% of testicular parenchymal weight and, on average, each cross section had 1.4 ± 0.1 A1 spermatogonia, 5.2 ± 0.6 B spermatogonia, 21.7 ± 1.8 leptotene spermatocytes, 44.9 ± 1.9 pachytene spermatocytes, ± 7.1 round spermatids, and 149 ± 0.4 Sertoli cells (CS). Also, animals had 7.7 x 10 9 CS/testis and x 10 6 CS per gram of parenchymal weight. Body weight was correlated with SC until 42 wk of age (r = 0.58 to 0.86) and, between 33 and 48 wk, with testicular (r = 0.49 to 0.63) and epididymal (r = 0.50 to 0.55) weights. Scrotal circumference showed correlation with the age when penis detachment was complete (r = to -0.93), when the first sperm appeared in ejaculate (r = to -0.93) and with various seminal parameters after 26 21

22 wk (r > 0.50). At 50 wk, significant associations among Sertoli cell (r = 0.37 to 0.45) and germ cell (r = 0.46 to 0.61) populations and testicular measurements have been found. The most precocious animals showed better semen quality and higher scrotal circumference, but correlations with testosterone concentrations were expressive only close to puberty. The increase in seminal plasma protein concentration may be related to the functions of those proteins in epididymal maturation and sperm metabolism. 22

23 1. INTRODUÇÃO A população ovina brasileira está estimada em 15 milhões de cabeças (FAO, 2001) e desse total, cerca de 8 milhões localizam-se no Nordeste (IBGE, 2001). Dentre as raças ovinas criadas no Nordeste, a Santa Inês é a de maior expressão, devido à capacidade de adaptação à região, porte e potencial produtivo e tem sido utilizada como raça pura ou em cruzamentos industriais (OLIVEIRA & LIMA, 1994; SOUZA JUNIOR, 2000). Nos sistemas de produção, a eficiência reprodutiva é um dos fatores essenciais para a lucratividade (MATOS et al., 1992) e, portanto, a produção de cordeiros depende da seleção de reprodutores testados e com alta capacidade fertilizante. Desse modo, é importante a inclusão de características reprodutivas dentre os parâmetros utilizados em sua seleção (ISLAM & LAND, 1977) A circunferência escrotal destaca-se por apresentar herdabilidade moderada a alta, podendo contribuir para um expressivo melhoramento genético devido às suas correlações com a produção e qualidade do sêmen, níveis hormonais e características produtivas e reprodutivas (LÔBO et al., 1996; MARTIN et al., 1992; YARNEY et al., 1990; OTT & MEMON, 1980). Em ovinos, a circunferência escrotal apresenta correlações com a produção espermática, capacidade de serviço e desenvolvimento sexual (OTT & MEMON, 1980; YARNEY et al., 1990; SOUZA et al., 2001), comprimento, largura e diâmetro testicular (SOUZA et al., 2001; MOURA et al., 1999; SOUZA & COSTA, 1992; FREITAS et al., 1991), diâmetro dos túbulos seminíferos, peso epididimal, (OSINOWO et al., 1992) Isto se deve, em parte, ao fato de grande parte do volume testicular (aproximadamente 85%) ser 1

24 ocupada pelos túbulos seminíferos, responsáveis pela espermatogênese (WROBEL et al., 1995). Contudo, outros critérios além da circunferência escrotal devem ser levados em consideração quando da avaliação reprodutiva do carneiro. A análise da qualidade seminal é utilizada para definição de critérios mínimos aceitáveis para a seleção de reprodutores. A motilidade e morfologia espermática são as características seminais mais utilizadas para se avaliar o potencial reprodutivo do macho (GODFREY et al., 1990; CORREA et al., 1997). Entretanto, SMITH et al. (1981) não encontraram relação significativa entre os parâmetros de avaliação da qualidade seminal individualmente e a fertilidade a campo dos animais, indicando que esta deveria ser estimada pela combinação de vários parâmetros. Ainda assim, estes parâmetros apresentam capacidade limitada na avaliação do potencial reprodutivo (RODRIGUEZ- MARTINEZ & LARSSON, 1998; ZHANG et al., 1998; KJAESTAD et al., 1993). A razão da limitação destes testes para se predizer a fertilidade de um animal está relacionada ao fato de que estes exames não levam em consideração a habilidade dos espermatozóides de sofrer alterações funcionais importantes para o processo de fertilização (AMMAN & HAMMERSTEDT, 1993). Mesmo técnicas desenvolvidas mais recentemente como a análise computadorizada do sêmen e o teste de integridade acrossômica usadas para complementar à análise seminal não apresentam altas correlações com índices de fertilidade (BUDWORTH et al., 1988; JANUSKAUSKAS et al., 2000ab). Portanto, a observação de que reprodutores com circunferência escrotal e características seminais semelhantes ainda podem apresentar diferenças de 20 a 25% nos índices de fertilidade (LARSON & MILLER, 2

25 2000) tem estimulado a busca por outros marcadores de fertilidade (HENAULT & KILLIAN, 1996). O plasma seminal influencia a capacidade fecundante dos espermatozóides. Seu conteúdo abrange secreções oriundas dos testículos, epidídimos e glândulas sexuais acessórias (ampolas, glândulas vesiculares e bulbo-uretrais) e serve como meio de transporte para os espermatozóides durante a ejaculação e sobrevivência no trato genital feminino (EVANS & MAXWELL, 1987), previne a capacitação espermática prematura (YANAGIMACHI, 1994) e protege as células espermáticas contra danos peroxidativos (SCHÖNECH et al., 1996). Além do mais, o fluido seminal é o meio natural para completar a maturação espermática através de processos hormonais e enzimáticos (BARRIOS et al., 2000). Durante o trânsito epididimário e na ejaculação, os espermatozóides adquirem inúmeras proteínas do plasma seminal que podem influenciar sua fertilidade (YANAGIMACHI, 1994; KILLIAN et al., 1993; MILLER et al., 1990). A influência potencial das proteínas seminais sobre a reprodução chamou atenção devido a inúmeros estudos mostrando que sua expressão está relacionada significativamente às taxas de não-retorno ao estro, classificação andrológica (FOUCHÉCOURT et al., 2002; BRAUNDMEIER & MILLER, 2001; PARENT et al., 1999; BRANDON et al., 1999; CANCEL et al., 1998, 1999; GERENA et al., 1998; KILLIAN et al., 1993), capacidade dos espermatozóides fertilizarem oócitos in vitro (HENAULT et al., 1995; HENAULT & KILLIAN, 1996) e à motilidade espermática (AMMAN et al., 1987; DIAMANDIS et al., 1999). Contudo, a deficiência de índices reprodutivos confiáveis em rebanhos Santa Inês dificulta a adoção desses parâmetros como critério para a seleção 3

26 de reprodutores. De fato, esta tem se dado, principalmente, baseada na avaliação de padrões raciais de pelagem, tipo e conformação e, em alguns casos, dados de ganho de peso. Dessa forma, um estudo detalhado do desenvolvimento sexual e proteínas seminais destes reprodutores pode definir critérios para seleção daqueles animais mais precoces e com melhor fertilidade. Dado que parâmetros como a circunferência escrotal apresenta alta herdabilidade e está relacionada com a fertilidade e idade à puberdade das fêmeas, a seleção de melhores reprodutores também teria um efeito positivo sobre a fertilidade do rebanho como um todo. Nesse contexto, o conhecimento dos parâmetros de desenvolvimento sexual e do perfil protéico do plasma seminal em fases reprodutivas críticas, bem como suas associações, poderiam contribuir para sua utilização como marcadores moleculares para fertilidade, auxiliando na seleção de reprodutores mais férteis na raça Santa Inês. Portanto, os objetivos desse trabalho foram: Determinar as relações entre a biometria testicular, puberdade, concentrações basais de testosterona, produção espermática e aspectos quantitativos da espermatogênese em carneiros da raça Santa Inês durante o primeiro ano de vida; Determinar, através de eletroforese em SDS-PAGE, a massa molecular das proteínas do plasma seminal, verificando a relação entre sua expressão e características reprodutivas. 4

27 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Desenvolvimento Testicular em Ovinos Estrutura Testicular As principais funções do testículo estão relacionadas à secreção hormonal e espermatogênese. Esta última é um processo contínuo, que resulta na produção diária de espermatozóides a partir das células-tronco da linhagem germinativa, denominadas espermatogônias (CASTRO et al., 1997). Os testículos passam da cavidade abdominal para a bolsa escrotal, onde se mantêm a uma temperatura de 2 a 6 C abaixo da corporal, por volta dos 80 dias de prenhez nos ovinos (GIER & MARION, 1970; WAITES, 1970; KASTELIC et al., 1996) e pesam cerca de 200 a 300 gramas em animais adultos (0,7% do peso corporal), sendo cobertos por uma cápsula fibrosa chamada tunica albuginia, que contém as artérias e veias testiculares (AMMAN, 1970; EVANS & MAXWELL, 1987). Em seu interior localiza-se a maior parte da massa testicular, composta por seu parênquima. O parênquima testicular, do ponto de vista morfofuncional, divide-se em dois compartimentos distintos. O primeiro deles é composto pelos túbulos seminíferos, que ocupam de 85 a 86% do volume testicular ovino (QUEIROZ & CARDOSO, 1989; WROBEL et al., 1995), os quais são estruturas enoveladas contendo em seu interior o epitélio germinativo (SETCHELL, 1978). O outro compartimento consiste no espaço intertubular, composto por tecido conjuntivo, onde se localizam os vasos sanguíneos, linfáticos, nervos e as células de Leydig (SETCHELL, 1991). 5

28 O crescimento testicular em carneiros segue uma curva sigmóide, com duas fases características (SALGUEIRO & NUNES, 1999; SOUZA et al., 2001). Nas fases pré-púbere e púbere, a circunferência escrotal aumenta rapidamente de tamanho (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1990; MOURA et al., 1999; SANFORD et al., 2000), paralelamente ao peso do animal (NOTTER et al., 1985; SOUZA et al., 2000), devido principalmente ao rápido desenvolvimento do parênquima testicular (FRANÇA & RUSSELL, 1998). Por outro lado, a fase de pós-puberdade é caracterizada por um lento crescimento testicular, tendendo a estabilização (SOUZA et al. 2000). O desenvolvimento e função do epitélio germinativo estão ligados ao desenvolvimento da parte somática do testículo (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1987), estando a taxa de crescimento testicular relacionada ao momento em que as células de Leydig tornam-se funcionais. De fato, as células somáticas são essenciais para a função normal do sistema reprodutivo (RUSSELL et al., 1994). Em carneiros, o volume total de tecido intersticial está correlacionado positivamente com a produção de células germinativas seja por testículo ou por célula de Sertoli (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1993). Já a população das células de Sertoli está relacionada ao tamanho adulto dos testículos e à produção espermática (FRANÇA & RUSSELL, 1998). Os cordeiros nascem com cerca de 250 x 10 6 células de Sertoli indiferenciadas ou de pré-sertoli por testículo (KILGOUR et al., 1998). Entre o nascimento e a puberdade, este número aumenta cerca de 500%, e pode ser influenciado por fatores tais como a raça do animal, estação de nascimento, nutrição e ambiente hormonal (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1987). 6

29 Entre duas e oito semanas de vida, o volume testicular de cordeiros é de cerca de 1,5cm³, ocupado em cerca de 50% pelos túbulos seminíferos, os quais apresentam um diâmetro médio de 50µm. O epitélio seminífero é composto por células de Sertoli indiferenciadas e pré-espermatogônias I, localizadas no centro dos túbulos seminíferos. Entre 8 e 13 semanas, o volume testicular atinge 5cm³, com os túbulos ocupando ainda 50% do volume, mas o diâmetro tubular mede cerca de 60µm (STEGER & WROBEL, 1996). As células de Sertoli indiferenciadas multiplicam-se, num processo mediado pelo FSH (KILGOUR et al., 1998) e formam uma camada contínua ao redor dos túbulos. As pré-espermatogônias I migram para a periferia dos túbulos, e originam-se delas as primeiras pré-espermatogônias II (STEGER & WROBEL, 1996). No período compreendido entre 13 e 18 semanas de idade, o volume testicular ultrapassa 15cm³, com cerca de 60% ocupados pelos túbulos seminíferos. O diâmetro tubular evolui para 80µm. As células de suporte já apresentam características típicas das células de Sertoli, e formam as primeiras junções entre si, ainda incompletas (STEGER & WROBEL, 1996). Por ocasião da puberdade, com aproximadamente 18 a 24 semanas, a circunferência escrotal atinge cerca de 18 cm (SOUZA et al., 2001). O volume testicular supera os 25cm³ e o diâmetro tubular ultrapassa 100µm, ocupando cerca de 63% do volume da gônada. As células de Sertoli param de multiplicar-se e se diferenciam (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1987) e suas junções intercelulares separam os compartimentos basal e adluminal. A espermatogênese inicia-se nesta fase, com a formação das primeiras espermatogônias A (STEGER & WROBEL, 1996). 7

30 A fase de pós-puberdade é caracterizada por um crescimento mais lento da circunferência escrotal, tendendo a estabilização (YARNEY & SANFORD, 1993; SOUZA et al., 2001). Esse crescimento lento se deve ao fato de que mesmo após a maturidade sexual, os túbulos seminíferos ainda apresentam pequenos crescimentos em seu comprimento (FRANÇA, 1987). O volume testicular bem como o diâmetro tubular acompanha esse ritmo. Contudo, os túbulos já ocupam seu volume adulto, cerca de 84 a 86% do testículo (WROBEL et al., 1995; STEGER & WROBEL, 1996). As células de Sertoli passam a ligar-se mutuamente, formando a barreira hemato-testicular e participando dos eventos cíclicos do epitélio seminífero (RUSSELL et al., 1990; STEGER & WROBEL, 1996). Correlação positiva e significativa foi descrita entre o número total de células de Sertoli e de espermatogônias A1 por testículo (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1987), confirmando que a eficiência da produção espermatogênica é estabelecida no início da espermatogênese (JOHNSON et al., 1994) Cinética e Quantificação da Espermatogênese Estudos morfológicos nos permitem compreender os fenômenos fisiológicos a partir da associação entre forma e função. Apesar desta associação ser mais nítida no âmbito macroscópico (BIELLI, 1999), como por exemplo, a circunferência escrotal como indicadora da atividade testicular, em nível histológico isto é menos evidente. A cinética espermatogênica estuda o conjunto de processos citológicos e histológicos que ocorrem no interior dos túbulos seminíferos (SANTOS, 1999). O conhecimento desta 8

31 cinética se mostra de grande importância para a caracterização da atividade testicular de uma dada espécie. A espermatogênese é um processo altamente organizado e precisamente sincronizado, através do qual espermatogônias diplóides dividem-se por mitose para manter sua população e produzem ciclicamente espermatócitos, os quais sofrem meiose e produzem espermatozóides haplóides (JOHNSON et al., 1991; SHARPE, 1994; JOHNSON et al., 2000), o qual dura 49 dias em ovinos, iniciando-se após a puberdade (COUROT et al., 1970). A espermatogênese pode ser funcionalmente dividida em três fases: a fase proliferativa, a meiose e a espermiogênese. A fase proliferativa, também denominada espermatocitogênese, é aquela na qual as espermatogônias-tronco sofrem divisões mitóticas, resultando em outra espermatogônia-tronco visando repor sua população, e dão origem à outra população de espermatogônias A, as quais se diferenciam em espermatogônias intermediárias e B, e originam espermatócitos primários tetraplóides em préleptoteno (COURTENS, 1983; RUSSELL et al., 1990; JOHNSON et al., 2000). Estes espermatócitos se proliferam e entram em divisão meiótica, permitindo a troca de genes entre cromossomos homólogos, gerando, sucessivamente espermatócitos secundários diplóides e espermátides arredondadas haplóides. Na fase espermiogênica, as espermátides arredondadas se diferenciam em espermátides alongadas, envolvendo achatamento nuclear, condensação da cromatina e paralisação da transcrição, além do desenvolvimento do flagelo e formação do acrossoma a partir do complexo de Golgi, sendo liberadas no lúmen tubular na forma de 9

