ESTIRPES BRASILEIRAS DE Bacillus thuringiensis EFETIVAS NO CONTROLE BIOLÓGICO DA TRAÇA- DAS-CRUCÍFERAS Plutella xylostella.

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical ESTIRPES BRASILEIRAS DE Bacillus thuringiensis EFETIVAS NO CONTROLE BIOLÓGICO DA TRAÇA- DAS-CRUCÍFERAS Plutella xylostella. PATRÍCIA TELES MEDEIROS CUIABÁ-MT 2004

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical ESTIRPES BRASILEIRAS DE Bacillus thuringiensis EFETIVAS NO CONTROLE BIOLÓGICO DA TRAÇA- DAS-CRUCÍFERAS Plutella xylostella. PATRÍCIA TELES MEDEIROS Engª Agrônoma ORIENTADORES: PROF. DR. MÁRCIO DO NASCIMENTO FERREIRA / UFMT Drª. ROSE MONNERAT SOLON DE PONTES / EMBRAPA-DF Dissertação apresentada à Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso, para a obtenção do título de Mestre em Agricultura Tropical. CUIABÁ-MT 2004

3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical CERTIFICADO DE APROVAÇÃO Título: ESTIRPES BRASILEIRAS DE Bacillus thuringiensis EFETIVAS NO CONTROLE BIOLÓGICO DA TRAÇA-DAS- CRUCÍFERAS Plutella xylostella. Autora: PATRÍCIA TELES MEDEIROS Orientador: Dr. MÁRCIO DO NASCIMENTO FERREIRA Aprovada em 20 de abril de 2004 COMISSÃO EXAMINADORA: Prof. Márcio do Nascimento Ferreira, Dr. (FAMEV/UFMT) (Orientador) Prof. Rose S. P. Monnerat, PhD (CENARGEN-EMBRAPA/DF) (Co-orientadora) Profª. Leimi Kobayasti, Dra. (FAMEV/UFMT) (Examinadora) Dr. Jeferson Luís Dallabona Dombroski Dr.(FAMEV/UFMT) (Examinador)

4 SUMÁRIO Capítulo Página LISTA DE FIGURAS... LISTA DE TABELAS... LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS... RESUMO... ABSTRACT INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Traça-das-crucíferas (Plutella xylostella (L.) Lep.: Plutellidae) Características Gerais Bioecologia da traça-das-crucíferas Estratégias de controle para P. xylostella Controle biológico através de microrganismos Aspectos Biológicos de Bacillus thuringiensis Toxinas do cristal ou δ-endotoxinas Modo de ação das toxinas de B.thuringiensis Técnicas bioquímicas e moleculares para a caracterização de Bacillus thuringiensis Sorologia Flagelar Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) Técnica de Eletroforese Resistência de insetos a B. thuringiensis Formas de utilização de B. thuringiensis MATERIAL E MÉTODOS Criação Massal da Traça-das-crucíferas Coletas a campo 36

5 3.1.2 Triagem das cabeças Procedimentos durante as fases de desenvolvimento de P. xylostella Origem das estirpes utilizadas de Bacillus thuringiensis Teste de Patogenicidade - Bioensaio Seletivo Caracterização das estirpes Morfológica de Bacillus thuringiensis Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 10%) Extração do complexo esporo-cristal das estirpes de Bacillus thuringiensis Análise das proteínas Cry de B. thuringiensis em gel de Poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) Identificação de genes cry por meio de PCR Caracterização Morfológica via Microscopia Eletrônica de varredura Testes de campo para a avaliação da susceptibilidade de P. xylostella à produtos formulados a base de B. thuringiensis em cultivo de repolho (Brassica oleracea var. capitata) Experimento I Campo experimental de Brazlândia-DF Experimento II - Campo experimental da Embrapa-DF RESULTADOS E DISCUSSÃO Criação Massal da Traça-das-Crucíferas (P. xylostella) (L.) 51 (Lep.:Plutellidae) Teste de Patogenicidade Caracterização morfológica das estirpes de Bacillus thuringiensis Análise de proteínas Cry de Bacillus thuringiensis Caracterização molecular por meio da PCR Microscopia eletrônica de varredura Testes de campo Experimento I Experimento II CONCLUSOES CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70

6 LISTA DE FIGURAS Página 1. Adulto de Plutella xylostella (aumento de 6 x) Ovos de Plutella xylostella (aumento 45 x) Lagarta de quarto ínstar de Plutella xylostella (aumento 6x) Pupa de Plutella xylostella (aumento 8x) Células vegetativas (cv), esporos (ep) e cristais (cr) de B. thuringiensis Aspectos da cabeça de repolho coletada Gaiola para os adultos de Plutella xylostella Gaiola para as larvas de Plutella xylostella Folhas de couve para a coleta de ovos de Plutella xylostella Imersão das folhas de couve em suspensão contendo B. 39 thuringiensis 11. Secagem das folhas de couve tratadas com B. thuringiensis Placas de Petri com as folhas tratadas com B. thuringiensis Larva de terceiro instar de Plutella xylostella utilizada no bioensaio Estipes cultivadas Microscópio óptico Visão parcial do experimento I. Brazlândia-DF 46 17: Visão parcial do experimento II. Brasília-Embrapa Larvas de P. xylostella contaminadas com B. thuringiensis Larvas de P. xylostella isentas de B. thuringiensis SDS-PAGE 10% do complexo esporo-cristal das estirpes de B. thuringiensis 21. Produtos de PCR obtidos com primers específicos para genes tipo cry1 22. Produtos de PCR obtidos com primers específicos para genes tipo cry1aa 23. Produtos de PCR obtidos com primers específicos para genes tipo cry1ab

7 24. Produtos de PCR obtidos com primers específicos para genes tipo cry2 25: Micrografia eletrônica de varredura da mistura esporo-cristal das estirpes de Bacillus thuringiensis (A) HD-1 e (B) S Micrografia eletrônica de varredura da mistura esporo-cristal das estirpes de Bacillus thuringiensis (C) S764, (D) S811, (E) S845, (F) S Micrografia eletrônica de varredura da mistura esporo-cristal das estirpes de Bacillus thuringiensis (G) S1269, (H) S Número médio de furos por parcela nos diferentes tratamentos em função do tempo. Brazlândia, Número médio de furos por parcela nos diferentes tratamentos em função do tempo. Embrapa-Brasília/DF,

8 LISTA DE TABELAS Página 1: Produtos aplicados em testes de campo para controlar P. xylostella no experimento conduzido em Brazlândia-DF/ : Produtos aplicados em testes de campo para controlar P. xylostella no experimento conduzido na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia DF Mortalidade de P. xylostella após tratamentos com estirpes de Bacillus. thuringiensis - Brasília-DF, Procedência, perfil protéico e comparação gênica das estirpes de Bacillus thuringiensis que causaram 100% de mortalidade em larvas de P.xylosttella Características avaliadas na cultura do repolho tratada com diferentes produtos a base B. thuringiensis para o controle de traça-das-crucíferas. Brazlândia-DF/ Características avaliadas na cultura do repolho tratada com diferentes produtos a base Bacillus thuringiensis para o controle de traça-das-crucíferas, Embrapa-Brasília-DF/

9 LISTA DE ABREVIATURAS dntp desoxinucleosídeo trifosfato. HCl Acído clorídrico NaCl Cloreto de sódio kda quilodalton M molar Mda megadalton mm. milimolar µm micromolar ng nanograma pb pares de base SDS Dodecil Sulfato de Sódio PMSF fenilmetilsulfonilfluoreto U unidade de atividade enzimática L litro g gramas mg miligrama µg micrograma ng nanograma ml mililitro µl microlitro µm micromolar