32 espermatozóides (espermiação) (COURTENS, 1983; RUSSELL et al., 1990; JOHNSON et al., 2000). Durante a formação do acrossoma, o Complexo de Golgi, ao mesmo tempo rico em glicosil-transferases (LETTS et al., 1974) e contínuo com o retículo endoplasmático (HERMO et al., 1979) secreta numerosas vesículas contendo grânulos de natureza glicoprotéica (SUZI et al., 1971), onde se pode detectar a presença de galactose e fucose. As microvesículas se fundem para formar uma vesícula pró-acrossômica limitada por uma membrana assimétrica (MOLLENHAUER et al., 1976) contendo um grânulo acrossômico denso (GURAYA, 1971) composto por enzimas, tais como acrosima, hialuronidase, fosfatases, β-galactosidase e ativador do plasminogênio (CHANG et al., 1974; KANNAN, 1974; BROWN, 1975; TAITZOGLOU et al., 2001). No carneiro, as espermatogônias se dividem a cada 10,4 dias, e poderiam gerar, oito dias depois, em teoria 64 espermatócitos I, cuja prófase dura 14 dias. Estes entram em meiose, a qual dura cerca de 24 horas, originando potencialmente 256 espermátides que gerarão, após 14 dias, igual número de espermatozóides (COURTENS, 1983). Entretanto, o rendimento máximo da espermatogênese depende da população de células de Sertoli, a qual é definida entre 40 e 80 dias de idade, antes da puberdade (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1987; SHARPE, 1994). Uma vez cessada a replicação das células de Sertoli, a produção espermática depende do número total de espermatogônias e do número de gerações entre a primeira geração das espermatogônias e a formação dos espermatócitos primários (COUROT et al., 1970). No carneiro, reconhecem-se seis gerações de espermatogônias sendo três do tipo A, uma intermediária e duas do tipo B. Entretanto, a perda de células germinativas pode chegar à 10

33 cerca de 50% em relação ao potencial de produção de espermatozóides no carneiro (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1976; JOHNSON et al., 1991), ocorrendo degeneração celular, principalmente por apoptose, principalmente das espermatogônias e espermatócitos (BILLING et al., 1996; SANTOS, 1999; YOUNG et al., 2001). Estas perdas relacionam-se principalmente a flutuações hormonais decorrentes de alterações fotoperiódicas (LINCOLN, 1989; BILLING et al., 1996; YOUNG & NELSON, 2001), sendo as mudanças na secreção de FSH as mais importantes (FURUTA et al., 1994) ou de restrições alimentares (NELSON et al., 1992). Além disso, a morte celular por apoptose é o principal mecanismo de eliminação de células defeituosas no processo espermatogênico (BILLING et al., 1996). Ao avaliar-se uma seção de túbulos seminíferos, pode-se observar que as células germinativas estão agrupadas em camadas, e que determinados tipos celulares estão associados com outros, associações essas que aparecem ciclicamente ao longo dos túbulos (RUSSELL et al., 1990). Essas associações cíclicas de células germinativas morfologicamente integradas com as demais são denominadas estágios do ciclo do epitélio seminífero (CES), que é definido como uma série de associações celulares ordenadas que ocorrem num dado segmento tubular (RUSSELL et al., 1990; SANTOS, 1999; JOHNSON et al., 2000). Sendo um fenômeno temporal, a duração do CES pode ser estimada em dias e mantém-se constante para uma dada espécie (SANTOS, 1999). No carneiro, estudos têm mostrado que o CES dura cerca de 10,4 a 10,6 dias em animais lanados (ORTAVANT, 1956; HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1964) e 10,5 dias em animais deslanados (CARDOSO & QUEIROZ, 1988). 11

34 ORTAVANT et al. (1977) dividiram o CES com base na meiose em fase pré-meiótica, compreendendo os eventos ocorridos entre a espermiação e a metáfase da primeira meiose, fase meiótica e fase pós-meiótica, incluindo os eventos desde o final da meiose até a espermiação. A fase pré-meiótica, ocupa cerca de 50% do CES em carneiros, enquanto a fase meiótica dura apenas de 7 a 8% (ORTAVANT, 1956; CARDOSO & QUEIROZ, 1988). Entretanto, a maneira mais usual de classificação do CES baseia-se na avaliação morfológica das espermátides, especialmente seu núcleo (FRANÇA & RUSSELL, 1998) juntamente com eventos meióticos, e resulta na divisão do CES em oito estágios, senda a espermiação a divisora de dois ciclos (WROBEL et al., 1995; JOHNSON et al., 2000). No estágio 1, duas gerações de espermatócitos estão presentes. Aqueles em pré-leptóteno são encontrados principalmente na região basal, e também na região intermediária. Estas células apresentam inúmeras pontes citoplasmáticas entre si, perdendo contato com a lâmina basal. Ultraestruturalmente pode-se observar inúmeras mitocôndrias e ribossomos livres. O retículo endoplasmático rugoso é incomum, e composto de finos túbulos, enquanto o complexo de Golgi consiste de lamelas e sáculos localizados na região perinuclear. A região nuclear é caracterizada por heterocromatina de padrão reticular, com um pequeno nucléolo. Elas apresentam um diâmetro nuclear de 7,68 µm e volume celular de 622 µm³, constituindo cerca de 5% do epitélio tubular (WROBEL et al., 1995). Espermatócitos em paquíteno, maiores, com 1.943,43 µm³, cujo núcleo mede 10,70µm. Eles estão localizados próximo ao lúmen e seu desenvolvimento se dá durante a maior parte da prófase meiótica. Os volumes citoplasmáticos e nucleares crescem continuamente. A cromatina distribuída 12

35 pelo núcleo, com pequenas quantidades de heterocromatina localizadas na membrana nuclear interna, juntamente com o nucléolo. O retículo endoplasmático rugoso forma cisternas achatadas na periferia celular, enquanto o retículo liso ocupa a maior parte do citoplasma restante, na forma de túbulos interconectados. As mitocôndrias apresentam cristas aumentadas e se agrupam em uma matriz intermitocondrial densa, enquanto o complexo de Golgi também se desenvolve (WROBEL et al., 1995). Por fim, uma geração de espermátides na fase cap está envolvida nos processos laterais das células de Sertoli. Estas células mostram-se com núcleo reduzido comparadas àquelas na fase de Golgi, com redução no número de nucléolos. No fim dessa fase, o núcleo está periférico, com um grande complexo de Golgi no pólo celular. As cisternas do retículo endoplasmático liso se tornam vesiculares, com um conteúdo nevoado. Este estágio ocupa cerca de 18% do CES, e o epitélio do túbulo mede cerca de 79µm (WROBEL et al., 1995). No estágio 2, o epitélio apresenta cerca de 17,4µm de espessura. Espermatócitos em leptóteno, com o dobro do volume celular (1.303 µm³) e nuclear (9,72µm) daqueles em pré-leptóteno, apresentam heterocromatina concentrada em uma das metades do núcleo, e mitocôndrias ovóides isoladas, com pequenos aumentos no retículo endoplasmático rugoso e complexo de Golgi. Estas células atravessam a barreira hemato-testicular, e a primeira geração de espermatócitos atinge o paquíteno. As espermátides entram na fase acrossômica, e estão situadas nos processos apicais das células de Sertoli, com seus acrossomas localizados basalmente, iniciando o alongamento nuclear. Estas células continuam o processo de polarização iniciado na fase cap. A manchete, uma estrutura 13

36 temporária que está relacionada ao intercâmbio de proteínas nucleares durante as alterações nucleares, aparece no início dessa fase, e desaparece no final. As mitocôndrias isoladas tendem a se agrupar, iniciando-se ainda os processos autolíticos no citoplasma, com uma redução do volume citoplasmático. Organelas, como o retículo endoplasmático e o complexo de Golgi, perdem seu formato normal e se desintegram, havendo invasão de extensões do citoplasma da células de Sertoli no citoplasma das espermátides no final dessa fase (COURTENS & LOIR, 1981; WROBEL, 1995). No terceiro estágio, aqueles leptótenos do estágio anterior atingem o zigóteno, atravessando a barreira hemato-testicular e entrando na região adluminal. Seu aspecto é muito parecido com o dos leptótenos, entretanto, complexos sinaptonemais são observados, e persistem até o início do diplóteno. O retículo endoplasmático rugoso desenvolve-se e suas cisternas penetram entre as mitocôndrias agrupadas, e podem ocorrer corpos lisossomais. Estas células medem cerca de 10,03µm e 1.360µm³, respectivamente para o diâmetro nuclear e volume celular. Já os paquítenos entram em diplóteno, as maiores células germinativas, atingindo 2.994µm³ de volume celular. A distribuição de organelas e de cromatina são idênticas àquela dos paquítenos, com um diâmetro nuclear de 11,39µm. As mitocôndrias começam a isolar-se, liberando sua densa matriz no citoplasma (WROBEL et al., 1995). O estágio quatro compreende a fase de meiose, indo da metáfase da primeira divisão meiótica até o final da segunda divisão. As células mais comuns são espermatócitos secundários e espermátides arredondadas recémformadas. Os espermatócitos secundários têm vida breve e ocorrem apenas nesse estágio. Seu volume celular (1.369,68µm³) e nuclear (342µm³) são 14

37 aproximadamente, a metade daquele dos diplótenos. A membrana nuclear apresenta ligeiras protuberâncias características e o retículo endoplasmático é abundante. As mitocôndrias apresentam cristas dilatadas distribuídas ao acaso. Neste estágio, encontram-se ainda espermatócitos em final de zigóteno ou início do paquíteno e espermátides alongadas (WROBEL et al., 1995). Uma vez que os estágios 5, 6 e 7 apresentam curta duração e não diferem significativamente entre si, foram agrupados em um só. Este estágio é caracterizado por uma única geração de espermatócitos e duas gerações de espermátides. As espermátides recém-formadas estão na fase de Golgi, apresentando dimensões semelhantes às dos espermatócitos secundário, com núcleo central e esférico. A cromatina apresenta-se granulada e com até três nucléolos. O retículo endoplasmático liso predomina, formando túbulos curtos, enquanto as mitocôndrias distribuem-se ao acaso. Já as espermátides mais velhas estão em fase de maturação. Este fenômeno inicia-se no estágio 4 e vai até a espermiação. Ele envolve alterações, tais como o desenvolvimento da peça intermediária, com mitocôndrias organizadas em 40 a 45 voltas em espiral. O citoplasma é reduzido por um processo de autólise, acompanhado por intensas alterações no núcleo (LOIR & COURTENS, 1979; WROBEL et al., 1995). Durante o estágio 8, ocorre a espermiação das espermátides maduras, que marca o limite entre dois ciclos do epitélio seminífero. A geração de espermátides jovens do estágio anterior entra na fase de cap, e os espermatócitos encontram-se em paquíteno, e reinicia-se o ciclo no estágio 1 (WROBEL et al., 1995). 15

38 2.2. Proteínas do Plasma Seminal. A disponibilidade de reprodutores testados, com elevado potencial reprodutivo é essencial para garantir a eficiência reprodutiva e a produção de crias. Nesse contexto, a busca por indicadores da fertilidade masculina tem sido o foco de vários estudos conduzidos nos últimos anos. A avaliação da motilidade e concentração espermática são freqüentemente utilizadas para avaliar a qualidade seminal, mas fornece informações limitadas sobre sua fertilidade em potencial (ELLIOT, 1978; GRAHAM et al., 1980; CORREA et al., 1997; RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ & LARSSON, 1998; ZHANG et al., 1998; BRAHMKSHTRI et al., 1999). Outros critérios, como a análise computadorizada do sêmen e a integridade acrossômica ajudam a estimar a qualidade seminal e têm sido relacionadas às taxas de não retorno, mas as correlações são baixas (BUDWORTH et al., 1988; KJAESTAD et al., 1993; JANUSKAUSKAS et al., 2000ab). De fato, a maioria dos atuais procedimentos de análise seminal não consegue explicar toda a fertilidade em potencial dos reprodutores, provavelmente porque eles não levam em consideração importantes etapas no processo de fertilização, como a capacitação espermática e a reação acrossômica (AMMAN & HAMMERSTEDT, 1993). Reprodutores pertencentes a centrais de inseminação, que apresentam parâmetros seminais equivalentes, ainda apresentam diferenças de 20 a 25% nas taxas de não retorno ao estro, os quais não podem ser explicados pelas análises seminais de rotina (LARSSON & MILLER, 2000). Portanto, a existência de reprodutores sub-férteis que apresentam quadro seminal normal é uma observação importante e tem estimulado a busca por outros marcadores para a fertilidade. 16

39 O plasma seminal é fluido composto por secreções oriundas dos testículos, epidídimos e glândulas sexuais acessórias (ampolas, glândulas vesiculares e bulbo-uretrais), que influenciam a capacidade de fertilização dos espermatozóides. Suas funções incluem o transporte dos espermatozóides durante a ejaculação, ativação de espermatozóides imóveis, manutenção de sua viabilidade no sistema reprodutivo feminino (EVANS & MAXWELL, 1987), prevenção de capacitação prematura (YANAGIMACHI, 1994) e proteção das células espermáticas contra a peroxidação lipídica (SCHÖNECH et al., 1996). Além disso, o fluido seminal é o fluido natural para a maturação espermática, que ocorre ao longo do trânsito epididimal, através de mecanismos enzimáticos e hormonais (MILLER et al., 1990; YANAGIMACHI, 1994; LASSERRE et al., 2001). A potencial influência das proteínas seminais sobre a fertilidade veio à tona devido a estudos mostrando que sua expressão está relacionada, significativamente, às taxas de não retorno ao estro (KILLIAN et al., 1993; BRANDON et al., 1999; PARENT et al., 1999; BRAUNDMEIER & MILLER, 2001), taxas de penetração in vitro de oócitos (HENAULT et al., 1995; HENAULT & KILLIAN, 1996) e mesmo à motilidade espermática (AMMAN et al., 1987; DIAMANDIS et al., 1999). Contudo, as proteínas seminais também podem apresentar efeitos adversos sobre a qualidade seminal. A presença de proteínas de baixa massa molecular no sêmen tem sido apontada como a causa para a baixa fertilidade, em bovinos da raça Nelore (UNANIAN et al., 2001). Do mesmo modo, altas concentrações de plasma seminal em diluidores têm se mostrado deletérias para os espermatozóides sujeitos ao resfriamento e congelamento (PICKETT et al., 1975; MARTINUS et al., 1991). Além disso, alguns componentes do 17

40 plasma seminal podem interferir com a capacitação espermática, reação acrossômica ou enzimas acrossômicas antes da fertilização (BRANDON et al., 1999). Estas proteínas deletérias podem incluir, entre outras, fatores decapacitantes (ENG & OLIPHANT, 1978), fator anti-fertilidade humano (AUDHYA et al., 1987) e seminalplasmina bovina (BHARGAVA, 1986). O estudo dessas proteínas pode contribuir para uma melhor compreensão dos processos fisiológicos ligados à fertilidade e permitir seu uso como marcadores moleculares, bem como para auxiliar a elaboração de diluidores seminais mais eficientes Proteínas Ligadoras de Fosfolipídeos A capacitação é um processo complexo que ocorre in vivo, após o espermatozóide estar presente no trato genital feminino (MARTINEZ & MORROS, 1996) e que envolve alterações bioquímicas e estruturais em sua membrana, que incluem a perda de componentes adsorvidos, alterações em sua composição lipídica e maior permeabilidade a íons (DE LAMIRANDE et al., 1997; CROSS, 1998; VISCONTI & KOPF, 1998). Estas alterações permitem a interação espermática com o oócito e a reação acrossômica (THÉRIEN et al., 2001). A perda de colesterol pela membrana espermática e uma redução na proporção colesterol:fosfolipídeos estão entre as principais etapas da capacitação (EHRENWALD et al., 1988; THÉRIEN et al., 1998). O plasma seminal contém proteínas ligadoras de fosfolipídeos, denominadas BSPs, que são secretadas pelas vesículas seminais e são importantes para a capacitação espermática (DESNOYERS et al., 1994). Elas são denominadas BSP A1/A2, 18

41 BSP A3 e BSP 30-kDa, com massas moleculares de 15, 16,5 e kda, respectivamente. Estas proteínas ligam-se a fosfolipídeos contendo colina presentes na membrana espermática, especialmente a fosfatidilcolina, e estimulam a liberação de colesterol e fosfolipídeos por um curto período após a ejaculação, induzindo reorganização da membrana e aparecimento de novos receptores para glicosaminoglicanos semelhantes à heparina (GAGs) ou HDL na membrana espermática (THÉRIEN et al., 1998; 1999; MOREAU & MANJUNATH, 1999; MANJUNATH & THÉRIEN, 2002). No trato genital feminino, os espermatozóides são capacitados por duas vias. Inicialmente, a ligação das BSPs à membrana espermática aumenta o número de sítios de ligação para heparina, e os espermatozóides passam a reagir com os GAGs (MILLER et al., 1990). Em seguida, os espermatozóides interagem com a HDL, estimulando uma segunda liberação de colesterol, alterando a proporção entre este e os fosfolipídeos. Esta liberação desestabiliza a membrana espermática e inicia vias de transdução que regulam a expressão de receptores para proteínas da zona pelúcida na superfície espermática, habilitando a reação acrossômica (BENOFF et al., 1993; THÉRIEN et al., 1998). Os processos mediados pelas BSPs que levam à capacitação espermática sugerem que diferenças detectadas em suas concentrações no plasma seminal podem influenciar a fertilidade. Entretanto, correlações entre índices de fertilidade e concentração de BSPs ainda não foram estabelecidas (NAUC & MANJUNATH, 2000). 19

42 Proteínas Ligadoras de Heparina A heparina é um açúcar pertencente ao grupo dos GAGs, secretado no trato genital feminino (LEE et al., 1985), sendo um dos mais potentes indutores da capacitação espermática em bovinos (HANDROW et al., 1982; MILLER & HUNTER, 1986), ligando-se aos espermatozóides por meio de proteínas (NASS et al., 1990). Proteínas ligadoras de heparina (HBPs) são secretadas pela próstata, glândulas bulbo-uretrais e vesiculares no plasma seminal, sendo estas últimas a principal fonte (MILLER et al., 1990). Estas proteínas não estão presentes em espermatozóides epididimais (McCAULEY et al., 1996) e sua expressão é dependente de andrógenos, uma vez que animais castrados reduzem significativamente a secreção de HBPs, a qual é restaurada aos níveis iniciais após reposição de testosterona (NASS et al., 1990). Utilizando ensaios de ligação a heparina radioativa, MARKS & AX (1985) observaram que espermatozóides oriundos de touros de alta fertilidade possuem maior afinidade pela heparina que aqueles originados de touros de baixa fertilidade, apesar dos dois grupos apresentarem o mesmo número de sítios de ligação para heparina. Portanto, a afinidade, e não a presença da HBP na membrana espermática, está relacionada ao potencial de capacitação de reação acrossômica dos espermatozóides. Nesse contexto, cinco famílias de HBPs com diferentes afinidades pela heparina foram identificadas (MILLER et al., 1990). Entre elas, o complexo HBP-B5 é o que apresenta a maior afinidade (BELLIN et al., 1994), sendo formado por múltiplas proteínas, com massas moleculares de 31, 24 e kda (MILLER et al., 1990). Em outro estudo, touros com circunferência escrotal e características seminais equivalentes foram agrupados de acordo com a presença ou ausência 20

43 da HBP-B5 na membrana espermática ou no plasma seminal. Os animais foram mantidos com as fêmeas por dois meses, e a taxa de prenhez foi determinada 60 dias após o fim da estação de cobertura. Touros que apresentavam o complexo HBP-B5 ligado à membrana espermática, contudo não detectável no plasma seminal, apresentaram uma fertilidade 17% maior que aqueles com outros perfis de HBP-B5 (BELLIN et al., 1994). Possivelmente, toda HBP-B5 anteriormente presente no plasma seminal ligouse com maior afinidade aos espermatozóides induzindo capacitação mais eficiente. De fato, quando machos de parâmetros andrológicos e seminais semelhantes são agrupados com base no conteúdo de HBP na membrana espermática, pode-se detectar diferenças de até 40% nas taxas de prenhez (BELLIN et al., 1996). O antígeno associado à fertilidade (FAA) é um dos componentes do complexo HBP-B5, com massa molecular de 31 kda, é secretado pelas glândulas vesiculares e próstata (BELLIN et al., 1998; McCAULEY et al., 1999). Pesquisas mostraram que o FAA associado à membrana espermática pode funcionar como marcador para fertilidade masculina, mesmo em machos com idêntica capacidade de serviço, medida pelo número de ejaculações aparentes, em touros expostos a novilhas em estro (BELLIN et al., 1998). Em um estudo comparando taxas de prenhez ao primeiro serviço, fêmeas inseminadas com sêmen contendo FAA ligada aos espermatozóides apresentaram taxa de prenhez 15,9% maior que aquelas inseminadas com espermatozóides sem FAA (SPROTT et al., 2000). Independentemente da idade ou raça, touros FAA positivos foram 9% mais férteis que touros FAA negativos (BELLIN et al., 1998). Portanto, a determinação dos perfis de FAA 21

44 pode ser utilizada para identificar animais sub-férteis, não detectados durante o exame andrológico ou testes de capacidade de serviço. A concentração de outro componente do complexo HBP-B5, com massa molecular de 24 kda (HBP-24), também está relacionado à fertilidade. Dados obtidos da mobilidade protéica em SDS-PAGE e homologia da seqüência de aminoácidos permitiu a identificação desta proteína como o inibidor tecidual de metaloproteinases 2 (TIMP-2) (CALVETE et al., 1996; McCAULEY et al., 2001). Touros de maior fertilidade, definida como sendo o número de vacas prenhes 60 dias após o início da estação de cobertura, puderam ser discriminados daqueles de baixa fertilidade baseando-se na presença de HBP-24 ligada aos espermatozóides (BELLIN et al., 1996; 1998), mas as vias envolvidas na regulação da reprodução por essa via ainda não estão esclarecidas (McCAULEY et al., 2001). Contudo, MÉTAYER et al. (2002) relataram, recentemente, que o TIMP-2 é sintetizado pelo testículo e está presente no fluido da cabeça do epidídimo do carneiro. Além do mais, TIMP-2 parece ativar o precursor da matrix metaloproteinase 2 (MMP2), que é uma das mais abundantes metalogelatinases presentes no epidídimo do carneiro. A MMP2 é sintetizada no testículo, principalmente pelas células de Sertoli, e é provável que atue no remodelamento da matriz extracelular durante o desenvolvimento gonadal (ROBINSON et al., 2001). O TIMP-2 inibe a atividade da MMP2 (NAGASE & WOESSNER, 1999), mas o significado deste fato em relação ao desenvolvimento testicular permanece indeterminado. Em bodes, proteínas com afinidade pela heparina (HAP) compõem 18 a 19% da quantidade total de proteína presente no plasma seminal e sua expressão está relacionada à atividade sexual. Estudos associando SDS-PAGE 22

45 e cromatografia de afinidade mostraram que entre as HAP, uma banda de 178 kda está presente apenas na estação sexual, enquanto uma de 119 kda é a mais abundante na estação não reprodutiva (LA FALCI et al., 2002). A HAP de 178 kda causou leve redução tempo e dose dependente na motilidade espermática após 60 minutos de incubação, sem danos acrossômicos. Por outro lado, a incubação de espermatozóides com a HAP da estação não sexual causou perda total da motilidade após 5 minutos, com importante perda acrossômica Prostaglandina D Sintetase Duas proteínas do plasma seminal foram detectadas em maior quantidade no sêmen de touros de alta fertilidade comparados com aqueles de média e baixa fertilidade, utilizados em centrais de inseminação artificial (IA) (KILLIAN et al., 1993). Neste estudo, os autores encontraram correlação significativa (r = 0,89) entre a concentração dessas proteínas no plasma seminal e a fertilidade de machos utilizados em pelo menos inseminações com sêmen congelado. Estas proteínas foram identificadas através de eletroforese bidimensional, Western Blotting e sequenciamento como sendo prostaglandina D sintetase GSH-independente (PGDS) (GERENA et al., 1998) e osteopontina (OPN) (CANCEL et al., 1997). Em um estudo conduzido em cavalos, BRANDON et al. (1999) também encontraram correlações entre a densidade protéica do plasma seminal e índices de fertilidade em quatro estações de cobertura sucessivas. Uma dessas proteínas demonstrou homologia antigênica com a OPN. A prostaglandina D sintetase (26 kda) catalisa a isomerização da prostaglandina H 2 a prostaglandina D 2 (URADE et al., 1985) e existe em duas 23

46 formas distintas (URADE & HAYAISHI, 2000a), uma necessitando de glutationa, e a outra independente desta (URADE et al., 1987). Esta última é membro da superfamília das lipocalinas, um grupo de proteínas que se liga e transporta pequenas moléculas lipofílicas, como o retinol, progesterona e feromônios do plasma ao trato reprodutivo, e através da barreira hematotesticular (PERVAIZ & BREW, 1987). Recentemente, FOUCHÉCOURT et al. (2002) identificaram esta proteína no fluido epididimal do carneiro, com cerca de 191 aminoácidos, com massa molecular de 21,1 kda. Estudos têm sugerido que a PGDS teria dupla função, funcionando como enzima produtora de prostaglandina D 2 intracelular, e como lipocalina após sua secreção no espaço extracelular e diversos fluidos corporais (TANAKA et al., 1997; URADE & HAYAISHI, 2000b). No trato reprodutivo masculino, a PGDS está presente nas células de Sertoli e Leydig, células epiteliais do epidídimo e ampola de vários mamíferos, incluindo carneiro, touro e cavalo (FOUCHÉCOURT et al., 1999; RODRIGUEZ et al., 2000a; URADE & HAYAISHI, 2000b). Em touros, a expressão da PGDS foi detectada apenas em túbulos contendo espermátides alongadas durante os últimos estágios da espermatogênese, sugerindo que sua expressão varia conforme o estágio do ciclo espermatogênico (GERENA et al., 2000; RODRÍGUEZ et al., 2000a). Em vista de sua localização no testículo e sua afinidade por metabólitos da vitamina A (VAN PELT & DE ROOIJ, 1990; TANAKA et al., 1997), a PGDS deve ter um papel crucial na espermatogênese. Em ratos, sua expressão no testículo mostra um aumento dependente da idade, independente do peso testicular. Utilizando técnicas de RT-PCR, SAMY et al. (2000) observaram que, no testículo adulto, há um aumento de cerca de 40 vezes na 24

47 concentração de mrna para PGDS comparado com testículos imaturos. Observaram ainda que seu surgimento estava relacionado à produção dos primeiros espermatozóides maduros. As células de Sertoli expressaram cerca de três vezes mais PGDS que as células germinativas, relacionando-se com a formação de junções especializadas entre estas células e o estabelecimento da barreira hematotesticular, no início da puberdade. Apesar das células de Sertoli serem alvos de hormônios hipofisários e esteróides, FSH, dihidrotestosterona e testosterona não mostraram efeito aparente na expressão de PGDS por essas células. Os retinóides, contudo, induziram um aumento significativo em sua expressão (SAMY et al., 2000). Utilizando Northern Blotting e hibridização in situ, a expressão da PGDS foi observada em células epiteliais da cabeça, corpo e cauda do epidídimo em touros (RODRÍGUEZ et al., 2000a), mas ele mostrou-se mais abundante nas células principais da cabeça (GERENA et al., 2000). Em carneiros, PGDS mrna foi detectado apenas na cabeça do epidídimo, e sua secreção representou cerca de 25% da quantidade total de proteínas secretadas no tecido. Semelhante ao encontrado em bovinos, sua quantidade é reduzida progressivamente durante o trânsito epididimal, atingindo um valor 5 vezes menor no fluido da cauda comparado àquele da cabeça, com alterações em suas propriedades bioquímicas (FOUCHÉCOURT et al., 1999). Esta proteína também é encontrada nos fluidos testicular e epididimal, e no plasma seminal (GERENA et al., 1998). Nos espermatozóides, a PGDS se concentra no segmento apical do acrossoma, e parece associar-se com a membrana plasmática da cabeça do espermatozóide, uma vez que não é mais detectável em espermatozóides bovinos após reação acrossômica (GERENA et al., 2000). 25

48 A castração induz redução na expressão da PGDS (FOUCHÉCOURT et al., 1999), sugerindo que andrógenos influenciam esta proteína ao nível de expressão gênica ou estabilidade do mrna. A relação da PGDS com a fertilidade masculina pode resultar de sua habilidade em funcionar como transportador lipofílico intercelular, atravessando as barreiras hemato-testicular e hemato-epididimal. A localização específica da PGDS nas espermátides e células de Sertoli no testículo, e nas células principais do epidídimo, especialmente no segmento proximal da cabeça, sugere que ele pode ser importante no desenvolvimento e maturação espermática (GERENA et al., 1998; 2000). Apesar da PGD 2 representar de 7 a 10% das prostaglandinas detectadas no epidídimo de carneiros, sua produção se dá independentemente da presença de PGDS no lúmen. Estes achados, juntamente com aqueles de que esta proteína é capaz de se ligar ao ácido retinóico e à testosterona no fluido epididimal, sugerem, conforme observado em touros, que a PGDS age no trato reprodutivo do carneiro como uma lipocalina, envolvida na regulação do epitélio epididimal. Contudo, como baixas concentrações de PGDS foram encontradas no sêmen de carneiros com alta fertilidade, é possível que altas concentrações de PGDS no trato genital masculino não sejam essenciais para sua função reprodutiva (FOUCHÉCOURT et al., 2002) Osteopontina A osteopontina (OPN) é uma proteína altamente acídica (55 kda), rica em ácido aspártico, ácido glutâmico e serina (SORENSON & PETERSEN, 1994) e foi isolada inicialmente da matriz mineralizada de ossos bovinos (FRANZEN & HEINEGARD, 1985). Estudos imunohistoquímicos localizaram 26

49 a OPN na superfície luminal das células epiteliais do trato reprodutivo (BROWN et al., 1992), mas ela também está presente em fluidos biológicos, como urina, leite e plasma seminal (SENGER et al., 1989; CANCEL et al., 1997). Em média, a OPN é 2,6 vezes mais concentrada em animais de alta fertilidade que naqueles de menos férteis (CANCEL et al., 1997). Este estudo encontrou ainda uma associação (R²=0,48) entre a densidade desta proteína no plasma seminal e a fertilidade de touros (taxa de não retorno ao estro em pelo menos IAs), um resultado semelhante ao encontrado por KILLIAN et al. (1993). Várias formas de osteopontina tem sido descritas, incluindo as formas fosforilada e não fosforilada. A primeira está associada com a superfície celular, enquanto a última está presente na forma solubilizada, sugerindo diferentes funções para esta proteína (PATARCA et al., 1993). Em touros, a OPN foi encontrada no plasma seminal, fluido das glândulas acessórias, fluido da glândula vesicular e urina (CANCEL et al., 1999). Contudo, a OPN é secretada apenas pelas ampolas e glândulas vesiculares, indicando que a proteína encontrada no plasma seminal origina-se dessas glândulas. A expressão da osteopontina foi encontrada primariamente nos túbulos contendo espermátides alongadas, envolvendo o lúmen do epitélio seminífero, sugerindo que a expressão gênica da OPN, como o gene da PGDS, é regulada pelo ciclo das células germinativas. No epidídimo, a osteopontina não foi detectada nas células epiteliais de nenhum segmento, apesar de estar presente nos espermatozóides em seu lúmen. Nas glândulas sexuais acessórias, sua expressão foi observada apenas nas células epiteliais da ampola (RODRÍGUEZ et al., 2000b). 27

50 Diferentemente dos achados de RODRÍGUEZ et al. (2000b), CANCEL et al. (1999) não puderam demonstrar que a OPN liga-se aos espermatozóides bovinos. Essas diferenças possivelmente devem-se a variações na detecção da OPN e no estado funcional dos espermatozóides durante a maturação. É ainda possível que a OPN se ligue fracamente aos espermatozóides, e seja retirada durante o procedimento de lavagem. De fato, a relação entre a OPN no plasma seminal e a fertilidade masculina pode ser indireta. Ela pode evitar a ligação de bactérias ao epitélio reprodutivo, competindo pelos sítios de ligação das integrinas que estão presentes nas células epiteliais, protegendo as glândulas acessórias contra inflamações (BROWN et al., 1992; RODRÍGUEZ et al., 2000b). Considerando a função da OPN como molécula de adesão celular, é possível que ela possa auxiliar na adesão das células germinativas em desenvolvimento às células de Sertoli ou a outras células germinativas. A osteopontina também pode estar envolvida na transferência de informação entre células nos túbulos seminíferos. Uma vez que a OPN foi expressa apenas no compartimento adluminal dos túbulos seminíferos e nos espermatozóides localizados no epidídimo, esta proteína pode ainda estar associada com o desenvolvimento das espermátides alongadas e dos espermatozóides, influenciando a agregação de vesículas durante a formação do acrossoma. Finalmente, é possível que mrnas para osteopontina sejam armazenados durante a espermatogênese para estar disponíveis para tradução durante o desenvolvimento embrionário inicial (RODRÍGUEZ et al., 2000b). 28