10 1 - INTRODUÇÃO A agricultura, no âmbito geral, vem sofrendo mudanças significativas ao longo do tempo. Um enfoque especial tem sido dado ao controle de insetos-praga, uma vez que novas alternativas tem sido demandadas a fim de minimizar os impactos causados pelos produtos químicos ao homem e ao meio ambiente. Para Capalbo (1998), a redução do uso de inseticidas químicos tem sido motivada por fatores econômicos que pressionam as indústrias e pela preocupação da população em geral quanto aos efeitos prejudiciais que estes produtos têm apresentado. Em contrapartida, a necessidade de controle tem crescido devido à ampliação de fronteiras agrícolas, pelo aumento da demanda de alimentos, pelo aparecimento de resistência de insetos a produtos químicos e pelo fato de insetos que antes não eram consideradas pragas agora o serem. Nos últimos 40 anos, o uso abusivo desses produtos sintéticos causou vários problemas ambientais e de saúde, ameaçando sobremaneira a sustentabilidade dos sistemas de produção (Loguercio et. al., 2002). Este problema está motivando os órgãos governamentais a incentivar novas pesquisas, tanto em empresas públicas como nas privadas. Dessa forma novos estudos têm sido realizados com o intuito de gerar formas alternativas de controle de pragas para diversas culturas que se destacam no cenário nacional e internacional. O grupo das hortaliças envolve mais de sessenta espécies vegetais cultivadas no território nacional. Como exemplo cita-se aquelas pertencentes à família Brassicaceae, que devido ao alto percentual de consumo, gera a cada ano um rendimento elevado para os diversos tipos de propriedade agrícola (Medeiros, 1997). As Brássicas, depois da batata e do tomate, são

11 as principais fontes de alimento nos países desenvolvidos e são atualmente cultivadas em todas as regiões do mundo (Gevers et al., 1998). O repolho se destaca como a mais importante hortaliça devido a sua ampla distribuição, facilidade na produção e grande consumo (Silva Júnior, 1987). Dentre as várias pragas que atacam a cultura das Brássicas, Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae), conhecida como traça-dascrucíferas, destaca-se como a de maior importância devido aos sérios danos causados à cultura, depreciando o produto e podendo ocasionar perda total nos campos de produção. Esses danos são causados devido à alimentação larval da traça que perfura e danifica as folhas reduzindo a área foliar e impedindo um bom desenvolvimento da planta (Castelo Branco et al., 1999, Filgueira, 1987). Segundo Monnerat (1995), diversos inseticidas têm sido utilizados intensivamente durante o ciclo da cultura, e em algumas áreas já foram detectadas até 16 aplicações por cultivo. Além dos problemas gerados à saúde do agricultor e ao meio ambiente, o uso excessivo desses produtos tem proporcionado o aparecimento de populações resistentes dessa praga a diversos compostos químicos, como é o caso de inseticidas piretróides e fosforados (Vasquez, 1995; Castelo Branco & Gatehouse, 1997). Diante dessa realidade, o controle microbiano destaca-se como uma alternativa importante no controle biológico de pragas da agricultura. Um dos agentes entomopatogênicos que tem sido muito estudado e utilizado é a bactéria Bacillus thuringiensis. Produtos à base desta bactéria já são comercializados a mais de cinqüenta anos (Alves, 1998; Lobo et al., 2003). Trata-se de uma bactéria de solo, podendo ser encontrada também em insetos mortos, na água e em algumas plantas. Esse bacilo produz um cristal durante o processo de esporulação que é composto por uma ou mais proteínas, sendo que essas proteínas ao serem ingeridas se solubilizam no meio alcalino no intestino do inseto e são em seguida ativadas através da ação de proteases (Habib & Andrade, 1998).

12 A aplicação dessa bactéria tem sido muito eficiente e cada vez mais utilizada para o controle de diversos insetos-praga, principalmente para os da ordem Lepidoptera. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi selecionar, caracterizar e testar em campo as estirpes de B. thuringiensis, isoladas de diferentes regiões do Brasil, pertencentes ao Banco de germoplasma de Bacillus sp. mais tóxicas a P. xylostella..

13 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Traça-das-crucíferas (Plutella xylostella (L.) Lep.: Plutellidae) Características Gerais Plutella xylostella é um inseto da ordem Lepidoptera, da família Plutellidae, considerado o mais problemático para a cultura das Brássicas cultivadas assim como para as silvestres. Originária da região mediterrânea, atualmente esta espécie está amplamente distribuída no mundo. No Brasil, o primeiro registro de P. xylostella foi feito na Bahia (Bondar, 1928), sendo que nesta época a praga inutilizava os cultivos de repolho da região. Atualmente, é considerada a principal praga das Brássicas em vários estados produtores (Monnerat, 1995; Castelo Branco, 1997; Dias et al., 2002) Bioecologia da traça-das-crucíferas A ocorrência desta praga nas áreas de cultivo pode ser verificada o ano todo, entretanto, apresenta os maiores picos populacionais nos períodos mais quentes e secos (Villas Boas, 2003). O desenvolvimento é por holometabolia com um ciclo evolutivo de cerca de 20 dias. O adulto da traça é uma pequena mariposa de coloração parda medindo em torno de 10 mm. Os machos quando pousados sobre as folhas exibem uma mancha clara em forma de diamante na parte dorsal (Figura 1) (Filgueira, 1982; Gallo, 1988).

14 Figura 1: Adulto de Plutella xylostella (aumento de 6 x) As fêmeas são muito férteis, podendo ovipositar de 150 a 360 ovos durante o ciclo, o qual dura em torno de 10 dias. Os ovos são amarelos, esféricos, podendo ser encontrados isolados ou em grupos, de preferência na parte abaxial das folhas, medindo menos que 1,0 mm (Figura 2) (Silva Júnior, 1987; Monnerat, 1995). Figura 2: Ovos de Plutella xylostella (aumento 45 x)

15 Após a eclosão, as larvas migram para o interior das folhas, entre as epidermes e variam de tamanho ao longo dos quatro ínstares, medindo até 12 mm (Figura 3). Apresentam coloração que vai do amarelo claro ao verde escuro e, quando perturbadas, se movem rapidamente. Para empupar, as larvas constroem um casulo que inicialmente é verde claro e quando próximo à emergência dos adulto, é escuro (Figura 4) (Castelo Branco & Villas Boas, 1997). Figura 3: Lagarta de quarto ínstar de Plutella xylostella (aumento 6x) O período de desenvolvimento ovo-pupa é muito influenciado pela temperatura, sendo que a 15 C o ciclo pode durar 34 dias e a 35 C o ciclo pode ser de 12 dias. O número de gerações pode variar de cinco a dez por ano, dependendo das condições climáticas e da disponibilidade de alimentos. As populações dessa praga variam muito de um ano a outro (Castelo Branco & Villas Boas, 1997; Dias et al., 2002).

16 Figura 4: Pupa de Plutella xylostella (aumento 8x) Os danos causados pela traça-das-crucíferas ocorrem durante a fase larval do inseto. Após a eclosão, as lagartas passam a alimentar-se das folhas, caules e brotos vegetativos das plantas de repolho e couve e ainda das inflorescências, no caso de couve-flor e couve-brócolis. Em casos de ataques severos, podem provocar perdas significativas na produção, podendo até mesmo inutilizar as áreas de cultivo (Morató, 2000). Segundo Mussury et al. (2002), P. xylostella é também considerada uma das principais pragas da canola, pois provoca sérios danos à cultura desde a fase vegetativa, diminuindo a área foliar, até o final do florescimento, destruindo muitas vezes a maior parte da haste floral. Para Imenes et al. (2002), algumas dificuldades observadas no controle desta praga se devem ao fato das áreas de cultivo coexistirem durante o ano todo, com plantas de diferentes idades, proporcionando à praga quantidade abundante e contínua de alimento. Além disso, devido a seu hábito alimentar, a fase larval encontra-se protegida no interior das folhas.

17 2.1.3 Estratégias de controle para P. xylostella Em todo o mundo onde as Brássicas são cultivadas, são utilizadas várias estratégias de manejo à cultura que podem minimizar os ataques provocados pela traça-das-crucíferas. Algumas dessas técnicas de manejo e controle são utilizadas inseridas no Manejo Integrado de Pragas. Dentre as estratégias, encontra-se a determinação do nível de dano econômico através da contagem do número de furos nas folhas (Castelo Branco et al., 1996), o uso de cultivares resistentes e de feromônios (Imenes et al., 2002; Castelo Branco, 1999), a rotação de cultura, o uso de armadilhas luminosas, o uso de reguladores de crescimento de insetos, a utilização de inimigos naturais como parasitóides (Castelo Branco & Medeiros, 2001; Monnerat & Bordat, 1998; Monnerat et al., 2002) e principalmente, uso de produtos a base de B. thuringiensis (Navon, 2000; Dias et al., 2002 e Mussury et al., 2002). Muitos trabalhos têm demonstrado a importante contribuição de parasitóides, associando muitas vezes a sua utilização com bioinseticidas, principalmente aqueles à base de B. thuringiensis. São vários os parasitóides de P. xylostella, no entanto, os mais comuns encontrados nos cultivos de Brássicas no Brasil são: Diadegma sp. (Hymenoptera: Ichneumonidae), Apanteles sp. (Hymenoptera: Braconidae) e Cotesia plutellae (Hymenoptera: Braconidae). Essa interação de parasitóides e B. thuringiensis é importante porque alguns parasitóides que pousam sobre as plantas tratadas podem localizar hospedeiros nas partes da planta onde os bioinseticidas não foram depositados parasitando lagartas que não foram intoxicadas e completando assim a ação de controle. Além disso, as larvas parasitadas se alimentam menos das folhas (Shelton & Rueda, 1995; Castelo Branco et al., 1997; Monnerat et al., 2000; Zamorano, 2003).