51 Fosfolipase A2 Fosfolipases A2 (PLA2), de baixa massa molecular, são enzimas que variam de 14 a 20 kda, encontradas em fluidos corporais (DENNIS, 1994). No trato reprodutivo, a PLA2 regula a maturação espermática e a reação acrossômica (UPRETI et al., 1994), convertendo fosfolipídios em lisolipídios, como a lisolecitina. Espermatozóides tratados com lisolecitina apresentam fusão das membranas plasmática e acrossômica durante a reação acrossômica (ROLDAN & FRAGGIO, 1993), um evento essencial para a fertilização. Estas enzimas foram detectadas no sêmen de carneiros (ROLDAN & FRAGGIO, 1993), bodes (ATREJA & GANDHI, 1992) e touros (SOUBEYRAND et al., 1997), próxima ao acrossoma (RIFFO & PARRAGA, 1996). No carneiro, há baixos níveis desta proteína no plasma seminal, sugerindo que a PLA2 origina-se no epidídimo ou é liberada do espermatozóide (UPRETI et al., 1999). Em bodes, altas concentrações de PLA2 estão presentes no plasma seminal durante a estação não reprodutiva, com forte afinidade por heparina. Esta proteína pode estar relacionada à deterioração da qualidade seminal quando se utiliza diluidores baseados em leite. Provavelmente, estes efeitos deletérios estão relacionados com a hidrólise de fosfolipídeos da membrana espermática pela PLA2 presente na fração protéica com afinidade pela heparina (HAP). Este efeito é mais intenso na HAP da estação não reprodutiva, em meio rico em fosfolipídeos, sugerindo que um modulador da PLA2 pode estar presente no sêmen em diferentes concentrações conforme a estação. Uma função para a PLA2 no plasma seminal na estação reprodutiva poderia estar relacionada à capacitação espermática, uma vez que sua 29

52 modulação altera a fluidez da membrana espermática, o que constitui uma das etapas da capacitação (LA FALCI et al., 2002) Sistema Kalikreína-Cininas Os componentes do sistema kalikreína-cininas melhoram a motilidade de espermatozóides ovinos e bovinos, a fresco ou criopreservados (BRATANOV et al., 1978ab). As cininas são os principais produtos deste sistema e ativam a motilidade espermática após a ejaculação (SCHILL et al., 1989). O plasma seminal contém cininogênio (FINK et al., 1990), o substrato específico da kalikreína, cininas, o produto desta reação, e cininase, a enzima inativadora das cininas (SCHILL et al., 1989). No trato reprodutivo masculino, a principal fonte de kalikreína é a próstata (FINK et al., 1985), mas seu exato significado fisiológico em mamíferos ainda não foi elucidado (SOMLEV & SUBEV, 1997). O plasma seminal bovino apresenta importante atividade de kalikreína, que está significativamente associada a motilidade, mas não à concentração espermática (SOMLEV et al., 1996), sendo a bradicinina que apresenta efeito estimulatório sobre esta motilidade. Este efeito é mais pronunciado em ejaculados com baixos níveis de atividade da kalikreína, devido à compensação no déficit de cininas. Nesse caso, a baixa atividade enzimática leva a considerável ativação dos mecanismos reguladores da cinética espermática causada pela proteína exógena (SOMLEV & HELILI, 1996; SOMLEV & SUBEV, 1997). Contudo, a adição de maiores concentrações de cininas aos espermatozóides acima da concentração ótima não leva a posteriores aumentos na motilidade, indicando um efeito saturável (MISKA & SCHILL, 1990). 30

53 A enzima cininase II é outro componente do sistema kalikreína-cininas encontrado no plasma seminal (MISKA et al., 1988). Esta enzima, identificada como enzima conversora da angiotensina 1 (ACE) (HOHLBRUGGER et al., 1984) é secretada pelos testículos, epidídimos e próstata (KRASSNIG et al., 1989) e é inespecífica com relação a seus substratos. Além da angiotensina, ela hidrolisa outros peptídeos como a bradicinina (BERNSTEIN et al., 1992), inativando seus efeitos biológicos. Inibidores da ACE seminal aumentaram o poder estimulante da bradicinina sobre a motilidade espermática, bloqueando a influência negativa da ACE. Este efeito abre a possibilidade do uso prático dos inibidores da ACE em centrais de IA (SOMLEV & SUBEV, 1998). Atividade significativa da ACE tem sido relatada no trato genital de mamíferos, especialmente no epidídimo (VINSON et al., 1997). A ACE presente no plasma seminal do carneiro é secretada pelas células germinativas e é liberada da membrana espermática ao longo do trânsito epididimal. Uma vez no fluido, há uma redução em seu massa molecular de, aproximadamente, 105 kda para 94 kda, no fluido da junção entre cabeça e corpo epididimal, sugerindo a perda de sua âncora na membrana (GATTI et al., 1999). De acordo com esses estudos, utilizando 2D-PAGE, a ACE estava totalmente ausente do fluido epididimal de carneiros azoospérmicos. É possível que esta enzima atue na maturação espermática (KÖHN et al., 1998), evitando ativação prematura da motilidade, mas isto ainda não foi confirmado. A ACE existe em duas formas, uma somática (S) e outra testicular (T). Camundongos knock-out para ambas enzimas (stst) apresentam prolificidade muito baixa (KREGE et al., 1995). Menos de 5% dos ovos fertilizados pelos espermatozóides destes animais desenvolveram-se até o estágio de 8 células, 31

54 comparado com mais de 65% em camundongos normais (STST), embora os machos knock-out apresentassem histologia testicular, concentração, morfologia, viabilidade e motilidade espermática, reatividade acrossômica, bem como critérios avaliados por análise computadorizada do sêmen como velocidade linear, deslocamento lateral de cabeça e movimento espermático comparáveis aos de machos normais. Contudo, os animais STST obtinham concentração espermática no oviduto 1 hora após a cobertura muito maior que os animais knock-out nas mesmas condições. In vitro, estes animais apresentaram número significativamente menor de espermatozóides ligados por zona pelúcida que os animais STST. Em outro estudo, com o objetivo de determinar as isoenzimas importantes para a fertilidade, machos knock-out apenas para a isoenzima somática (stst) foram produzidos, deixando a ACE testicular inalterada. Nesse caso, a prolificidade foi equivalente àquela de animais normais, mas significativamente maior que aquela de animais stst, mostrando que a ausência da ACE somática não influencia a fertilidade. Já em animais knockout para uma alelo de cada isoenzima (stst), os espermatozóides st e ST são funcionalmente idênticos. Apesar da ausência do gene para ACE testicular nas células st, todas as espermátides maduras nesses machos contêm mrna para ACE testicular e a própria proteína, provavelmente devido às pontes intercitoplasmáticas entre as células germinativas em desenvolvimento (HAGAMAN et al., 1998). DEMOTT et al. (1995) demonstraram que as alterações na membrana espermática durante a capacitação são importantes para a mediação espermática do epitélio do oviduto. Desse modo, é possível que 32

55 espermatozóides de machos stst liguem-se ao epitélio do oviduto mas não consigam desligar-se adequadamente devido à ausência da ACE testicular. Em carneiros, a ACE seminal pertence a isoforma testicular liberada no fluido epididimal (GATTI et al., 1999). A atividade seminal da ACE ovina está relacionada significativamente com a concentração espermática do ejaculado. Em um estudo a campo, carneiros de baixa fertilidade tenderam a apresentar menor atividade da ACE que aqueles de alta fertilidade. Nesse caso, as ovelhas foram inseminadas cervicalmente e o índice de fertilidade foi determinado como a proporção de ovelhas que pariram em relação ao número total de fêmeas inseminadas. Os machos com maior atividade de ACE seminal emprenharam significativamente mais fêmeas que aqueles com mais baixa atividade, confirmando os estudos in vitro, sendo a atividade epididimal da ACE zinco, cloreto e ph dependente (MÉTAYER et al., 2001). Baseando-se nesses achados, pode-se inferir que a atividade da ACE testicular está relacionada a alguns parâmetros de qualidade seminal importantes para a fertilidade Clusterina A clusterina é uma glicoproteína presente em inúmeros tecidos e fluidos fisiológicos, como o leite e o sêmen (WATTS et al., 1990; KOUNNAS et al., 1995), tendo sido isolada, pela primeira vez, do fluido da rete testis de carneiros. Esta proteína tem seu nome devido à sua habilidade de causar agregação celular (BLASCHUK et al., 1983). Devido à sua ampla distribuição, a clusterina tem sido implicada em vários fenômenos fisiológicos. Algumas de suas funções incluem interações intercelulares, maturação espermática, regulação da ativação do sistema complemento, 33

56 metabolismo de lipídeos, secreção endócrina e remodelamento da membrana celular (FRITZ et al., 1983; JENNE & TSCHOPP, 1989; DE SILVA et al., 1990; SYLVESTER et al., 1991; TENNISWOOD et al., 1992; BAILEY & GRISWOLD, 1999; HUMPHREYS et al., 1999). No trato reprodutivo, a clusterina foi encontrada na próstata, glândulas vesiculares, testículo, espermatozóides luminais e epidídimo (SENSIBAR et al., 1993; BAILEY & GRISWOLD, 1999; BRAUNDMEIER & MILLER, 2001). No epidídimo há um aumento em sua concentração na cabeça, decrescendo progressivamente até a cauda. Esta proteína representa 1,5% do total de proteínas no fluido luminal do segmento proximal da cabeça, 6% no segmento médio e 7% no segmento distal. No fluido do corpo, constitui 13,5%, e 9,2% no fluido da cauda, com sua concentração variando de 3,9 a 4,8 mg/ml. A clusterina é uma das proteínas mais abundantes no epidídimo, podendo compor até 24,8% da secreção epididimal total (FOUCHÉCOURT et al., 2000). Esta proteína associa-se tão fortemente à membrana espermática, que é necessário o uso de detergentes para removê-la (LAW & GRISWOLD, 1994; BAILEY et al., 2001). Devido à essa associação, sugere-se que sua concentração está relacionada à qualidade seminal, mas os resultados de estudos são contraditórios. Pacientes humanos com oligozoospermia e azoospermia apresentam menores concentrações seminais de clusterina, explicando, talvez, porque maiores concentrações seminais desta proteína estejam associadas com maior taxa de sucesso na fertilização in vitro (CHOI et al., 1990; O BRYAN et al., 1990). Contudo, sêmen de touros que possuem muitos espermatozóides ligados a clusterina atingem menor fertilidade, determinada pela taxa de não retorno ao estro, bem como apresentaram maior percentual de anormalidades morfológicas, um indicador de problemas na 34

57 espermatogênese ou maturação epididimal (IBRAHIM et al., 2000). De fato, apesar de promissora, o uso da clusterina seminal como marcador molecular para fertilidade ainda depende de maiores estudos para elucidar seu mecanismo de ação. A clusterina é induzida em resposta ao dano celular e é sintetizada, principalmente, pelas células que sobrevivem a apoptose ou por aquelas próximas daquelas que iniciam o processo. Esta proteína parece ligar-se a moléculas hidrofóbicas como um mecanismo de eliminar componentes celulares potencialmente danosos durante a degeneração das células germinativas (CLARK et al., 1997; BAILEY & GRISWOLD, 1999). A clusterina pode inibir também a precipitação protéica induzida pelo estresse. Este achado apóia a hipótese de que a clusterina expressa durante o estresse celular age como chaperone, ou seja, liga-se a proteínas parcialmente desestruturadas, solubilizando-as e protegendo as células dos efeitos citotóxicos da precipitação protéica. A clusterina pode ser a primeira chaperone identificada em mamíferos (MICHEL et al., 1997; HUMPHREYS et al., 1999; WILSON & EASTERBROOK-SMITH, 2000). Estes achados, junto com as observações de que a expressão da clusterina está limitada às células de Sertoli e, no epidídimo, ela está uniformemente presente nas células epiteliais levou ARONOW et al. (1993) a apontar que essa proteína participaria na proteção das membranas celulares expostas a moléculas hidrofóbicas potencialmente tóxicas nas barreiras fluido-teciduais. A associação da clusterina com o complexo de ataque a membranas sugere que ela modula danos mediados pelo complemento, uma vez que ela liga-se a complexos terminais do complemento, prevenindo sua inserção nas membranas celulares. Os complexos resultantes são solúveis e incapazes de 35

58 induzir lise celular. Isto pode ser importante para a proteção dos espermatozóides no trato reprodutivo feminino (ROSENBORG & SILKENSEN, 1995; MERI & JARVA, 2001). Apesar da clusterina apresentar várias funções, em vários tecidos e fluidos biológicos, ainda não foi determinado se esta proteína apresenta um mecanismo de ação comum. Desse modo, a compreensão desse mecanismo é importante para o desenvolvimento de ensaios para a clusterina e seu uso como marcador para fertilidade Lactoferrina Uma das proteínas do plasma seminal envolvidas na manutenção da motilidade espermática é a lactoferrina (Lf). Ela está presente também em outros fluidos corporais, como leite (MASSON & HEREMANS, 1971), lágrima (GACHON et al., 1982) e fluido amniótico (NIEMELA et al., 1989). A Lf liga-se ao ferro iônico e pode participar de atividades anti-microbianas, diferenciação celular e regulação gênica (FURMANSKI, 1995; NOZAKI et al., 2002), muito embora sua principal função esteja relacionada com o transporte e armazenagem de ferro durante a lactação (SORRENTINO et al., 1999). No trato genital masculino, a lactoferrina é um dos principais componentes do fluido epididimal, estando em contato com os espermatozóides durante o armazenamento na cauda do epidídimo (ARAÚJO, 2000). No fluido epididimal do garanhão, ele constitui cerca de 60% das proteínas no corpo (15 mg/ml) (DRUART, 1998; FOUCHÉCOURT, 1999; FOUCHÉCOURT et al., 2000). Esta proteína liga-se aos espermatozóides durante o trânsito epididimal (JIN et al., 1997) ou após a ejaculação. No plasma seminal, esta ligação ocorre na presença de fatores de ligação 36

59 (THALER et al., 1990). No trato genital feminino, a Lf é progressivamente liberada da superfície espermática após a penetração no muco cervical (JIN et al., 1997), mas sua exata função nesse contexto ainda é desconhecida. Recentemente, ARAÚJO (2000) mostrou o efeito benéfico da Lf sobre a motilidade espermática, percentual de espermatozóides móveis e freqüência de batimento flagelar in vitro em carneiros. Este efeito é dose dependente e menos pronunciado na percentagem de espermatozóides móveis. A presença desta proteína no diluidor seminal permite uma melhor manutenção dos parâmetros citados acima. Possivelmente, este efeito esteja relacionado à habilidade da lactoferrina em se ligar ao ferro, evitando a produção de radicais livres, levando a peroxidação e danos à membrana espermática, funcionando, desta forma, como um antioxidante, do mesmo modo que outras proteínas epididimais (WAKABAYASHI et al., 1999) Proteínas Não Identificadas O plasma seminal contém muitos compostos bioquímicos importantes para a motilidade e viabilidade espermática no carneiro (ASHWORTH et al., 1994; GRAHAM, 1994; MAXWELL et al., 1997) que melhoram a resistência de espermatozóides suínos ao choque térmico (BERGER & CLEGG, 1985). Além do mais, as membranas dos espermatozóides ovinos são menos resistentes ao choque térmico comparado a outras espécies (FISER & FAIRFULL, 1989). Estudos demonstraram que grande quantidade de proteínas do plasma seminal são adsorvidas pelo espermatozóide, promovendo alterações em sua superfície e, especialmente no carneiro, elas são capazes de reverter danos à membranas causados pelo choque térmico (GARCIA-LÓPEZ et al., 1996; OLLERO et al., 1997). De fato, as proteínas do plasma seminal 37

60 ovino podem melhorar significativamente a sobrevivência e o percentual de espermatozóides com membrana intacta sujeitos ao choque térmico. Este efeito benéfico foi aumentado pela adição de ácido oléico/linoléico ou vitamina E (PÉREZ-PÉ et al., 2001). Concordando com esses achados, aproximadamente 65% dos espermatozóides ovinos danificados pelo choque térmico tiveram sua membrana restaurada após incubação com 1,4 mg de proteínas do plasma seminal. A proporção de células restauradas foi dependente da concentração de proteínas no meio, sugerindo que o plasma seminal é muito importante na determinação da qualidade do ejaculado (BARRIOS et al., 2000). No touro, RONCOLETTA et al. (1999), através de SDS-PAGE, encontraram uma banda com 61,8 kda e mobilidade relativa de 20,3 que estava presente no sêmen de reprodutores de alta congelabilidade e sempre ausente naqueles de baixa fertilidade, mostrando que alguns componentes protéicos do plasma seminal podem melhorar a crioresistência espermática. Em caprinos, estudo recente demonstrou que a motilidade espermática foi significativamente melhorada quando o plasma seminal estava presente no meio, tanto em sêmen a fresco ou descongelado. Além disso, a remoção do plasma seminal aumentou o percentual de espermatozóides com a membrana danificada (AZEREDO et al., 2001). Outro estudo, realizado por MAXWELL et al. (1999) mostrou que a suplementação de espermatozóides ovinos descongelados com plasma seminal aumentou significativamente as taxas de prenhez e prolificidade de ovelhas inseminadas cervicalmente a um nível semelhante àquelas inseminadas intra-uterinamente. A cérvix da ovelha age como uma barreira aos espermatozóides, especialmente aos danificados. Considerando que o processo de congelamento danifica a membrana 38

61 espermática, e reduz sua habilidade de ultrapassar a cérvix, a IA cervical com sêmen descongelado em ovelhas resulta em taxas de concepção muito baixas (MAXWELL et al., 1999), impondo dificuldades à expansão da IA em ovinos. Estes resultados mostram-se muito importantes para a indústria da IA, porque indicam, pela primeira vez, que índices de fertilidade semelhantes aos obtidos com inseminação intra-uterina podem ser obtidos pela via cervical com sêmen descongelado. 39

62 3 - MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Localização do experimento e Manejo dos Animais O experimento foi conduzido no Núcleo de Estudos em Forragicultura, pertencente ao Departamento de Zootecnia da Universidade Federal do Ceará (UFC), situado a 3 45 de latitude Sul e de longitude Oeste, com altitude média de 15,5m acima do nível do mar. Foram utilizados dezesseis cordeiros machos da raça Santa Inês, com 8,00 ± 0,13 semanas de idade. Os animais foram mantidos em confinamento até os 12 meses de idade, alimentados com feno de tifton (11% PB) e capimelefante (4% PB), fornecidos para uma sobra de 10 a 15% do total ofertado, e suplementação concentrada (18% PB Ovinotech, Purina ) segundo os requerimentos do NRC (1985), tendo acesso livre à água e mistura mineral (Purinafós 65 Ovinos Plus, Purina ) Desenvolvimento Corporal e Testicular Semanalmente, a partir de oito semanas de vida, avaliou-se o peso vivo (PV), perímetro torácico (PT), circunferência escrotal (CE), comprimento (CT) e diâmetro testiculares (DT). O PT foi medido com auxílio de fita métrica e tomado na região imediatamente caudal às espáduas. A medida da CE foi tomada também com fita métrica, na parte inferior da bolsa escrotal, em sua região mais larga (MARTINS FILHO, 1991), com os testículos tracionados para baixo, a fim de evitar uma medida superestimada. 40

63 Utilizando-se um paquímetro, determinou-se a medida dos dois testículos na posição dorso-ventral (CT), desprezando-se a cauda do epidídimo e médiolateral (DT), obtendo-se a média dos dois testículos em cada período. Estas medidas serviram para o cálculo da relação comprimento-diâmetro (RCD) nas várias idades estudadas. Às 50 semanas de idade, os cordeiros foram abatidos segundo métodos recomendados pelo Ministério da Agricultura e Abastecimento (BRASIL, 1980). Os animais foram insensibilizados por concussão cerebral, sangrados, esfolados e eviscerados, pesando-se a carcaça para estudo de rendimento. Foram determinados o peso ao abate (PA), o peso de carcaça quente (PCQ) e PCQ o rendimento de carcaça ( RC = x100), logo após a evisceração PA (OLIVEIRA et al., 2002) Estudo da Puberdade Nos mesmos períodos de mensuração da circunferência escrotal, avaliouse o grau de desprendimento entre a parte livre do pênis e a mucosa do prepúcio, baseando-se em uma escala de 0 (completamente ligado) a 5 (totalmente livre), conforme WIGGINS & TERRIL (1953). O animal foi considerado púbere quando apresentava o pênis totalmente desprendido Avaliação do Sêmen Logo que iniciado o desprendimento peniano, amostras de sêmen foram colhidas semanalmente por eletroejaculação, objetivando determinar a idade em que aparecem os primeiros espermatozóides e o início da motilidade no ejaculado, bem como as associações entre os parâmetros seminais e as demais 41

64 características estudadas. O procedimento de eletroejaculação consistiu na inserção de um eletrodo bipolar, lubrificado com vaselina, no reto do animal, a uma profundidade de 15 a 20 cm, tomando-se a precaução de evitar danos à mucosa retal. O eletrodo foi direcionado para o assoalho pélvico e foram aplicados curtos estímulos (3 a 7 segundos) a intervalos de 15 a 20 segundos, com intensidade média de 15V até a ejaculação, evitando-se desconforto desnecessário ao animal (CAMERON, 1977). Após limpeza do prepúcio, o sêmen foi colhido em um copo coletor graduado acoplado à abertura prepucial para avaliação do volume ejaculado e motilidade massal (MM), motilidade (MOT), motilidade progressiva (MOP), e vigor dos espermatozóides. Nesta fase, o ph do ejaculado também foi determinado utilizando tiras reagentes (MERCK ). A motilidade massal é o movimento em massa dos espermatozóides no plasma seminal, assemelhando-se a ondas do mar (NUNES et al., 1997) e é resultante da interação entre a motilidade e a concentração espermática (WENKOFF, 1988). Imediatamente após a colheita do sêmen, ela foi avaliada em uma gota de 50 µl de sêmen puro, sem lamínula, onde se arbitrou uma nota subjetiva numa escala de 0 a 5, de acordo com a intensidade do movimento dos espermatozóides, em microscopia óptica com aumento de 100X (SALAMON, 1976). A motilidade foi avaliada no sêmen diluído 1:10 em solução salina (0,9%), sob lamínula, em diversos campos, e representa a percentagem de espermatozóides móveis, enquanto a MOP refere-se àqueles com motilidade progressiva retilínea. Estes parâmetros foram avaliados em microscopia óptica, sob aumento de 400X. O vigor, por sua vez, representa a intensidade 42

65 da movimentação dos espermatozóides, sendo avaliado numa escala subjetiva de 0 a 5 (NUNES, 1982; FONSECA et al., 1992). A concentração espermática foi determinada através da contagem dos espermatozóides em uma câmara de Neubauer (CHEMINEAU et al., 1991), utilizando-se uma diluição seminal de 1:400 em solução formol-salinatamponada (EVANS & MAXWELL, 1987). Após a colheita, foram confeccionados esfregaços seminais corados com eosina-nigrosina (COLAS, 1980), onde se determinou a percentagem de espermatozóides com defeitos totais e de cabeça, peça intermediária, cauda e gotas proximais e distais. Foram contadas 200 células por esfregaço/coleta em aumento de 1000X Determinação da Concentração de Testosterona no Plasma Sanguíneo Amostras de sangue foram colhidas em tubos a vácuo (5 ml) contendo EDTA nas fases de pré-puberdade (3 meses de idade), puberdade (5 e 6 meses) e pós-puberdade (8, 10 e 12 meses) através de punção da veia jugular. Foram obtidas três amostras por animal, a intervalos de 30 minutos, iniciando-se a coleta sempre entre 8:00 e 9:00 horas da manhã. O sangue foi transportado ao laboratório em gelo para centrifugação (5000 rpm, 10 minutos, 4 C) e o plasma, armazenado a -20 C. As concentrações plasmáticas de testosterona nas diferentes idades foram quantificadas através de radioimunoensaio (Coat-a-Count Total Testosterone, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, California, USA), previamente validado para o plasma ovino (CASTRILLEJO et al., 1995). Todas as amostras foram processadas em duplicatas. As amostras foram descongeladas à temperatura ambiente e homogeneizadas em agitador Vortex (Scientific 43

66 Industries Inc., USA) e 50µL de plasma foram pipetados em tubos de polipropileno contendo anticorpos específicos para testosterona imobilizados em sua parede. Em seguida, adicionou-se 1 ml de testosterona radioativa (marcada com I 125 ) por tubo, homogeneizou-se o conteúdo no Vortex e incubaram-se os tubos em banho-maria a 37 C por 3 horas. Após a incubação os tubos foram vertidos, decantados por 15 minutos e lidos em um Contador Gamma (Nuclear Enterprises NE USA). A sensibilidade do ensaio é de 0,04 ng/ml Avaliação das Proteínas do Plasma Seminal Amostras de plasma seminal das idades entre 15 e 48 semanas foram obtidas por centrifugação do sêmen logo após a colheita (3000 rpm, 5 minutos, 4 C) e mantidas congeladas (-20 C) para posterior análise do perfil protéico Quantificação da Concentração de Proteína Total Inicialmente, obteve-se uma curva analítica de calibração a partir de soluções padrão, com concentrações de proteína conhecidas, encerrando 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 mg de albumina sérica bovina (BSA) ml -1. Adicionou-se a cada 100 µl padrão, 2,5 ml do reagente de Bradford (BRADFORD, 1976) e as leituras de absorbância feitas a 595 nm, após 10 minutos de incubação. A curva de calibração foi, então, estabelecida por espectrofotometria em triplicata, gerando uma equação linear de absorbância x concentração (R² = 0,9761) através da qual foi possível a determinação do teor de proteínas totais em cada uma das amostras experimentais. 44

67 Para quantificação dos teores de proteína nas amostras, também em triplicata, estas foram previamente diluídas na proporção de 1:80, em água milli-q, adicionando-se a 100 µl da amostra diluída 2,5 ml do reagente de Bradford. Após 10 minutos, procedeu-se à leitura em 595 nm, obtendo-se o valor de cada amostra como a média das triplicatas Caracterização das Proteínas por Eletroforese em Gel de Poliacrilamida O perfil protéico do plasma seminal foi avaliado por eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida na presença de dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE), segundo o método descrito por SCHÄGGER & VON JAGOW (1987). Inicialmente, as amostras foram diluídas em tampão contendo SDS para uma concentração de 2 mg ml - ¹. O detergente aniônico SDS solubiliza as proteínas, ligando-se a elas em uma proporção de 1,4:1 (REYNOLDS & TANFORD, 1970), escondendo as cargas intrínsecas do polipeptídeo, de modo que a carga líquida por unidade de massa torna-se, aproximadamente, constante e a separação eletroforética se dá com base na massa molecular das proteínas. Foram utilizados géis de poliacrilamida a 12,5% com dimensões de 10 x 10,5 cm. Adicionou-se 20 µg de proteína nos poços formados no gel de empilhamento (3,5%) e utilizou-se marcadores moleculares na faixa de 10 a 250 kda (RPN 800, Amersham Biosciences, USA). A corrida foi realizada em geladeira, utilizando fonte para eletroforese com corrente elétrica de 20 ma por gel, por um período de, aproximadamente, 2 horas. Ao final da corrida, os géis foram retirados das cubas e corados com Coomassie Brilliant Blue R-350 (Amersham Biosciences, USA) por, aproximadamente, 15 horas e, 45

68 posteriormente, lavados com solução descorante contendo 4:1:3,5 (v:v) de água milli-q, ácido acético e metanol, respectivamente, e fotografados Avaliação Testicular Avaliação Morfológica Após o abate, os testículos foram recolhidos, desencapsulados e separados dos epidídimos, foram pesados e tomou-se as medidas de comprimento (CT50) e diâmetro (DT50) de ambos os testículos. O volume testicular foi calculado segundo a fórmula (SETCHELL & WAITES, 1964; 1 WROBEL et al., 1995): VT =. 2 6 π CT50 DT50 A este resultado, aplicou-se o fator de correção (x 0,945), uma vez que os testículos não são totalmente elipsóides (WROBEL, 1990). O volume do parênquima testicular foi calculado subtraindo-se 11% do volume testicular, correspondente ao mediastino e à túnica albugínea (WROBEL et al., 1995). A densidade testicular foi calculada através da razão entre peso e volume testicular (BIELLI et al., 2000) Avaliação Histológica Um fragmento da região central do testículo esquerdo, de aproximadamente 4 mm de espessura, foi retirado e imerso em fluido de Bouin por 24 horas para fixação e transferido para uma solução de etanol a 70%. Em seguida, os fragmentos foram desidratados em concentrações crescentes de etanol (70% a 100%), diafanizados em xilol e incluídos em blocos de parafina. Os blocos foram cortados em seções de 5 µm de espessura, as quais foram montadas em lâminas, desparafinizadas em incubações 46

69 com xilol e concentrações decrescentes de etanol (100% a 70%) e coradas com hematoxilina-eosina (HE). O diâmetro dos túbulos seminíferos (DTM) foi obtido em 10 seções transversais para cada testículo, com uma ocular micrométrica em aumento de 400X. O mesmo procedimento foi utilizado para a medição da altura do epitélio germinativo. Para cada seção, o DTM foi obtido como a média de dois valores, e a espessura epitelial como a média de quatro medições. As proporções volumétricas de túbulos seminíferos (VTS) e espaço intersticial (VI) foram estimadas segundo BIELLI et al. (2001), em aumento de 400X. Foram contados 600 pontos por animal, totalizando pontos para a determinação do percentual volumétrico ocupado pelos componentes estudados (CHALKLEY, 1943). Para tanto, utilizou-se a fórmula Pi Vt =, Pt onde Vt representa o volume ocupado pelo componente de interesse (túbulo ou interstício), Pi, o número de pontos sobre o componente de interesse e Pt, o total de pontos contados. A população celular dos túbulos seminíferos foi estimada pela contagem dos núcleos das células germinativas e de Sertoli em 10 seções transversais em aumento de 1000X, no estágio 2 para leptótenos e 1 e 8 do ciclo do epitélio seminífero (CES) para as demais células, segundo HOCHEREAU-DE- REVIERS et al. (1990). As contagens celulares foram corrigidas para diâmetro nuclear e espessura do corte pela fórmula de Abercrombie 5μm (ABERCROMBIE, 1946): N = NC ( ), onde N 5μm + diâm. nucleolar( μm) representa a real contagem celular e NC representa o número de células contadas por seção. Tomaram-se ainda os diâmetros nucleares das referidas 47

70 células, contando-se 10 unidades por tipo celular em aumento de 1000X com ocular micrométrica. A população de células de Sertoli por testículo foi estimada através da seguinte fórmula (BIELLI et al., 2001): NTS L = Ns, onde Ns Espessura. do. corte corresponde ao número médio de células de Sertoli por seção transversal de túbulo seminífero, e L ao comprimento total dos túbulos seminíferos. O mesmo procedimento foi aplicado às demais células germinativas. Admitindo-se que os túbulos seminíferos são cilíndricos, o comprimento tubular foi calculado conforme MARSHALL & PLANT (1996): VTS L = DTM π 2 2. As populações de células de Sertoli e germinativas foram calculadas com base em 10 seções transversais de túbulos seminíferos por animal (BERNDTSON et al., 1987). Baseados nos valores de N para cada tipo celular, foram estimadas as proporções do número de espermatogônias A / célula de Sertoli, número de espermátides / célula de Sertoli e espermatogônia A. A produção diária de células germinativas foi calculada a partir de seu número total por testículo, dividido pela duração (10,4 dias) do CES em carneiros (ORTAVANT, 1959; HOCHEREAU-DE-REVIERS, 1990) Análise Estatística Utilizou-se o delineamento experimental em blocos ao acaso (16 animais = 16 blocos). A análise de variância e os testes de Duncan e t de 48