18 Apesar das alternativas utilizadas para reduzir o ataque de P. xylostella e também minimizar os efeitos adversos causados ao meio ambiente o principal método utilizado pelos agricultores ainda é o controle químico, e que de acordo com a região, pode chegar a três aplicações de produtos químicos semanais. Os mais utilizados são os pertencentes ao grupo dos piretróides e fosforados (Castelo Branco & Medeiros, 2001). Devido ao uso indiscriminado de inseticidas químicos, o aparecimento de populações de P. xylostella resistentes tem se mostrado crescente no Brasil, principalmente nos estados de São Paulo, Ceará, Bahia e Distrito Federal, tornando o controle impreciso, caro e ineficiente (Villas Boas, 2003). 2.2 Controle biológico através de microrganismos O controle biológico é uma alternativa cada vez mais promissora para a agricultura, uma vez que diversos estudos têm relatado a importância e o uso desses microrganismos no controle de pragas na agricultura. Essa utilização não é nova e vem sendo empregada principalmente, após os anos 70, devido aos problemas advindos da utilização dos inseticidas químicos (Azevedo, 1998). O aumento da produção tem demandado uma busca incansável de novas formas de controle a serem utilizadas contra os insetos praga. Porém, existe a preocupação do uso racional e que estas formas de controle visem uma prática de Agricultura Sustentável, procurando manter o equilíbrio necessário entre o homem e o ambiente (Dias et al., 1992; Habib e Andrade, 1998; Monnerat, 1995). Para Almeida (1984), o potencial apresentado pelos microrganismos e sua utilização no controle de pragas é significativo sob diversos enfoques como: a) proteção do potencial produtivo das culturas; b) diminuição drástica do uso de produtos químicos tóxicos; c) preservação do meio ambiente; d) diminuição dos custos na produção agrícola; e) surgimento de novas indústrias. Com todas estas vantagens nota-se a importância que eles representam para a agricultura moderna.

19 No caso específico do controle de pragas, alternativas biológicas incluem a utilização de bactérias, fungos, vírus e até de substâncias produzidas pelo próprio inseto ou por uma planta. Esses agentes podem ser manipulados para o aumento da patogenicidade, ampliação do espectro de ação, produção industrial ou a incorporação de genes inseticidas em espécies vegetais. As vantagens mais propaladas da adoção de controle biológico pelos agricultores são um impacto ambiental menor e maior segurança ao homem, tanto para aquele que aplica os produtos quanto para o consumidor dos alimentos tratados. Sem falar nos sistemas de produção dos biopesticidas, menos poluentes que as indústrias químicas dos agrotóxicos. Outra vantagem dos agentes de controle biológico é sua maior seletividade, quando comparados com os agrotóxicos (Habib & Andrade, 1998) Para Alves & Almeida (1998) e Medeiros (1997), o Brasil, em virtude da grande diversidade em patógenos e do seu clima tropical favorável à ocorrência de doença nos insetos já vem sendo beneficiado por diversos programas oficiais de controle biológico. Segundo Arcas (1996), nos últimos anos, os inseticidas biológicos têm despertado um crescente interesse como método alternativo para o controle de pragas, pois a população está cada vez mais preocupada com a saúde e segurança, diante dos efeitos maléficos dos produtos químicos. A incorporação dessa forma alternativa como parte de um programa integrado de controle de pragas reduz os riscos ambientais e públicos do uso de inseticidas sintéticos. Embora os inseticidas químicos sejam usados com relativo sucesso na agricultura, seus efeitos podem trazer conseqüências sobre os organismos não-alvos problemas de contaminação das águas superficiais e subterrâneas, resíduos em alimentos e o surgimento de populações de pragas resistentes. Tudo isso tem incentivado o desenvolvimento de métodos alternativos de controle (Melo & Azevedo, 1998). Alves (2000) e Almeida & Filho (2001) relatam que o mercado mundial de defensivos agrícolas chega a valores próximos de U$ 30 bilhões e que,

20 no Brasil, esse montante já ultrapassa os U$ 2 bilhões. Os inseticidas e os acaricidas são responsáveis por 30% do total e uma pequena fração desse mercado (1,6%) está baseado na utilização de inseticidas biológicos. O controle biológico de pragas no Brasil tem um grande caminho a ser trilhado, com a biodiversidade tropical apresentando um grande número de espécies ainda desconhecidas, adaptadas às nossas condições ambientais, com potencial para uso tecnológico no controle das pragas. Vários microrganismos estão sendo utilizados, e dentre eles destacam-se os produtos a base de B. thuringiensis que representam 90-95% dos bioinseticidas. Estes são mais comumente usados em combate a insetos da ordem Lepidoptera, porém, também tem sido utilizados para outras ordens como Diptera e Coleoptera (Monnerat & Bravo, 2000). No mundo todo, muitos esforços estão sendo realizados na busca de novas estirpes que sejam efetivas contra outras pragas específicas (Lemos, 1997). As populações naturais dessa bactéria são muito diversas quanto à sua patogenicidade (Habib & Andrade, 1998). Sua eficiência se baseia em uma rápida ação apesar da curta sobrevivência dos esporos e toxinas na folhagem (Trevor, 1996; Rabinovitch et al., 2000). O desenvolvimento de B thuringiensis como biopesticida marcou o início da prática comercial do controle microbiano e a partir dos anos 80, o mercado de produtos a base desta bactéria tomou novo impulso quando se verificou que novas linhagens apresentavam um espectro de ação mais amplo, atingindo dípteros, e mais recentemente coleópteros, nematóides e ácaros (Nardo & Capalbo, 1998) Um aspecto muito importante no desenvolvimento de novos bioinseticidas é a descoberta de estirpes com maior atividade e melhor adaptadas às condições ambientais onde esses produtos serão utilizados (Dias, 1992).

21 2.3 Aspectos Biológicos de Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis é uma espécie bacteriana de solo, que reage positivamente para a coloração de Gram, flagelada, pertence à família Bacillaceae, podendo ser encontrada nos mais variados ecossistemas do globo terrestre. É uma bactéria aeróbia e facultativamente anaeróbia e medem 1-1,2 x 3-5 µm de comprimento (Rabinovitch et al., 2000; Junqueira & Carneiro, 2000). No gênero Bacillus destacam três espécies principais, B. cereus, B. sphaericos e B. thuringiensis. Estas são bactérias esporulantes e entomopatogênicas e que com exceção da primeira, apresentam os cristais protéicos ou ICPs (inclusões protéicas cristalinas) durante a esporulação (Figura 5). ep cr cv Figura 5: Células vegetativas (cv), esporos (ep) e cristais (cr) de B. thuringiensis Os cristais são constituídos por δ-endotoxinas, também conhecidas como proteínas Cry e Cyt, com ação inseticida. A atividade entomopatogênica dessa bactéria se deve à presença dessas inclusões protéicas cristalinas (Dias, 1992, Soberón & Bravo, 2001; Loguercio et. al., 2002).