71 Student foram utilizados para determinar as diferenças dos parâmetros de desenvolvimento corporal e testicular entre as idades. Utilizou-se ainda a análise de variância e o teste de Student para determinação das diferenças na secreção de testosterona ao longo das idades (SAMPAIO, 1998). Os valores referentes às concentrações de testosterona sofreram transformação logarítmica antes da análise (BIELLI, 1999). As características de desbridamento peniano, motilidade massal e vigor espermático foram analisadas pelo teste não paramétrico de Kruskal- Wallis. As correlações entre os parâmetros foram calculadas pelo método de Pearson (SAS, 2000). 49

72 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Desenvolvimento Ponderal Peso corporal O peso vivo dos animais apresentou uma evolução contínua de 12,31±0,65 kg às 8 semanas para 54,25±1,62 kg às 48 semanas (Figura 1), com um ganho médio diário de 196,2 g. Estudos semelhantes mostraram ganhos de peso de 157,6 a 191,6 g/d em cordeiros Santa Inês confinados na mesma faixa etária (KAWAS et al., 1986; MOURA et al., 1999; SOUZA et al., 2000), o que mostra desempenhos equivalentes ou superiores aos obtidos para os referidos animais h h, i i, j j k Peso Corporal (kg) a b c d e f g Idade (semanas) FIGURA 1 Variação do peso vivo em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). O peso corporal médio dos animais ao abate foi 55,25 ± 3,50 kg e o peso de carcaça quente, 24,49 ± 3,83 kg, correspondendo a um rendimento de carcaça de 48,60 ± 2,24%. SOUZA et al. (1998), trabalhando com cordeiros da raça Santa Inês confinados e abatidos às 24 semanas de idade, apresentaram médias de peso ao abate de 29,50 a 34,75 kg, e pesos de carcaça quente de 13,30 a 15,30 kg, com rendimentos de 44,03 a 45,08%. A diferença 50

73 entre estes resultados sugere que o rendimento de carcaça dos carneiros é influenciado pela idade, embora sejam necessários estudos mais específicos para comprovação desta hipótese Perímetro Torácico O perímetro torácico dos animais variou de 55,41 ± 1,10 cm às 8 sem. para 87,84 ± 0,78 cm às 48 sem., aumentando mais rapidamente até 36 sem., mas com aumentos menores após 38 sem. (Figura 2). LÔBO et al. (1997) mostraram que o crescimento do PT de carneiros Morada Nova foi de apenas 10% entre as idades de 30 e 52 sem. SOUZA et al. (2000), trabalhando com cordeiros Santa Inês na mesma faixa etária, encontraram também maiores variações no perímetro torácico até 32 sem. de vida. Possivelmente, o crescimento dos animais após 36 sem. tem pouca relação com o crescimento da estrutura óssea do tórax dos animais. Resultado semelhante foi encontrado por LEDIC & DERAGON (1997) em touros Nelore. Perímetro Torácico (cm) g h h,i i i i f e d c b a Idade (semanas) FIGURA 2 Variação do perímetro torácico em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). 51

74 4.2. Biometria Testicular Circunferência Escrotal O potencial das medições testiculares, em particular da circunferência escrotal, como critério de seleção para a fertilidade masculina em carneiros, já foi demonstrado (LAND, 1973; MATOS et al., 1992). A circunferência escrotal variou de 9,78 ± 0,46 cm às 8 sem. para 32,09 ± 0,37 cm às 48 sem. (Figura 3). Estas variações foram significativas até 36 sem., quando alcançou 30,66 ± 0,49 cm. SOUZA et al. (2000) encontraram crescimento significativo na circunferência escrotal em cordeiros Santa Inês até 28 sem. de idade (28,8 cm), e SOUZA et al. (2001) observaram aumentos da mesma magnitude em cordeiros dessa raça até a idade de 32 sem. Em animais adultos (81 sem.), durante a XVI Exposição Agropecuária de Recife, SALGUEIRO & NUNES (1999) encontraram valor médio de 33,3 cm, o qual é próximo do valor encontrado às 48 sem. em nossos animais, confirmando a tendência à estabilização da CE a partir desta idade. Circunferência Escrotal (cm) a b c d e f g h h h h h Idade (semanas) FIGURA 3 Variação da circunferência escrotal em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). 52

75 Em um estudo comparando a circunferência escrotal em ovinos das raças Santa Inês e Morada Nova, em diversas faixas etárias, FREITAS et al. (1991) observaram valores de 29,0 e 26,2 cm entre 24 e 48 sem. de idade; 30,2 e 28,8 cm entre 48 e 96 sem.; 30,2 e 31,2 cm entre 96 e 144 sem.; e finalmente 31,8 e 33,0 cm em animais com mais de 144 sem., respectivamente, para as duas raças. Estes resultados apóiam os nossos achados de que a CE, nesta espécie, não aumenta significativamente após as 48 sem. de vida. Parâmetros semelhantes foram achados por LÔBO (1996) que, trabalhando com ovinos da raça Morada Nova, também de pequeno porte, observou circunferência escrotal de 10,34 ± 0,74 cm às 16 sem. de idade, comparado ao valor de 17,01 ± 0,77 nos cordeiros Santa Inês de mesma idade. Ele encontrou, ainda, valores de 18,54 cm às 30 sem. e 23,82 cm às 48 sem. de idade e relatou que o período de crescimento mais rápido se deu entre 16 e 30 sem. de idade, possivelmente devido aos efeitos das concentrações crescentes de testosterona, características dessa fase, e seus efeitos sobre o desenvolvimento do epitélio germinativo. BELIBASAKI & KOUIMTZIS (2000), estudando o desenvolvimento sexual de cordeiros de diferentes raças nativas da Grécia, encontraram valores para a circunferência escrotal de 28,9; 27,5 e 27 cm, respectivamente, para as raças Chios, Karagouniki e Serres às idades de 25, 27 e 30 sem. Nas raças Horros e Menz (nativas da Etiópia), a circunferência escrotal cresceu de 14,5 e 14,1 cm para 19,9 e 20,2 cm, atingindo ainda 23,2 e 23,5 cm às 24, 32 e 48 sem., respectivamente. Embora estes animais apresentem menores valores de CE em relação à raça Santa Inês, isto possivelmente se deve ao fato de eles 53

76 também apresentarem pequeno porte (variação de 11 a 20 kg de peso vivo entre essas idades) (TOE et al., 2000). Em animais lanados da raça Corriedale, MORAES et al. (1981) não encontraram diferenças para circunferência escrotal entre animais com 48 e 96 sem. de idade (30,6 e 31,6 cm, respectivamente). Por outro lado, VIVANCO et al. (1986), estudando o desenvolvimento da circunferência escrotal em animais desta raça, observaram diferenças significativas nos valores de CE entre as idades de 72 e 168 sem. Nesse caso, as medições foram feitas nos mesmos animais, e estas variações podem ter refletido efeitos do fotoperíodo, uma vez que às 72 sem. os animais estavam em estação não reprodutiva, o que não ocorreu na segunda avaliação. Em animais mestiços Finnsheep X Rambouillet, NOTTER et al. (1981) obtiveram valores de 10,8 a 25,6 cm entre as idades de 03 e 22 sem. de idade. YARNEY et al. (1993), estudando o desenvolvimento sexual em cordeiros Suffolk, observaram crescimento linear da circunferência escrotal entre 4 e 27 sem., conforme nossos achados. No entanto, estes animais estabilizaram o crescimento da CE em idade mais jovem, comparado aos animais Santa Inês, refletindo possíveis diferenças entre genótipos, conforme constataram CARR & LAND (1975). O peso corporal e a idade são as duas maiores fontes de efeitos sobre a CE, devendo ser levados em consideração no momento da seleção dos reprodutores (LÔBO, 1996). A CE está correlacionada positivamente com o peso corporal e a idade (JOBIM et al., 1989; FREITAS et al., 1991; OSINOWO et al., 1992), sendo as correlações entre CE e PV sempre maiores que aquelas entre CE e idade (LÔBO, 1996). Entretanto, esses efeitos são 54

77 particularmente pronunciados em animais jovens (ODABASIOGLU et al., 1992). Inúmeros fatores ambientais podem influenciar o desenvolvimento testicular. Em regiões temperadas, a estação do ano apresenta efeito significativo sobre os valores da CE (LAND & SALES, 1977; PÉREZ- CLARIGET et al., 1998). BIELLI et al. (1997) observaram que a circunferência escrotal de carneiros Corriedale apresentou regressão (-17%) no inverno, voltando aos valores normais no outono. Esta regressão foi atribuída a uma redução no diâmetro dos túbulos seminíferos (-23%) no mesmo período. Isto se justifica, uma vez que estes ocupam aproximadamente 85% do volume testicular em ovinos (WROBEL et al., 1995). Estas variações são governadas por alterações no fotoperíodo, mecanismo pelo qual os animais registram a duração da luminosidade diária (MALPAUX et al., 1996). Embora o fotoperíodo exerça uma forte influência sobre o desenvolvimento testicular, quanto mais próximo do equador, menores os efeitos fotoperiódicos, tornando-se mais relevante a influência nutricional, de tal modo que em regiões tropicais os efeitos da nutrição são mais pronunciados (LINCOLN & SHORT, 1980). Ainda durante a gestação, BIELLI et al. (2002) mostraram que a subnutrição da fêmea pode limitar o desenvolvimento testicular do cordeiro, por reduzir a população das células de Sertoli. MURRAY et al. (1990) encontraram correlações (r = 0,85) entre a ingestão de energia e o crescimento testicular em cordeiros Merino. Em animais deslanados, FREITAS & NUNES (1992) observaram diferenças significativas para o valor da CE em animais sem raça definida, criados em sistema semi-intensivo, entre as estações seca e chuvosa, com valores maiores nesta última, refletindo maior abundância de alimentos. Os efeitos da nutrição 55

78 sobre o desenvolvimento testicular envolvem respostas a curto ou longo prazo (BLACHE et al., 2000). Os efeitos em curto prazo agem principalmente no sistema neuroendócrino que controla a atividade testicular (MARTIN et al., 1994), enquanto aqueles em longo prazo agem sobre o desenvolvimento testicular propriamente dito e produção espermática (OLDHAM et al., 1978). MATOS et al. (1992) estudaram os efeitos de fatores ambientais sobre a circunferência escrotal de cordeiros Rambouillet, não encontrando efeitos da idade da mãe sobre a CE, mas observaram influência significativa do tipo e ano de parto, apenas nas idades mais jovens. Outro efeito importante é o manejo dos animais. Estes efeitos são eliminados quando se trabalha com grupos contemporâneos. MORAES (1997), estudando a avaliação reprodutiva do carneiro, observou que a CE só é válida como critério de seleção de reprodutores dentro de grupos contemporâneos, visando minimizar variações nas condições ambientais relativas às práticas de manejo. MORAES & OLIVEIRA (1998), estudando os componentes da variância sobre a CE, observaram que, aproximadamente, 50% da variância observada foram devidos às diferentes condições de criação dos animais Comprimento e Diâmetro Testiculares O CT e o DT apresentaram a mesma tendência que a CE, com variações de 2,64 ± 0,11 cm a 10,01 ± 0,16 cm e 1,82 ± 0,09 cm a 6,01 ± 0,11 cm entre 8 e 48 sem., respectivamente (Figuras 4 e 5). Entretanto, estas variações só foram significativas entre 12 e 36 sem. de idade. O fato do diâmetro testicular não ter crescido significativamente entre 8 e 12 sem. pode estar relacionado ao fato de que, em animais muito jovens, no início da espermatogênese, a taxa de crescimento testicular apresentam-se muito reduzidas (AMMAN & SCHANBACHER, 1983). YARNEY et al. (1990) mostraram que o diâmetro 56

79 testicular de carneiros Suffolk aos 6 7 meses não foi maior que aos meses de idade, apesar de um aumento de 60% no PV entre essas idades. Maiores CE e CT entre 8 e 36 sem. são provavelmente conseqüência de uma intensa proliferação das células germinativas e aumento de volume das células de Sertoli, nos túbulos seminíferos (CURTIS & AMMAN, 1981). Achados semelhantes para o comprimento testicular em cordeiros Santa Inês foram relatados (MOURA et al., 1999; SOUZA et al., 2001). FREITAS et al. (1991), estudando a biometria testicular de três raças de ovinos deslanados, conforme a faixa etária, observaram evolução entre as idades de 24 e 144 sem. No entanto, os autores não relataram se estas diferenças foram significativas. Para a raça Santa Inês, os valores variaram de 7,8 a 9,5 cm para o comprimento testicular e de 4,9 a 5,5 cm para o diâmetro. O comprimento aumentou ainda de 7,3 e 6,8 cm para 8,7 e 8,7 cm, enquanto o diâmetro foi de 4,8 e 4,5 cm para 5,1 e 5,2 cm, respectivamente, para as raças Morada Nova e Somalis, nas mesmas idades. Vale ressaltar que os menores valores encontrados para estas raças podem estar relacionados a seu menor porte. No entanto, os autores não relataram se havia diferenças significativas entre raças. Estas medições são importantes, uma vez que o diâmetro testicular tomado em animais jovens fornece indicação confiável do desempenho reprodutivo do animal adulto (YARNEY & SANFORD, 1993). 57

80 Comprimento Testicular (cm) h h h h h g f e d c a b Idade (semanas) FIGURA 4 Variação do comprimento testicular em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). Diâmetro Testicular (cm) 6,5 6 f,g f,g f,g g e e,f 5,5 d 5 4,5 c 4 b 3,5 3 a a 2, Idade (semanas) FIGURA 5 Variação do diâmetro testicular em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). A relação comprimento/diâmetro testicular (Figura 6) elevou-se entre 12 e 16 sem., mantendo-se constante entre 16 e 32 sem., e elevando-se novamente das 32 sem. em diante, mas sem variações significativas após esta idade. Estes dados mostram que o comprimento cresce mais rapidamente em 58

81 comparação ao diâmetro testicular na fase pré-púbere e em algumas semanas após a idade à puberdade até o início da maturidade sexual, quando este valor estabiliza-se, revelando que o crescimento do CT e do DT não ocorre de maneira uniforme, mas que esses valores se equilibram na pós-puberdade. Resultados para esta relação foram confirmados em touros Nelore por MOURA et al. (1999). CURTIS & AMMAN (1981) mostraram que, em touros Holandeses, o comprimento dos túbulos seminíferos aumenta significativamente na fase de pré-puberdade, juntamente com as concentrações de testosterona. Entretanto, estes autores não puderam relacionar de que modo estes fenômenos definem o formato testicular. 1,8 Circunferência Escrotal (cm) 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 a a b,c b b b c c c c c c 1, Idade (semanas) FIGURA 6 Variação da relação comprimento/diâmetro testicular em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05) Peso Testicular O peso testicular apresenta uma curva de crescimento parecida com a da circunferência escrotal. Os aumentos são pequenos entre 4 e 12 sem. de idade, sendo aparentes e significativos entre 12 e 30 sem. de idade, paralelamente aos níveis de testosterona (YARNEY & SANFORD, 1989). Os valores médios de 59

82 peso testicular e epididimal às 50 sem. foram 191,25 ± 7,40 g e 29,93 ± 1,20 g respectivamente, sendo que a primeira variável correspondeu a 0,38 ± 0,1% do peso corporal. Os valores referentes a diâmetro e comprimento testicular foram 9,23 ± 0,18 e 6,35 ± 0,91 cm, respectivamente, e 184,59 ± 8,22 ml para volume testicular. Valores detalhados para as duas gônadas são apresentados na Tabela 1. Não existem estudos dessa natureza em carneiros da raça Santa Inês. Contudo, QUEIROZ & CARDOSO (1989), trabalhando com ovinos deslanados adultos, sem raça definida, encontraram valores médios de 90,3 g e 127,1 g para o peso testicular de animais abatidos nos meses de junho e novembro, o que corresponde a 47,2 e 66,4% do valor descrito no presente estudo. Possivelmente, esta superioridade pode refletir efeitos de diferenças nutricionais, uma vez que os animais, no referido estudo, foram criados a pasto. Os animais abatidos em junho sofreram efeito da estiagem que, na referida região, vai de abril a setembro, enquanto os últimos aproveitaram a estação chuvosa. BIELLI et al. (2000), comparando os efeitos da nutrição sobre o desenvolvimento testicular de carneiros Corriedale, observaram que animais suplementados a pasto durante a prenhez e os primeiros 100 dias de vida apresentaram melhor desenvolvimento testicular biométrica e histologicamente, comparados aos criados sem suplementação. Já em animais lanados, os valores para peso testicular variaram de 10 a 41 g, em ovinos Corriedale às 25 sem. de idade criados a pasto (BIELLI et al., 2001) e de 130 a 275 g para animais com pelo menos 144 sem. de idade, da mesma raça, respectivamente, para animais criados em pastagem nativa ou em pastagem melhorada com suplementação (BIELLI et al., 1999). HOCHEREAU- DE-REVIERS et al. (1990) obtiveram valores médios para peso testicular de