22 Para Moraes et. al., (1998), B. thuringiensis pode ser considerado como o agente biológico de maior potencial inseticida devido principalmente às características de esporulação que lhe conferem resistência às condições adversas e de processamento industrial. A temperatura ótima para produção de esporos e cristais ocorre entre 28 a 32 C, sendo que em temperaturas menores que 20 C e maiores que 40 C pode ocorrer perda das δ- endotoxinas (Benintende & Marquez, 1996). Valadares et. al. (1998), relatam que a toxicidade das δ-endotoxinas, produzidas por essa bactéria é mais potente que a maioria dos inseticidas químicos utilizados para o controle de diversas pragas na agricultura. Além disto, pesticidas à base de proteínas Cry têm baixo custo de desenvolvimento e registro, em relação a um novo inseticida químico sintético (Schnepf et al., 1998; Loguercio et. al., 2002). A primeira estirpe de B. thuringiensis foi isolada de Bombix mori (bicho da seda) pelo cientista japonês, Dr. Ishiwata, em 1902, no Japão, e recebeu o nome de Bacillus sotto. Anos depois, em 1911, o Dr. Berliner, um microbiologista alemão, trabalhando em Turíngia (Alemanha) isolou um bacilo que estava causando doença e morte em larvas de Anagasta kuehniella (traça da farinha) que foi denominada de B. thuringiensis. E somente mais tarde, por volta de , é que Hannay detectou a presença de cristais em culturas esporuladas dessa bactéria (Habib & Andrade, 1998) e associou a eles, a toxicidade. Bacillus thuringiensis tem sido muito utilizado para o controle de insetos-praga florestais, agrícolas e vetores de doenças, graças à especificidade das δ-endotoxinas aos insetos e invertebrados-alvo, e sua inocuidade aos vertebrados e meio ambiente, inclusive insetos benéficos e inimigos naturais, fazendo deste agente uma ferramenta importante em estratégias de manejo integrado de pragas (Bravo & Quintero, 1993; Herrero, 2001; Siegel, 2001).

23 Toxinas do cristal ou δ-endotoxinas As toxinas do cristal, denominadas também como proteínas Cry, são de constituição glicoprotéica, representando normalmente de 20 a 30% do peso seco da célula (Benintende & Marquez, 1996). Essas proteínas do cristal são altamente tóxicas a diversas ordens de insetos, principalmente para Lepidoptera, Coleoptera e Diptera (Valadares-Inglis et al., 1998; Herrero, 2001). Esse cristal protéico representa o componente principal dos produtos comerciais à base de B thuringiensis. Estudos realizados sobre a cristalogênese mostraram que o cristal é formado a partir do segundo estágio da esporulação e é liberado quando as células vegetativas são lisadas (Monnerat & Bravo, 2000). O cristal apresenta diferentes formas podendo ser bipiramidal, cubóide, rombóide, ovóide, esférico, ou, ainda, sem forma definida (Habib & Andrade, 1998). Existem atualmente mais de 200 diferentes genes cry que já foram seqüenciados. As proteínas Cry estão agrupadas em 40 classes e diferentes subgrupos (Crickmore, 2002; Bobrowski et al., 2003). Essas proteínas são codificadas por diferentes genes, seu peso molecular pode variar de 14 a 140 kda. Os cristais da maioria das linhagens desse patógeno podem conter mais de uma toxina (Habib & Andrade, 1998). A classificação das proteínas Cry se baseia na similaridade das seqüências de aminoácidos (Crickmore et al., 1998). As toxinas identificadas como tóxicas para lepidópteros são as do tipo Cry1, Cry2 e Cry9, porém, algumas pertencentes a alguns subgrupos mostraram ser efetivas também para dípteros e coleopteros. As toxinas do tipo Cry1 têm 36 subgrupos representados por Cry1Aa,...,Cry1Ka (Crickmore et al., 1998). Os genes cry1 codificam proteínas que formam inclusões protéicas cristalinas bipiramidais de peso molecular entre kda. A maioria dessas proteínas são tóxicas para lepidópteros mesmo que algumas delas tenham atividade dupla, como por exemplo, a Cry1Ca é ativa contra lepidópteros e dípteros e a Cry1Ba é ativa para lepidópteros e coleópteros. Essas proteínas são solubilizadas e

24 convertidas em proteases a fragmentos tóxicos de 60 a 70k Da, no intestino médio das larvas dos insetos alvo (Pietrantonio, et al., 1996). A classe Cry2 está formada por quatro membros Cry2Aa, Cry2Ab, Cry2Ac e Cry2Ad (Crickmore et al., 2002). Algumas estirpes apresentam atividade dupla, sendo tóxicas para lepidópteros e dípteros. Essas proteínas apresentam peso molecular de 65kDa, formam cristais cubóides e estão presentes em algumas estirpes de várias subespécies, incluindo kurstaki HD-1, thuringiensis, tolworthi e kenyae (Hofte & Whiteley, 1989; Lereclus et al., 1989). A classe Cry9 é formada por seis integrantes: Cry9Aa, Cry9Ba, Cry9Ca, Cry9Da, Cry9Ea e Cry9Eb e apresentam peso molecular em torno de 130 kda. Alguns relatos da literatura confirmam que estas proteínas são eficazes para lepidópteros e coleópteros e que o gene cry9ca é efetivo contra Ostrínia nubilalis (Lepidoptera: Pyralidae) e a proteína Cry9Da é ativa contra escarabeídeos (Wasano & Ohba, 1998). Além dos demais grupos de proteínas Cry efetivas para outras ordens de insetos, um gene de B.thuringiensis H-14 codifica uma toxina com peso molecular entre 26 e 28 kda que é citolítica e ativa contra dípteros. Tal gene não se relaciona estruturalmente aos genes cry e recebeu o nome de cyt devido a sua ação (Benintende & Marquez, 1996; Monnerat & Bravo, 2000). As proteínas Cyt são tóxicas para dípteros, e citolíticas para vários tipos celulares inclusive células de mamíferos e eritrócitos (Pietrantonio et al., 1996) Modo de ação das toxinas de B. thuringiensis O modo de ação das toxinas de B.thuringiensis foi estudado, principalmente, em lepidópteros, porém alguns trabalhos mostram características semelhantes para outras ordens de insetos (Herrero, 2002). O mecanismo de ação das proteínas Cry é um processo de várias etapas. Primeiramente o inseto deve ingerir o complexo esporo-cristal e momentos depois que as larvas susceptíveis ingeriram esse complexo, os

25 sintomas que podem ser observados são: parada alimentar, paralisia do intestino, vômito, diarréia, paralisia total e finalmente, a morte (Monnerat & Bravo, 2000; Habib & Andrade, 1998). Suscintamente seguem abaixo as etapas envolvidas no mecanismo de ação das proteínas Cry. Solubilização: Os cristais produzidos por B. thuringiensis se solubilizam em ph intestinal alcalino. O intestino médio da maioria das larvas de insetos susceptíveis (lepidópteros, dípteros e alguns coleópteros) se caracteriza por seu alto ph e condições redutoras (Monnerat & Bravo, 2000). Assim, com estas características nos insetos susceptíveis, as toxinas do cristal solubilizadas liberam os peptídeos tóxicos. Uma menor efetividade destas proteínas, em coleópteros, pode ser devido ao ph neutro ou pouco ácido desses insetos (De-Maagd et al., 2001; Bobrowski et al., 2003). Existem evidências que mostram que a velocidade da solubilização depende do ph. Estudos com A. kuhniella, inseto de ph intestinal pouco alcalino, mostraram uma lenta dissolução do cristal. Em outro caso em Bombix mori, cujo ph intestinal é em torno de 10, a poucos minutos da ingestão os sintomas puderam ser notados (Luthy & Wolfersberger, 2000). Processamento: A maior parte das proteínas é produzida sob a forma de protoxinas e para serem ativadas devem ser transformadas em polipeptídeos tóxicos no intestino do inseto, pela ação do ph alcalino intestinal e de proteases. A toxina ativada causa a lise das células epiteliais e a morte das larvas (Aronson et al., 1986). O estudo sobre os tipos de enzimas que estão envolvidas neste processo ainda é incipiente. No entanto, pesquisas mostraram que a principal protease digestiva de lepidópteros e dípteros é do tipo serina enquanto que, em coleópteros, a principal protease digestiva é a do tipo cisteína e aspartato (Terra & Ferreira, 1994; Bobrowski et al., 2003). União ao receptor: A união das toxinas Cry à membrana epitelial das células colunares do intestino médio dos insetos-alvo se realiza através de receptores específicos localizados nas microvilosidades apicais dessas membranas (Hofmann et al., 1988; Bravo et al., 1992; Ravoahangimalala et al., 1993). Um estudo com os lepidópteros Thaumetopoea pityocampa e