83 e 255 g, respectivamente, para animais das raças Romanov e Ile-de-France, às 72 sem. de vida. Já em cordeiros Suffolk às 24 sem. de vida, WROBEL et al. (1995) encontraram peso testicular de 113 g. Estes achados ilustram que o peso testicular apresenta grandes variações em diferentes raças. Isto sugere que componentes genéticos sejam importantes na determinação desta variável. Nesse sentido, CHUBB (1992) estudou a ação de determinados genes sobre o desenvolvimento testicular em camundongos. Ele encontrou dois genes autossômicos cuja expressão estava relacionada com as diferenças no peso testicular entre linhagens, devido a uma diferença na população das células de Sertoli. Esta regulação se dava sobre a atividade mitótica dos precursores destas células na pré-puberdade. A população de células de Sertoli está correlacionada com o tamanho testicular adulto (SHARPE, 1994) em diversas espécies, incluindo os ovinos (BIELLI et al., 2000). A multiplicação dessas células cessa por ocasião da puberdade, e seu número define o número máximo de células germinativas que um animal pode produzir. Um mecanismo genético semelhante ao que existe em camundongos deve existir em ovinos, explicando as diferenças observadas em relação ao peso testicular nas diferentes raças. Foi demonstrado que o aumento do peso testicular é dependente do FSH, uma vez que cordeiros Ile-de-France imunizados contra o FSH, entre o nascimento e 24 sem. de idade, apresentaram pesos testiculares significativamente menores ao longo de todo o período em relação àqueles não imunizados (KILGOUR et al., 1998) Volume Testicular Com relação ao volume testicular, cordeiros Corriedale às 25 sem. de vida apresentaram valores de 9,5 ml a 41 ml (BIELLI et al., 2001), enquanto os animais adultos apresentaram volumes de 147 a 272 ml (BIELLI et al., 1999). Já em animais Suffolk, esse valor correspondeu, em média, a 101 ml para 61

84 animais de 6 a 7 meses de idade (WROBEL et al., 1995), mostrando variações semelhantes àquelas observadas para o peso testicular. O volume ocupado pelo parênquima testicular foi de 164,3 ml (TABELA 2). Este valor foi maior que o encontrado em cordeiros recém-púberes (WROBEL et al., 1995). O volume ocupado pelos túbulos seminíferos é praticamente constante no feto, apresentando relação linear com o peso testicular (COUROT, 1971), quando constituem de 40 a 50% do volume testicular. Entre o feto e o nascimento, ele aumenta lentamente (cerca de 90X). Entre o nascimento e 11 sem. de vida, seu volume continua aumentando (1000X). Contudo, sua taxa máxima de crescimento ocorre por volta da puberdade, às 22 sem. de vida ( X) (COUROT, 1971) Densidade Testicular Já a densidade testicular, em ovinos Santa Inês, foi estimada em 1,04 g/ml. Em ovinos Corriedale, foram encontrados valores de 1,01 a 1,02 g/ml para animais de 25 sem. (BIELLI et al., 2001) e 0,93 a 1,01 g/ml para animais adultos (BIELLI et al., 1999), sugerindo que os testículos de carneiros Santa Inês são mais densamente ocupados que aqueles de animais Corriedale. Estas diferenças podem estar relacionadas ao regime alimentar dos animais (GASTEL et al., 1995), contudo, estudos específicos precisam ser realizados para explicar esta diferença. 62

85 TABELA 1: Biometria testicular de carneiros da raça Santa Inês abatidos às 50 semanas de idade (X ± EPM) Parâmetro Testículo Direito Esquerdo Médio Peso (g) 192,40 ± 7,65 190,11 ± 7,38 191,25 ± 7,40 Comprimento (cm) 9,29 ± 0,18 9,17 ± 0,20 9,23 ± 0,18 Diâmetro (cm) 6,31 ± 0,10 6,39 ± 0,10 6,35 ± 0,09 Volume (ml) 183,78 ± 8,51 185,39 ± 8,54 184,59 ± 8,22 Volume Parênquima (ml) 163,57 ± 7,58 165,02 ± 7,59 164,28 ± 7,32 Densidade (g/ml) 1,03 ± 0,02 1,06 ± 0,03 1,04 ± 0, Concentrações Periféricas de Testosterona As concentrações basais de testosterona elevaram-se progressivamente entre 9 e 32 sem., de 0,37 ± 0,07 para 1,35 ± 0,23 ng/ml (FIGURA 7) e, a partir dessa idade, houve aumentos maiores até 42 sem., quando ocorreu o pico (2,99 ± 0,34 ng/ml). Daí em diante, sua concentração reduziu-se a um valor equivalente àquele detectado às 32 sem. A redução na secreção de testosterona após às 42 sem. pode ser conseqüência dos próprios níveis elevados na corrente sanguínea antes dessa idade, os quais são aromatizados a estradiol no sistema nervoso central, exercendo efeito negativo sobre o hipotálamo (AUCLAIR et al., 1995; SCOTT et al., 1997) e hipófise (OLSTER & FOSTER, 1986). Este é o primeiro relato sobre concentrações de testosterona na raça Santa Inês, contudo, os achados deste estudo são equivalentes àqueles relatados por LEE et al. (1976) para ovinos em desenvolvimento (0,24 a 3,02 ng/ml). 63

86 Testosterona (ng/ml) 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 c d d b b,d a Idade (semanas) FIGURA 7 Concentrações plasmáticas basais de testosterona em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). Estes resultados confirmam os achados em cordeiros Merino entre 14 e 30 sem. de idade (AUCLAIR et al., 1995) e em cordeiros Ile-de-France (CARREAU et al., 1984) entre 7 e 34 sem. de idade que apresentaram concentrações crescentes de testosterona plasmática. YARNEY & SANFORD (1989) observaram que, em cordeiros entre 8 e 29 sem. de idade, as concentrações plasmáticas de testosterona elevaram-se paralelamente ao peso testicular dos animais. Foi constatado que o aumento na testosteronemia foi devido a um aumento paralelo do número de sítios de ligação para FSH e LH no testículo e nas concentrações basais de LH. As concentrações crescentes de LH estimulam as células de Leydig a secretar testosterona (BEARDEN & FUQUAY, 1992). LANGFORD et al. (1998), trabalhando com as raças Canadian, Outaouais, Rideau e Finnish Landrace, observaram aumentos significativos nas concentrações de testosterona entre 24 e 32 sem. de vida. Eles observaram ainda que em todas as raças, as concentrações de 64

87 testosterona às 48 sem. não foram significativamente diferentes daquelas às 32 sem., apesar de serem numericamente menores. De uma forma geral, diversos estudos referentes à secreção de testosterona em carneiros mostraram que existe uma aumento em suas concentrações plasmáticas com a idade, até os 12 meses de idade. BIELLI et al. (2001), trabalhando com cordeiros Corriedale entre 6 e 14 sem. de idade, encontraram valores de 0,001 a 0,2 ng/ml, enquanto em animais com pelo menos 144 sem., desta raça, a testosteronemia varia de 0,05 a 1,19 ng/ml (BIELLI et al., 1999). Do mesmo modo, VALENTIM et al. (1995) encontraram valores de 0,2 a 1,3 ng/ml em borregos da raça Churra antes de 26 sem. de idade, e valores de 0,2 a 2,8 ng/ml após as 26 sem. Entretanto, LAFORTUNE et al. (1984) obtiveram valores de 2,0 a 4,51 e 0,4 a 1,19 ng/ml, respectivamente, para as raças Romanov e Ile-de-France, à 1 e às 12 sem. de vida. Estes trabalhos mostram que, de uma maneira geral, as concentrações de testosterona elevam-se entre o nascimento e a pós-puberdade. Entretanto, alguns desses trabalhos não permitiram determinar um pico para a secreção desse hormônio. Isso pode estar relacionado ao número de coletas e ao intervalo entre as coletas Parâmetros Seminais Volume Ejaculado No presente estudo, a proporção de carneiros cujo sêmen pôde ser colhido aumentou com a idade. Às 16 sem., apenas cerca de 20% dos animais chegavam a ejacular, enquanto que às 42 sem., todos os animais ejaculavam normalmente. O volume ejaculado aumentou significativamente entre as 15 sem. e as 24 sem. de idade, por ocasião da puberdade. A partir daí, apresentou aumento contínuo até 48 sem. de vida (FIGURA 8). 65

88 2,5 Volume Ejaculado (ml) 2 1,5 1 0,5 0 a, b, c, d a, c b, c, d c d c e, f d, e Idade (semanas) f f f g FIGURA 8 Volume ejaculado de sêmen colhido por eletroejaculação em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). A coleta de sêmen por eletroejaculação em carneiros foi descrita inicialmente por GUNN (1936) e pode ser utilizada rotineiramente (até mais de uma vez ao dia) sem danos à saúde dos animais (WHITE, 1977; EVANS & MAXWELL, 1987). RODRIGUES et al. (1997) mostraram não haver diferenças na qualidade do sêmen de caprinos, para os parâmetros de volume ejaculado, motilidade, concentração espermática e ph, comparando os métodos de vagina artificial e eletroejaculação para colheita de sêmen de caprinos. Além disso, em um estudo sobre as características seminais de cabritos da raça Saanen entre o nascimento e 44 sem. de idade, utilizavam a eletroejaculação ou vagina artificial para colheita do sêmen dos animais sem discriminar o método de colheita quando da avaliação dos dados (BECKER-SILVA et al., 1999). Vários trabalhos têm demonstrado que os efeitos da idade sobre o volume ejaculado são mais pronunciados em animais jovens. No entanto, em animais acima de 48 sem. de idade esse efeito não foi demonstrado (MORAES et al., 1981; VIVANCO et al., 1986; FREITAS & NUNES, 1992). O fato de 66

89 SALGUEIRO & NUNES (1999) não terem encontrado resultado superior aos nossos em carneiros Santa Inês com 81 sem. de idade, confirma a ausência de efeitos da idade sobre este parâmetro em animais com mais de 48 sem. de idade. Os nossos achados validam os resultados obtidos anteriormente em cordeiros jovens da raça Santa Inês (SOUZA et al., 2000) mostrando uma tendência de crescimento acentuado desse parâmetro entre a puberdade e as 48 sem. de idade. Esta técnica, embora cause algum desconforto momentâneo aos animais (CAMERON, 1977), é a mais indicada para o estudo de animais prépúberes, pois permite que se evidencie os primeiros ejaculados, mesmo antes do desprendimento total entre o pênis e o prepúcio dos animais, sem quaisquer danos à sua saúde Motilidade Massal Embora os animais começassem a ejacular às 15 sem., ejaculados com motilidade massal só foram detectados às 21 sem. (FIGURA 9) e, a partir desta idade, os aumentos foram significativos entre 21 e 24 sem., com uma fase de crescimento rápido, e entre 27 e 48 sem., com crescimento mais lento, tendendo à estabilização. Do mesmo modo que o volume ejaculado, estudos mostram que os efeitos da idade são mais pronunciados até umas poucas semanas após a puberdade. De fato, em carneiros Santa Inês com 81 sem. de idade, SALGUEIRO & NUNES (1999) encontraram valor médio de 3,72 para motilidade massal. Este valor não foi maior que o encontrado às 48 sem. em nosso estudo. 67

90 Motilidade Massal (0-5) 5 4,5 4 3,5 3 c c c 2,5 c c c 2 b b 1,5 1 0,5 a a a Idade (semanas) d FIGURA 9 Variações na motilidade massal do sêmen em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). Dentre os vários parâmetros utilizados para a avaliação da qualidade seminal em ovinos, a motilidade massal define o movimento em massa dos espermatozóides, resultando de uma interação entre a motilidade e concentração espermática. Este parâmetro é bastante útil por ocasião de uma avaliação inicial de grandes grupos de animais ainda não selecionados para reprodução, para escolha daqueles que serão submetidos a exames mais detalhados. No entanto, a motilidade massal pode não ser precisa o suficiente para distinguir pequenas diferenças de qualidade espermática entre reprodutores (CHEMINEAU et al., 1991) Motilidade Os primeiros espermatozóides no ejaculado ocorreram em média às 23,05 ± 0,94 sem. de idade, quando os animais apresentavam 28,08 ± 0,99 kg e CE de 22,44 ± 0,42 cm. Contudo, os primeiros espermatozóides móveis só apareceram às 23,94 ± 0,98 sem., com os parâmetros de 28,63 ± 1,05 kg e 22,72 ± 0,44 cm, respectivamente para peso corporal e circunferência 68

91 escrotal. Houve animais que apresentaram espermatozóides no ejaculado já às 18 sem. de idade, e um outro animal só veio a ejacular espermatozóides às 28 sem. A motilidade elevou-se significativamente de 0 para 12,5 ± 7,5% entre 15 e 18 sem. e de 42,7 ± 7,6 para 65,6 ± 4,4% entre 27 e 30 sem., atingindo 76,25 ± 2,4% às 48 sem. (FIGURA 10). Em resumo, os aumentos na motilidade espermática foram mais pronunciados nas fases pré-púbere e púbere, sendo mais discretos após esta fase. Motilidade (%) d d d d d d c c b 10 a b Idade (semanas) e FIGURA 10 Variações na motilidade do sêmen em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). A motilidade espermática é essencial para que o espermatozóide atravesse o trato genital feminino e se desloque até o oviduto, para fertilizar o ovócito (CAMERON, 1977). Este parâmetro é especialmente importante em ovinos, devido a particularidades anatômicas da cérvix (EVANS & MAXWELL, 1987), e deve ser avaliado regularmente devido aos seus efeitos sobre a fertilidade do rebanho (VIVANCO et al., 1986). Essa tendência de menores aumentos na motilidade após a puberdade é confirmada pelos resultados de SALGUEIRO & NUNES (1999), com valor 69

92 médio de 85% para este parâmetro em ovinos Santa Inês com 81 sem. de idade. De fato, as características seminais de animais jovens tendem a melhorar com a idade (WIEMER & RUTTLE, 1987). Esta melhora se dá, em parte, devido ao crescimento e amadurecimento testicular (COUROT, 1979), caracterizado por maior secreção de testosterona. De maneira semelhante, o percentual de espermatozóides progressivamente móveis (MOP) e o vigor espermático (FIGURAS 11 e 12) aumentaram gradativamente até 27 sem., mas somente entre 27 e 30 sem. houve aumento significativo. A partir de 30 sem., esse valor tendeu a aumentar com a idade, mas as diferenças não foram significativas. Motilidade Progressiva (%) b b b 60 b b b a a a a a Idade (semanas) b FIGURA 11 Variações na motilidade progressiva do sêmen em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). 70

93 Vigor Espermático (0-5) 5 4,5 4 3,5 b b b 3 b b b 2,5 a 2 a 1,5 1 a a a 0, Idade (semanas) b FIGURA 12 Variações no vigor espermático em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). Enquanto a MOP caracteriza o percentual de espermatozóides com motilidade progressiva, o vigor qualifica esse movimento, conferindo notas subjetivas para sua intensidade. Os valores obtidos nesse trabalho a partir de 30 sem. de idade estão de acordo com os observados nesta raça (SOUZA et al., 2000) Concentração Espermática A concentração espermática dos animais na fase recém-púbere foi muito baixa, elevando-se significativamente após as 30 sem. de idade. Entre 30 e 42 sem. este valor permaneceu estável, aumentando novamente após as 44 sem. (FIGURA 13), quando ultrapassou 1,0 x 10 9 de espermatozóides por mililitro de sêmen ejaculado. A concentração espermática é uma característica de grande importância, especialmente quando do uso da IA, uma vez que a taxa de diluição e o número de palhetas de sêmen produzidas dependem dela (EVANS & MAXWELL, 1987). Em ovinos, devido a particularidades anatômicas da cérvix, o uso de sêmen congelado por via cervical não é indicado. No entanto, uma estratégia comum 71

94 tem sido aumentar a concentração espermática nas palhetas (SALAMON & MAXWELL, 2000), uma vez que resulta em maior número de espermatozóides viáveis, compensando os danos sofridos durante o congelamento/descongelamento (GIL et al., 2002). Concentração Espermática (x10 9 /ml) 1,4 1,2 1 c 0,8 c 0,6 0,4 b b b b 0,2 a a a a a Idade (semanas) c FIGURA 13 Variações na concentração espermática em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). Nossos resultados demonstraram valores muito baixos de concentração espermática até as 27 sem. de idade, contra-indicando seu uso para reprodução. Entretanto, a partir de 42 sem. de idade, este parâmetro atingiu valores que permitem a utilização dos animais. A partir dessa idade, houve uma tendência a aumentos (P = 0,07), mas sem resultados significativos. Do mesmo modo, REGE et al. (2000) demonstraram que a concentração espermática aumenta paralelamente à idade entre 36 e 48 sem. de vida em cordeiros. Estudos em animais sem raça definida (FREITAS & NUNES, 1992) e Santa Inês (SALGUEIRO & NUNES, 1999) acima de 48 sem. de idade mostraram valores mais elevados de concentração espermática, mostrando que os valores poderiam ainda aumentar até a maturidade sexual dos animais. 72

95 Patologias Espermáticas O percentual de alterações morfológicas é um exame detalhado de qualidade seminal. Todos os ejaculados contêm alguns espermatozóides anormais, mas amostras com alto percentual normalmente resultam em baixa fertilidade (EVANS & MAXWELL, 1987). Às 15 sem. de idade, os animais apresentavam cerca de 88% de espermatozóides defeituosos, este percentual reduziu-se significativamente entre 24 sem. e 27 sem. e entre 33 e 36 sem., atingindo 15% e estabilizando-se daí em diante (FIGURA 14). REGE et al. (2000) encontraram redução significativa neste percentual entre 24 e 48 sem. de idade em ovinos nativos da Etiópia, evidenciando o importante efeito da idade sobre este parâmetro em animais jovens. Apesar dos resultados mostrarem valores compatíveis com aqueles de animais adultos, a partir de 36 sem. de idade, diversos estudos mostraram que estes valores poderiam ser ainda menores, uma vez atingida a maturidade sexual (FREITAS & NUNES, 1992; MANDIKI et al., 1998). Alterações Morfológicas (%) a 80 a a a, b b 40 b, c c 30 d d d 20 d 10 d Idade (semanas) FIGURA 14 Variações no percentual de alterações morfológicas no sêmen em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). 73

96 4.5. Parâmetros Bioquímicos do Sêmen ph Seminal O equilíbrio bioquímico do sêmen é essencial para a manutenção de sua qualidade (PINHEIRO et al., 1996). Segundo QUINN & WHITE (1968), o ph seminal pode influenciar na susceptibilidade seminal ao choque térmico. Ele é determinado, entre outros, pela presença de ácido cítrico e ácido láctico no plasma seminal. O ácido cítrico é um componente normal do plasma seminal de ruminantes, secretado pelas glândulas vesiculares sob estímulo da testosterona (MACHADO et al., 1999), enquanto o ácido láctico é resultado do metabolismo anaeróbico da frutose pelos espermatozóides (WHITE, 1977). O sêmen dos animais jovens apresentou-se bastante alcalino às 15 sem. 9,00 ± 0,00, havendo redução significativa desse valor a partir de 30 sem de idade (FIGURA 15), até atingir 8,00 ± 0,17 às 48 sem. De fato, o decréscimo dos valores de ph coincide com aumentos na concentração espermática dos animais, levando a uma maior produção de ácido láctico, e com maior secreção de testosterona. ph 9,2 a 9 a 8,8 a a a 8,6 8,4 b b b 8,2 b b 8 b 7, Idade (semanas) c FIGURA 15 Variações no ph do sêmen em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). 74

97 EL-AZAB et al. (1998), trabalhando com cordeiros Rhamani entre 24 e 32 sem. de vida, encontraram valores de ph variando de 6,6 a 6,9. No entanto, esses animais apresentavam maior concentração espermática (1,7 a 2,4 x 10 9 /ml). Além disso, os animais foram alimentados com volumoso amonizado, que exerce um abaixamento significativo sobre o ph. Estudos em diversas raças, com animais acima de 48 sem. de idade, têm mostrado valores de ph na faixa de 6,5 a 7,0 (MORAES et al., 1981; FREITAS & NUNES, 1992; IBRAHIM et al., 1997) Entretanto, em todos esses estudos, a concentração espermática dos animais estava bem acima daquela encontrada em nossos animais. Baseando-se nos resultados de SALGUEIRO & NUNES (1999) para concentração espermática em carneiros Santa Inês com 81 sem. de idade, seria de se esperar que a concentração espermática dos animais aumentasse à medida que atingissem a maturidade sexual, levando à conseqüente redução nos valores de ph seminal. Vale ressaltar que mesmo esses valores mais elevados de ph não causaram danos ao metabolismo espermático, uma vez que os demais parâmetros seminais estavam dentro da faixa preconizada para animais desta raça. Esses resultados validam achados anteriores para esta raça (SOUZA et al., 2000) para os diversos parâmetros seminais, em animais manejados de forma semelhante, mostrando que, após 30 sem. de idade, ocorre melhora consistente nas características seminais dos animais, permitindo seu uso como reprodutores somente após esta idade. 75

98 Proteínas Seminais Totais A concentração protéica total do plasma seminal elevou-se gradualmente até às 24 sem. de idade (FIGURA 16). Os aumentos foram mais pronunciados entre 15 e 18 sem. (3,00 ± 0,00 para 14,16 ± 3,46 mg/ml) e entre 38 e 48 sem. de vida (14,93 ± 1,16 para 19,95 ± 0,88 mg/ml). Concentrações de proteínas no plasma seminal variando de 0,7 a 2,1 mg/ml são capazes de reduzir os danos causados a espermatozóides ovinos pelo processo de congelamento dessas células (PÉREZ-PÉ et al., 2001). Estes resultados foram confirmados por BARRIOS et al. (2000) e AZEREDO et al. (2001), que observaram que algumas frações protéicas do plasma seminal são capazes de recuperar a ultra-estrutura e permeabilidade da membrana de espermatozóides já danificados pelo congelamento. 25 Proteína (mg/ml) 20 b, c b, c b, c c c b 15 b b b b 10 5 a Idade (semanas) c FIGURA 16 Variações na concentração protéica do sêmen em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês. Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias. Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05). Conforme observado, a concentração de proteínas seminais cresce em paralelo com os níveis plasmáticos de testosterona, desenvolvimento sexual e produção de espermatozóides. Inúmeras proteínas presentes no plasma 76

99 seminal foram associadas aos parâmetros de qualidade do sêmen (KILLIAN et al., 1993; SPROTT et al., 2000; FOUCHÉCOURT et al., 1999; 2002; LA FALCI et al., 2002). Dentre elas, a ABP (androgen-binding protein) (JÉGOU et al., 1979) é secretada pelas células de Sertoli (HAGENAS et al., 1975; COUROT, 1980) e é responsável pelo transporte e concentração de andrógenos nos testículos e epidídimos (HANSSON et al., 1975; COUROT, 1980; CARREAU et al., 1984), onde estimulam a síntese de receptores de andrógenos, afetando os processos de espermatogênese e maturação espermática epididimal (COUROT, 1980). De fato, o epidídimo possui inúmeros receptores para hormônios esteróides, especialmente receptores para andrógenos. A testosterona penetra nas células e é convertida em 5α-dihidrotestosterona (DHT) pela 5α-redutase (LINDZEY et al., 1993). A DHT modula a expressão de inúmeras proteínas epididimais andrógeno dependentes (FOURNIER-DELPECH et al., 1981; RODRÍGUEZ et al., 2001). CARREAU et al. (1984) demonstraram que em animais de 7 sem. de idade as regiões do epidídimo apresentam-se indiferenciadas, e a ABP não é detectável. Por ocasião da puberdade, quando se inicia a diferenciação das células epididimais, observou-se concentrações crescentes de testosterona plasmática e no conteúdo epididimal de ABP e testosterona. Nessa ocasião, inicia-se a secreção de uma série de proteínas e glicoproteínas estimuladas pela testosterona (FOURNIER-DELPECH & COUROT, 1980; FOUCHÉCOURT et al., 1999). Entre elas, a prealbumin epididymal specific (PES 64 kda) liga-se à região periacrossômica de espermatozóides imaturos e permanece ligada mesmo após a ejaculação, podendo estar envolvida nos processos de reação acrossômica (FOURNIER- DELPECH et al., 1988ab). A testosterona ativa também a função secretória 77

100 das glândulas sexuais acessórias (SALISBURY et al., 1978), as quais também contribuem com a composição protéica do plasma seminal (HENAULT et al., 1995). Entre outros fatores, a secreção dessas proteínas é bastante influenciada pelo plano nutricional dos animais. EL-AZAB et al. (1998) observaram que sua concentração elevou-se de 16,1 mg/ml para 39 mg/ml devido a amonização do volumoso, de maneira dose dependente. Possivelmente, o aumento do total de proteína bruta das dietas foi responsável por esse crescimento na secreção protéica. PINHEIRO et al. (1996) observaram comportamento idêntico em caprinos, com diferença significativa na secreção protéica do plasma seminal ao longo do ano, sendo maior na estação chuvosa (42,7 mg/ml) que na seca (34,1 mg/ml). Essas proteínas têm ação tamponante, auxiliando na regulação de osmolaridade e ph seminal (EL-AZAB et al., 1998; MACHADO et al., 1999). Entretanto, apesar do aumento na secreção protéica, o ph seminal reduziu-se no mesmo período. Este achado, aparentemente contraditório, explica-se pelo fato de que a concentração espermática cresceu em magnitude muito maior que a protéica, sobrepujando sua capacidade tamponante. De fato, com o aumento da idade e da concentração protéica, os valores de ph devem cair para sua faixa normal, entre 6,4 e 7,2 (MORAES et al., 1981; PINHEIRO et al., 1996). Esta queda é vantajosa para os espermatozóides, pois a frutólise torna-se mais lenta, reduzindo o consumo de nutrientes (MANN, 1975). Nossos achados são semelhantes àqueles descritos por EL-AZAB et al. (1998), que observaram redução no ph de animais alimentados com volumoso amonizado em comparação àqueles sem amonização, apesar de um aumento na secreção protéica, devido a aumentos na concentração espermática, e àqueles 78

101 relatados por EL-CHAHIDA et al. (1977), que observaram correlação negativa entre a concentração espermática e o ph seminal. O presente trabalho é pioneiro na descrição detalhada de aspectos ligados ao desenvolvimento sexual de cordeiros da raça Santa Inês durante o primeiro ano de vida, incluindo aspectos de desenvolvimento ponderal, testicular, secreção de testosterona, qualidade do sêmen e proteínas do plasma seminal. Os resultados mostram que à medida que aumentos do peso vivo dos animais a partir de 8 semanas de idade são acompanhados por crescimento testicular, avaliado pelo comprimento, diâmetro e circunferência escrotal até cerca de 36 sem. de idade, quando estes valores se estabilizam, apesar do aumento contínuo no peso vivo. O crescimento testicular é acompanhado por aumento na secreção de testosterona, que atingiu um pico às 42 sem. de idade, e pelo aparecimento de espermatozóides no ejaculado dos animais a partir de 23 sem. de idade. Daí em diante, os animais apresentaram uma fase onde a qualidade seminal melhora rapidamente, entre 23 e 30 sem. de idade. A partir de 36 sem. de idade, os animais já apresentavam qualidade seminal típica de animais maduros, à exceção da concentração espermática, cujos maiores aumentos se deram um pouco mais tarde. Esta sincronia entre o crescimento testicular, secreção de testosterona e produção espermática resultou ainda num aumento gradual na concentração total de proteínas no plasma seminal. Esta elevação na concentração protéica se deve, em parte, a uma ativação da diferenciação celular no epidídimo e glândulas sexuais acessórias, mediadas pela testosterona, que ocorre por volta da puberdade (CARREAU et al., 1984) e que resulta em um processo ativo de secreção protéica. 79

102 Perfil Eletroforético do Plasma Seminal Com relação à análise eletroforética, existe uma grande abundância de proteínas no plasma seminal. Uma ampla gama de proteínas foi detectada, variando de 5,9 a 170 kda. Em todas as idades, as proteínas de massa molecular abaixo de 10 kda foram as mais abundantes. Entre elas, aquelas com massa molecular de 8,7 a 9,5; 16-16,6 kda e 21 kda estavam sempre presentes entre 15 e 33 sem. de idade (FIGURA 17). A B C D E F G H kda 16 a 16,6 kda 8,7 a 9,5 kda FIGURA 17 Perfil protéico do plasma seminal determinado em SDS-PAGE de ovinos da raça Santa Inês às 33 sem. de idade. As amostras A G correspondem a diferentes animais. H corresponde aos marcadores moleculares, variando de 10 a 250 kda. THÉRIEN et al., (1998; 1999) identificaram uma proteína de massa molecular de 16-16,5 kda presente no plasma seminal bovino, denominada BSP A3. Esta proteína estava relacionada a alterações sofridas na membrana espermática associadas ao processo de capacitação. Com relação à proteína de 21 kda, FOUCHÉCOURT et al. (2002) identificaram no plasma seminal ovino uma proteína de massa molecular 21,1 kda, composta de 191 aminoácidos e 80

103 identificada como sendo a enzima prostaglandina-d-sintetase. Em touros, KILLIAN et al. (1993) observaram que animais com maior abundância dessa proteína no plasma seminal apresentaram maior taxa de fertilidade após IA com sêmen congelado. Entretanto, em bovinos, ela apresenta massa de 26 kda. Aquelas com massa molecular acima de 70 kda apresentaram grande variação entre idades e entre animais. Possivelmente, elas constituíam complexos protéicos maiores e, à medida que os animais se desenvolviam foram hidrolisados ou glicosilados para sua ativação. No entanto, uma banda com massa molecular de 86 kda era característica de animais a partir de 30 sem. de idade, quando os parâmetros seminais, como um todo, começaram a apresentar melhoras significativas. Foi detectado que às 28 sem. de idade, animais que apresentavam maior motilidade massal e motilidade progressiva (acima de 2,5 e 62%, respectivamente) apresentavam uma banda de massa molecular de 64 kda. Essa banda estava presente apenas em um animal com parâmetros inferiores a estes. FOURNIER-DELPECH et al. (1988ab) observaram que animais após 25 sem. de idade passavam a apresentar uma proteína epididimal de 64 kda, denominada PES, a qual se ligava aos espermatozóides, e permanecia ligada, mesmo após a ejaculação. Levantou-se a hipótese de essa proteína estar associada aos processos de reação acrossômica, uma vez que ela se ligava à região periacrossômica, mas seu mecanismo de ação ou outras funções não foram elucidadas. A partir de 30 sem. de idade, essa proteína passou a ser expressa por maior número de animais, coincidindo com melhora nos parâmetros seminais, e não era mais exclusiva dos animais com os maiores valores de motilidade. Possivelmente, a partir de 30 sem. de idade, como essa 81

104 proteína passou a ser expressa por um maior número de animais, sua ligação com a motilidade não foi mais evidente. De fato, a motilidade espermática é dependente de vários outros fatores (MORAES et al., 1981). Detectou-se, ainda, que uma proteína de 74,3 kda era secretada no plasma seminal às 33 sem. de idade somente naqueles animais com maior número de células de Sertoli por testículo (FIGURA 18). IBRAHIM et al. (1999) identificaram a clusterina no plasma seminal bovino com massa molecular de 74 kda, secretada pelas células de Sertoli e presente no fluido da cauda do epidídimo. É possível que esta proteína de massa molecular 74,3 kda seja a clusterina. Entretanto, análises mais detalhadas, incluindo focalização isoelétrica e sequenciamento, precisam ser realizadas para confirmar sua identidade. A B C D E F G H FIGURA 18 Perfil protéico do plasma seminal determinado em SDS-PAGE de ovinos da raça Santa Inês às 33 sem. de idade. As amostras A e D correspondem a animais com menor população de células de Sertoli. B, C, F e G são amostras pertencentes àqueles animais com maior população destas células. H corresponde aos marcadores moleculares, variando de 10 a 250 kda. A seta corresponde à banda do fragmento de 74,3 kda. 82