26 Lymantria monacha revelaram que estes sítios de união podem variar nos diferentes estágios larvais dos insetos (Rausell et al., 2000; Giustolin et al., 2001). Inserção na membrana, agregação e formação do poro: As toxinas Cry se unem a receptores na membrana plasmática das células epiteliais de forma irreversível, formando poros com diâmetro de 1 a 2nm, causando um desequilíbrio osmótico no meio intra e extracelular provocando perda na integridade da membrana do intestino das larvas de insetos susceptíveis (Ihara et al., 1993; Liang et al., 1995). Citólise: Após o desequilíbrio osmótico causado pela formação dos poros e maior permeabilidade da membrana, o efeito mais devastador desse processo é a alcalinização do citoplasma, o que interfere no metabolismo celular normal e tem como conseqüência final à destruição do epitélio intestinal, causando a proliferação bacteriana na hemolinfa e a morte das larvas por inanição e infecção generalizada (Wolfersberger, 1992). 2.4 Técnicas bioquímicas e moleculares para a caracterização de Bacillus thuringiensis A taxonomia dos Bacillus spp. entomopatogênicos tem sido alvo de muitos estudos. Até 1960, as metodologias mostravam-se pouco apropriadas para uma classificação segura das estirpes isoladas em diversas regiões do globo. Para Oliveira e Scortichini (1998), as bactérias possuem dimensões extremamente reduzidas, não sendo possível, sua identificação com base apenas em caracteres de anatomia e morfologia. Em decorrência disso, são utilizados diversos critérios, como provas bioquímicas, métodos de coloração, gama de hospedeiros, morfologia de colônias e pigmentação em meio de cultura, sorologia e sintomatologia, dentre outros na identificação de um isolado bacteriano. Diversas técnicas foram propostas e, atualmente, diversos genes das delta-endotoxinas foram clonados, o que permite a caracterização das

27 toxinas pela análise completa da seqüência de DNA de cada grupo (Kronstad & Whiteley, 1986), pela utilização de anticorpos monoclonais (Huber-Lukac et al.,1986) ou por sondas específicas de DNA (Visser, 1989) Sorologia Flagelar Os primeiros sistemas de classificação para B. thuringiensis se basearam na caracterização morfológica e bioquímica, utilizando técnicas convencionais. Até então essas bactérias recebiam o nome de Bacillus, e as espécies eram designadas por diferentes características tais como sítio de isolamento (thuringiensis, alesti), nome do pesquisador (Berliner), nome do hospedeiro original do qual a bactéria foi isolada (galleriae, dendrolinus). Assim a mesma linhagem era descrita, dependendo do autor, com diferentes nomenclaturas como, por exemplo, B. cereus var. sotto, B. thuringiensis var. sotto ou B. sotto (Benintende, 1996; Sosa-Goméz et al., 1998). Mais tarde, devido a grande quantidade de isolados de B. thuringiensis obtidos até o início da década de 60, os cientistas tiveram vários problemas de classificação das diferentes variedades que surgiram desse bacilo. Com isso De Barjac & Bonnefoi, 1962, propuseram a caracterização com base dupla, a bioquímica e a sorotipagem baseada no antígeno flagelar das células vegetativas, ou seja, antígeno H, facilitando bastante a diferenciação entre as várias estirpes. O método da sorotipagem consiste em testar a estirpe desconhecida na presença do anticorpo flagelar de cada linhagem bacteriana conhecida. A cultura jovem de B. thuringiensis é inoculada em coelhos e a partir do seu sangue é preparado o soro contendo anticorpos flagelares. O anticorpo flagelar é colocado em contato com suspensão da bactéria e, após incubação, a leitura de aglutinação é feita visualmente (Sosa-Goméz et al., 1998). Este sistema de classificação permitiu grande avanço na sistemática destes microrganismos. Com essa técnica determinaram várias características culturais e bioquímicas de 50 linhagens de B. thuringiensis e

28 ainda, através da análise sorológico do antígeno-h (Aglutinação flagelar) puderam identificar e agrupar as mesmas em nove serótipos distintos (padrões) (De Barjac, 1980). A maioria das estirpes comerciais utilizadas como base para os bioinseticidas atuais foram isoladas a partir de insetos; o sorotipo kurstaki foi isolado de Anagasta kuehniella (Kurstak, 1962), o sorotipo israeliensis a partir de mosquitos (De Barjac, 1962) e o sorotipo tenebrionis a partir de larvas de Tenebrio molitor (Krieg et al., 1983). A caracterização com a utilização desses métodos proporcionaram até 1981, a identificação de 15 sorotipos, abrangendo 22 variedades desse bacilo (De Barjac et al., 1990). Uma revisão mais recente estabeleceu 27 sorotipos, e atualmente, são relatadas 65 diferentes variedades (Sosa- Goméz et al., 1998). A sorotipagem tem sido utilizada com sucesso para a descrição de sorovar ou variedade, mas deve-se salientar que ela não reflete a patogenicidade da variedade, o qual é essencialmente definido pelas δ- endotoxinas que constituem o cristal protéico. Para isso, as técnicas descritas a seguir podem fornecer informações importantes quanto às características inerentes as toxinas do cristal através da análise protéica e dos genes codificadores de tais proteínas Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) A reação da polimerase em cadeia é uma tecnologia revolucionária com inúmeras aplicações em ciências biológicas, tanto em pesquisa básica como aplicada, e proporcionou ao seu autor, Kary B. Mullis, no início da década de 90, o prêmio Nobel de medicina (Gama, 1998). A PCR baseia-se na atividade da enzima DNA polimerase que é capaz de produzir uma cadeia de DNA complementando outra já existente. A reação de PCR consiste em uma reação de polimerização de DNA em cadeia, na qual se dá o enriquecimento de um fragmento específico de DNA por meio de sua duplicação em modo exponencial, ou seja, o número

29 de fragmentos amplificados duplica-se a cada ciclo de reação (Silva-Pereira, 2003 e Gama, 1998) pelo anelamento e extensão enzimática de um par de oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA fita simples) utilizados como iniciadores ( primers ) que delimitam a sequência de DNA de fita dupla alvo da amplificação. Assim, apenas fragmentos de DNA que tenham a mesma seqüência inicial de nucleotídeos é amplificada. Após vários ciclos térmicos, obtém-se alguns fragmentos de DNA com vários tamanhos, que podem ser individualizados por eletroforese em gel de agarose. Por meio da técnica é possível saber se a estirpe possui genes que codificam para as proteínas tóxicas já conhecidas ou não, além de dar uma idéia da patogenicidade das estirpes (Ceron et al., 1995; Kuo & Chak, 1996). Para uma reação de PCR é necessário uma amostra do ácido nucléico com o fragmento a ser amplificado (molde), a enzima catalisadora da reação, os iniciadores específicos, os nucleotídeos que construirão o novo fragmento e os cofatores da reação, em tampão. A PCR tem a vantagem de necessitar somente de quantidades muito pequenas do DNA a ser amplificado, e é uma técnica tão sensível, que o DNA isolado de uma única célula é suficiente para a detecção de seqüências específicas de genes (Brown et al., 1993). A técnica de PCR é uma ferramenta cada vez mais empregada e quando utilizada para a caracterização de B. thuringiensis permite amplificar uma seqüência conhecida do DNA bacteriano e determinar as relações filogenéticas entre estirpes de uma mesma espécie e de um mesmo sorotipo (Steffan & Atlas, 1991; Valadares-Inglis & Melo, 1998; Silva-Werneck& Monnerat, R., 2001) Técnica de Eletroforese A técnica utilizada para a separação de macromoléculas ou migração de colóides em campo elétrico é chamada de eletroforese, termo criado por Michaelis, em 1909 (Sargent & George, 1975).

30 A evidenciação de proteínas e ácidos nucléicos pela eletroforese é precisa e valiosa para os estudos taxonômicos, filogenéticos, fisiológicos e genéticos em plantas, animais, microrganismos e partículas virais (Brune & Alfenas, 1998). Dispondo-se de DNA de bactérias conhecidas, é possível comparar, por eletroforese. Atualmente, eletroforese em géis de agarose e poliacrilamida tem sido muito utilizada, uma vez que suas metodologias são mais simples, rápida e possuem poder de resolução superior a outras técnicas (Souza, 2003). Para visualizar a amplificação de ácidos nucléicos obtidos através da PCR é muito recomendado utilizar a eletroforese em gel de agarose onde os fragmentos podem ser observados. A eletroforese em gel de poliacrilamida é amplamente usada e o sistema SDS-PAGE é aplicado no estudo de proteínas desnaturadas por aquecimento na presença de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) e β- mercaptoetanol visando à determinação do peso molecular, de proteínas apresentando uma precisão de até 95% (Alfenas & Brune, 1998; Silva- Pereira, 2003). 2.5 Resistência de insetos a B. thuringiensis Segundo Schenepf et al., (1998), as bases teóricas do desenvolvimento de resistência são evolutivas, um processo lento e considerado como uma coevolução dos organismos envolvidos. Se uma população é exposta a uma pressão de seleção em seu habitat, reage em função dos atributos qualitativos e quantitativos do seu pool gênico. Então os indivíduos mais capacitados transferem essa capacidade a seus descendentes incrementando a freqüência de alelos em cada geração (Ibarra & Lopes, 1997). Devido às características inerentes ao modo de ação de B. thuringiensis, se considerou durante muito tempo que seria pouco provável o surgimento de insetos resistentes a esse bacilo, porém alguns estudos têm

31 demonstrado que algumas espécies se mostraram resistentes a algumas das toxinas do cristal produzidas por esse patógeno (Cartin et al., 2000). Mcgaughey e Beeman, em 1988 a partir de testes de seleção em laboratório obteve o primeiro caso detectado em Plodia interpunctella, desde então outras ordens de insetos têm apresentado níveis elevados de resistência a B. thuringiensis em laboratório. A traça-das-crucíferas foi o primeiro inseto a desenvolver resistência ao DDT em campo e o único inseto até o momento que desenvolveu importantes níveis de resistência em algumas populações de campo em resposta a tratamentos comerciais com B. thuringiensis, principalmente Dipel e Xentari (Tabashnik et al., 1997; Tang et al., 1996; Herrero et al., 2001; Herrero, 2002; Van Rie & Ferrè, 2000). Este caso de P. xylostella foi detectado no Hawai pela primeira vez, porém em outros países como Japão, USA, Thailândia, Honduras, Malásia, Brasil, México, Nicarágua, Filipinas também foi observado a presença de populações resistentes a B. thuringiensis como relata uma pesquisa feita pela Michigan State University (Whalon, 2000). Segundo Vasquez (1995), um estudo realizado na Universidade da Flórida registra que a traça-das-crucíferas é o segundo inseto mais resistente do mundo e foi detectado que esta praga já adquiriu resistência a mais de 51 compostos químicos. O mesmo estudo cita que o primeiro insetopraga mais resistente é o Myzus persicae (Homoptera: Aphidae) com resistência a mais de 71 compostos químicos. Estudos sugerem que a resistência a B. thuringiensis pode estar relacionada a vários fatores e ao modo de ação das toxinas e permite algumas hipóteses, como a mudança na conformação dos receptores, ph intestinal menos alcalino impedindo a solubilização do cristal, proteases intestinais incapazes de digerir ou ativar as delta-endotoxinas, proteases intestinais muito eficazes que poderiam digerir totalmente a protoxina e hipersensibilidade dos indivíduos-alvo (Monnerat & Bravo, 2000).

32 O aparecimento de resistência só poderá ser evitado, quando um estudo sério sobre o efeito biológico do agente de controle e os mecanismos de resistência que a praga pode desenvolver for realizado. Para o manejo da resistência a B. thuringiensis algumas estratégias inseridas ao manejo integrado de pragas podem ser utilizadas tais como a utilização de refúgios, o uso de inimigos naturais em conjunto com as δ- endotoxinas e a rotação entre produtos biológicos e químicos (Monnerat, 1995 ; Van Rie, 2000). É importante salientar que, independentemente da estratégia escolhida, a resistência só deixará de ser problema se o campo for bem monitorado. 2.6 Formas de utilização de B. thuringiensis No início de 1998, havia aproximadamente 200 produtos à base de B. thuringiensis registrados nos Estados Unidos (Schnepf et al., 1998), desenvolvidos por várias companhias tais como Abbott, Sandoz, Bactec, Novo Nordisk, Mycogen. Os produtos contendo toxinas específicas para lepidópteros são, comercialmente, mais importantes, pois a maioria dos biopesticidas à base de B. thuringiensis usados para controlar pragas agrícolas é à base da estirpe HD-1, da subespécie kurstaki, a qual tem alta toxicidade e amplo espectro de ação dentro da ordem Lepidoptera (Navon, 1993). Produtos à base de B. thuringiensis subsp. israelensis tem grande importância no controle de mosquitos culicídeos e simulídeos, muitos dos quais, vetores de doenças. Monnerat & Bravo (2000) citam que no Manejo Integrado de Pragas (MIP), produtos a base de B. thuringiensis podem ser usados com outros agentes microbianos, como vírus, ou substâncias como reguladores de crescimento de insetos, com resultados geralmente aditivos ou sinergísticos. Podem também ser usados em associação com produtos químicos, como os piretróides sintéticos, com endosulfan, fenvalerate e acephate.

33 Um outro aspecto promissor vislumbrado desde meados da década de oitenta, foi a utilização dos genes cry, fonte de resistência a lepidópteros, inserido-os na planta através das ferramentas da engenharia genética. A primeira planta geneticamente modificada com genes da proteína do cristal de B. thuringiensis a ser aprovada para uso comercial nos Estados Unidos foi o algodão, liberado em 1995 (Lima, 2003). Atualmente, já se dispõe no mercado internacional cultivares de batata, tomate, milho e algodão expressando os genes de B. thuringiensis com alto nível de resistência e ampla utilização pelos agricultores dos EUA, China e Argentina, entre outros (Bobrowski et al., 2003). Vários produtos bioinseticidas já foram lançados e aprovados para uso agrícola nos EUA, como exemplo o MVP (Mycogen, San Diego, CA), recomendado para o controle de P. xylostella e outros lepidópteros. Neste produto, o gene cry1ac é expresso em altos níveis em células de Pseudomonas fluorescens, onde os cristais permanecem encapsulados processo denominado CellCap, o que lhe confere maior persistência no campo (Gelernter & Schwab, 1993). Os produtos a base de B. thuringiensis utilizados atualmente no Brasil, são caros devido a sua importação, pois ainda não existe no Brasil nenhuma empresa que tenha elaborado um produto em escala comercial. Assim, surge a necessidade de se desenvolver produtos brasileiros para ampliar o uso desses agentes de controle biológico cuja importância já foi destacada (Dias, 1992).

34 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Criação Massal da Traça-das-crucíferas A produção massal de P. xylostella em laboratório na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia teve o objetivo de fornecer insetos em grande quantidade para a realização de bioensaios com B. thuringiensis no intuito de estudar formas alternativas de controle com para essa praga. As etapas necessárias para a instalação e manutenção dessa criação serão descritas a seguir Coletas a campo Durante os meses de agosto à aovembro do ano de 2002, em áreas de produção de repolho no Distrito Federal, foram realizadas coletas de cabeças de repolho nos cultivos que sofreram com o ataque da traça (Figura 6), com a finalidade de coletar lagartas e pupas das plantas danificadas pela praga. Durante esse período, várias regiões foram visitadas, dentre elas Brazlândia, Vargem Bonita, Taquara e Núcleo Rural de Pipiripau que são áreas de grande expressão econômica em cultivos com hortaliças no DF. Figura 6: Aspectos da cabeça de repolho coletada Triagem das cabeças de repolho

35 Os repolhos coletados foram levados ao laboratório de Semioquímicos e Bioecologia da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e assim procedida à separação e triagem das cabeças, retirando as folhas que formam o repolho uma a uma, coletando-se as larvas e pupas encontradas. Ao término dessa etapa, os insetos coletados foram mantidos em quarentena como procedimento obrigatório e seguro para a criação antes dos insetos serem liberados para a reprodução em massa. As pupas foram mantidas em gaiola de acrílico medindo 90 x 80 x 80 cm até emergência dos adultos (Figura 7) e as larvas foram colocadas no interior de uma gaiola de acrílico medindo 28 x 28 x 8 cm e alimentadas com folhas de couve (Figura 8). Figura 7: Gaiola para os adultos de P. xylostella Figura 8: Gaiola para as larvas de P. xylostella Procedimentos durante as fases de desenvolvimento de P. xylostella A criação foi instalada no laboratório de Bioecologia e Semioquímicos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e mantida em sala climatizada com temperatura em torno de 28 C, umidade relativa 60% e fotoperíodo de 12 horas. Os adultos foram alimentados com solução de mel a 10%, renovada a cada dois dias. Folhas de couve com os talos embebidos em água foram

36 fornecidas aos adultos diariamente para a coleta de ovos servindo também como forma de abrigo para as mariposas. As folhas de couve onde foram depositados os ovos (Figura 9), foram transferidas diariamente para uma gaiola de acrílico de 28 x 28 x 8 cm. Após a eclosão das larvas, foram oferecidas folhas de couve previamente lavadas com hipoclorito de sódio a 2% e enxaguadas com água destilada. Este procedimento foi o mesmo durante os quatro instares larvais, sendo que a cada dois dias as gaiolas foram trocadas e as lagartas transferidas para gaiolas limpas. As folhas velhas e os resíduos foram descartados para evitar a contaminação por microrganismos e outros organismos oportunistas. Figura 9: Folhas de couve para a coleta de ovos de P. xylostella As lagartas que se desenvolveram na gaiola, alimentadas diariamente com folhas de couve, teceram o casulo dentro da própria gaiola. A coleta de pupas foi realizada a cada dois dias com auxílio de uma pinça entomológica. As crisálidas coletadas foram transferidas para a gaiola de adultos. 3.2 Origem das estirpes utilizadas de Bacillus thuringiensis

37 Para a realização deste trabalho foram utilizadas 203 estirpes de B. thuringiensis que estavam armazenadas no Banco de Germoplasma de Bacillus entomopatogênicos pertencentes à coleção da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Essas estirpes foram isoladas de solo, água e insetos mortos de várias regiões do Brasil, de acordo com a metodologia descrita no Protocolo da Organização Mundial da Saúde de 1987 (Monnerat, 2001). 3.3 Teste de Patogenicidade - Bioensaio Seletivo Para o bioensaio cada estirpe foi cultivada em meio NYSM (nutrient broth, yeast extract, MnCl 2, MgCl 2, CaCl 2 ), durante 48 horas a 200 rpm e 28 C. Nestas condições elas apresentaram uma boa quantidade de esporos e cristais. Folhas de plântulas de repolho foram imersas durante 10 minutos em uma suspensão com cada estirpe bacteriana contendo 10 ml da cultura diluída em 90 ml de água destilada, e também espalhante adesivo Extravon (30 ml / 100 litros de água) (Figura10). Figura 10: Imersão das folhas de couve em suspensão contendo B. thuringiensis Em seguida, as folhas foram colocadas para secar verticalmente usando um suporte apropriado e temperatura em torno de 28 C (Figura 11).

38 Figura 11: Secagem das folhas de couve tratadas com B. thuringiensis Após a secagem completa por aproximadamente uma hora, cada folha foi colocada em placa de Petri descartável 90 x 15 mm, forrada com papel filtro (Figura 12) e dez lagartas de terceiro instar (Figura 13) (TABASHNIK et al., 1990). Figura 12: Placas de Petri com as folhas tratadas com B. thuringiensis Figura 13: Larva de terceiro instar de Plutella xylostella utilizada no bioensaio

39 Utilizou-se duas repetições para cada estirpe, um controle negativo sem a adição do bacilo e uma estirpe padrão B. thuringiensis subsp. kurstaki (HD-1) como controle positivo. A primeira leitura foi feita 48 horas após o início do bioensaio, ocasião em que as lagartas foram passadas para uma folha livre do bacilo. No quinto dia foi feita a segunda e última leitura avaliando assim a mortalidade total das larvas durante esse período Caracterização das estirpes de Bacillus thuringiensis As estirpes de B. thuringiensis que causaram mortalidade de 100% no bioensaio seletivo contra P. xylostella foram submetidas à caracterização morfológica, bioquímica e molecular Caracterização Morfológica de Bacillus thuringiensis As estirpes de Bt foram cultivadas em meio NYSM (Yousten, 1984) em erlenmayer de 50 ml com 13 ml de meio e mantidas em incubador rotativo por 48 horas a 28 C e 200 rpm (Figura 14), logo em seguida, foi realizada a caracterização morfológica através de microscopia óptica em contraste de fases para a observação de células vegetativas, esporos e cristais (Figura 15). Figura 14: Estipes cultivadas Figura 15: Microscópio óptico

40 3.4.2 Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 10%) Para a realização da eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 10%), utilizou-se a metodologia descrita por Lecadet et al. (1991) Extração do complexo esporo-cristal das estirpes de Bacillus thuringiensis As estirpes bacterianas foram cultivadas em meio NYSM líquido por 72 horas em incubador rotativo a 28 C e 200 rpm e as proteínas foram extraídas de acordo com Lecadet et al. (1991). A partir da cultura bacteriana foram transferidas 1,5 ml para tubos de microcentrífuga de 2 ml, previamente autoclavado, e centrifugadas a x g, em microcentrifuga Eppendorf, por 20 minutos. Os sobrenadantes foram descartados e os sedimentos lavados com 1,5 ml de NaCl 0,5 M por 20 minutos. O NaCl 0,5 M foi descartado e secaram-se as paredes dos tubos de microcentrífuga com papel de filtro. Os sedimentos foram lavados por duas vezes com 1,5 ml de PMSF (fenilmetilsulfonilfluoreto) a 1mM e centrifugados a x g por 20 minutos. Descartou-se o PMSF 1mM e os sedimentos foram ressuspensos em 500µl de PMSF 1 mm e armazenados a -20 C Análise das proteínas Cry de B. thuringiensis em gel de Poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) O complexo esporo-cristal das estirpes foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida-sds (dodecil sulfato de sódio) a 10% (SDS-PAGE), conforme procedimento descrito por Laemmli (1970); Schagger e Von Jagow (1987). Alíquotas de 20 µl das preparações de esporos-cristais foram diluídas em tampão de amostra de proteína 5X (1,5M Tris-HCl; ph 6,8;

41 Glicerol; SDS; 2β-Mercaptoetanol; Azul de Bromofenol) fervidas a 100 C por 5 minutos e aplicadas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Foram utilizados 8 µl de marcador de proteína de alto e baixo peso molecular (Full Range Rainbow). A eletroforese foi realizada em aparelho Hoefer minive vertical Eletroforesis System Amersham Pharmacia, contendo tampão de corrida 1X (Tris-base, glicina, SDS 10%), em voltagem constante de 150V por aproximadamente 1 hora e 30 minutos. Após este período, o gel foi imerso em solução de corante Comassie Blue (40% metanol, 25% de Comassie blue 250-R) por uma hora e descorado com solução contendo 40% de metanol e 10% de ácido acético por aproximadamente duas horas até a visualização dos perfis protéicos das estirpes de B. thuringiensis Identificação de genes cry por meio de PCR A extração do DNA total das estirpes selecionadas foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Bravo et al. (1998). As estirpes foram cultivadas em meio Ágar Nutritivo mantidas a 30 C durante 16 horas. Em tubos de microcentrífuga foi adicionado 100 µl de Água MilliQ e uma alçada do cultivo com a bactéria, em seguida a amostra foi homogeneizada em aparelho Vortex e mantida no freezer em temperatura de 20 C por uma hora e logo após, fervida por 10 minutos para lise das células. Findo esse período, o material foi centrifugado a x.g por 30 segundos, em microcentrífuga Eppendorf. O sobrenadante foi transferido para um outro tubo de microcentrífuga e preparou-se então a PCR. Para a realização das PCRs, 15 µl do sobrenadante da cultura foram transferidos para um tubo contendo 12,5 µm de cada primer, 100mM de dntp mix, tampão de Taq 1x e 2,5 U de Taq DNA polimerase (5.0 U) em um volume total de 50 µl. Para identificação de genes cry1 nos isolados foram usados os pares de primers gerais gral-cry1 (BRAVO et al., 1998). A amplificação foi processada em termociclador de DNA e o programa utilizado foi o seguinte:

42 94 C por um minuto (desnaturação), 52 º C por um minuto (anelamento), 72 C por um minuto (extensão) e uma extensão extra de 72 C por cinco minutos num total de 30 ciclos. Para a identificação de gene cry2 foi usado o par de primer cry2(d) e cry2(r) (Ibarra et al., 2003). A amplificação foi processada em termociclador de DNA e o programa utilizado foi o seguinte: 95 C por um minuto (desnaturação), 50 C por um minuto (anelamento), 72 C por um minuto (extensão) e uma extensão extra de 72 C por cinco minutos num total de 30 ciclos. Foram usados também pares de primers para identificação de genes cry9, (spe-cry9a, spe-cry9b, spe-cry9c). A amplificação foi processada em termociclador e as condições das PCRs com estes outros primers foram similares, exceto que a temperatura de anelamento foi de 51 C. Para identificação de genes da subclasse cry1 (cry1aa, cry1ab, cry1ac, cry1ad, cry1b, cry1c e cry1d) foram usados os pares de primers específicos (CERON et al., 1993) CJ1/CJ2, CJ3/CJ2, CJ4/CJ5, CJ6/CJ7, CJ8/CJ9, CJ10/CJ11 e CJ12/CJ13 e amplificações foram processadas em termociclador de DNA e o programa utilizado foi o seguinte: 92 C por um minuto (desnaturação), 53 C por um minuto (anelamento), 72 C por um minuto (extensão) e uma extensão extra a 72 C por 10 minutos num total de 25 ciclos. Para genes cry1e, cry1f e cry1g foram usados os pares de primers específicos CJ14/CJ15, CJ16/CJ17 e CJ18/CJ19 (Ceron et al., 1995). As amplificações foram processadas em termociclador de DNA e o programa utilizado foi o seguinte: 95 C por um minuto (desnaturação), 48 C por um minuto (anelamento), 72 C por um minuto (extensão) e uma extensão final de a 72 C por 5 minutos num total de 30 ciclos. Uma alíquota de 24 µl de cada produto de PCR foi misturada com tampão de amostra 6X e aplicada em gel de agarose 2%. A corrida eletroforética foi processada em Tampão TBE 1X (Tris-base, Ácido bórico, EDTA 0,5M ph 8,0). Após a corrida, o gel foi corado com brometo de etídio

43 diluído em água na concentração de 1µg/ml por 20 minutos, e descorado em água destilada por 15 minutos. O gel foi observado em transluminador sob luz UV e fotografado em foto-documentador modelo Eagle Eye (Stratagene) Caracterização Morfológica via Microscopia Eletrônica de varredura Nesta modalidade, as estirpes foram cultivadas por 48h em meio NYSM a 28 C e 200 rpm contendo basicamente esporos e cristais e então foram liofilizadas. Para a liofilização, as estirpes cultivadas foram centrifugadas a x.g por 30 minutos, a 4 C (centrifuga BR4i, Jouan), congeladas overnight e deixadas em liofilizador (Labconco modelo Lyphlock 18) por 18 horas. Depois de liofilizadas, as amostras foram depositadas sobre suportes metálicos e cobertas com ouro por 180 segundos, utilizando-se metalizador Emitech Modelo K550 e observadas em microscópio eletrônico de varredura Zeiss modelo DSM Testes de campo para a avaliação da susceptibilidade de P. xylostella a produtos formulados a base de B. thuringiensis em cultivo de repolho (Brassica oleracea var. capitata) Através dos testes de caracterização realizados com as estirpes tóxicas à P. xylostella foram selecionadas para serem formuladas duas estirpes a S811, S845 e ainda a estirpe B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 identificada no laboratório como S1450 utilizada como padrão para lepidópteros e que é o ingrediente ativo do produto Dipel. As formulações foram preparadas pela empresa B-THEK que está iniciando os seus trabalhos na produção de bioinseticidas, e tem utilizado tecnologia brasileira para a fabricação desses produtos. Localizada em Brasília, têm desenvolvido vários trabalhos em parceria com a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

44 No experimento I, utilizaram-se as duas estirpes selecionadas, a S811 e a S845 e também a S1450, e no experimento II foram utilizadas a S845 e a S1450. Os outros produtos comerciais avaliados foram listados de acordo com cada experimento Experimento I Campo experimental de Brazlândia-DF O trabalho foi conduzido em campo experimental para produção comercial de hortaliças na região de Brazlândia - DF, durante os meses de julho a setembro de A variedade cultivada foi o híbrido Itiban marca Hortec e os cuidados em relação ao manejo da cultura foram os recomendados para a região (Figura 16). Figura 16: Visão parcial do experimento I. Brazlândia-DF O delineamento experimental adotado foi de blocos casualizados, com seis tratamentos e dez repetições. A parcela foi formada por quatro linhas contendo 12 plantas cada. Os inseticidas testados e suas respectivas doses são listados na Tabela 1. Em todos os tratamentos, foi adicionado o espalhante adesivo Extravon (30 ml/100 litros de calda).

45 As aplicações foram condicionadas através de diagnóstico de nível de dano da traça (Castelo Branco & Villas Boas, 1996) feito duas vezes por semana. Para o diagnóstico, foi escolhida ao acaso uma planta por parcela, na qual realizou-se a avaliação dos furos produzidos pela traça-das-crucíferas nas quatro folhas centrais da cabeça de repolho. Uma vez que o valor da média resultasse igual ou superior a seis furos por tratamento, realizava-se a aplicação do tratamento. Tabela 1: Produtos aplicados em testes de campo para controlar P. xylostella no experimento conduzido em Brazlândia-DF/2003. Tratamentos Ingrediente ativo Formulação Dose/ha Dipel (Abbott) B. thuringiensis kurstaki Suspensão concentrada 300 ml Xentari (Novo Nordisk) B. thuringiensis aizawai Grânulos dispersíveis 400g S1450 B. thuringiensis kurstaki Suspensão 300 ml concentrada S811 B. thuringiensis kurstaki Suspensão 300 ml concentrada S845 B. thuringiensis kurstaki Suspensão 300 ml concentrada Testemunha (Água) nenhum isenta - As avaliações foram feitas durante seis semanas e os produtos foram aplicados quando necessário com o uso de um pulverizador costal marca Jacto, com capacidade para 20 litros.

46 A primeira avaliação foi realizada 58 dias após o transplante, ou seja, após o início da formação da cabeça, pois se tratava de uma área já cultivada pelo produtor. A irrigação por meio de aspersão foi monitorada pelo produtor, realizada de duas a três vezes por semana. Ao final do ciclo da cultura, 10 plantas das duas linhas centrais de cada parcela foram escolhidas ao acaso e avaliadas de acordo com os danos, fazendo a atribuição das seguintes notas: nota 1 (para plantas sem nenhum furo), nota 2 (para plantas com furos inferior a 2 mm), nota 3 (para plantas com furos superior a 2 mm) e nota 4 (para plantas com perda total) (Monnerat, 1995). Os repolhos foram medidos ainda em seu diâmetro para distinção de classe. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância, sendo as médias comparadas pelo teste de agrupamento de médias Scott-Knott (P=0,05). O programa computacional utilizado foi Sistema para análises estatísticas e genéticas (SAEG 8.0) Experimento II - Campo experimental da Embrapa-DF O experimento foi conduzido de Outubro de 2002 a Janeiro de 2003, no campo experimental da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Após o preparo da área, 448 plantas de repolho da variedade Híbrido Itiban foram transplantadas para os canteiros e os cuidados em relação ao manejo da cultura foram os recomendados para a região (Figura 17).

47 Figura 16: Visão parcial do experimento II. Brasília-Embrapa O delineamento experimental adotado foi o de blocos casualizados, com quatro repetições e seis tratamentos. As parcelas foram formadas de duas linhas com sete plantas cada, total de quatorze plantas por parcela. Os inseticidas testados e suas respectivas doses são listados na Tabela 2. As aplicações foram condicionadas após diagnóstico de nível de dano da traça (Castelo Branco e Villas Boas, 1996) feito duas vezes por semana. Para o diagnóstico, cinco plantas foram escolhidas ao acaso por parcela, nas quais realizou-se a avaliação dos furos produzidos pela traçadas-crucíferas nas quatro folhas centrais da cabeça de repolho. Uma vez que o valor da média resultasse igual ou superior a seis furos por parcela, realizava-se a aplicação do tratamento.

48 Tabela 2: Produtos aplicados em testes de campo para controlar P. xylostella no experimento conduzido na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia DF Tratamentos Ingrediente ativo Formulação Dose/ha Dipel (Abbott) B. thuringiensis kurstaki Suspensão concentrada 300 ml Xentari B. thuringiensis Grânulos 400g (Novo Nordisk) aizawai dispersíveis S1450 B. thuringiensis kurstaki S845 B. thuringiensis kurstaki Suspensão concentrada Suspensão concentrada 300 ml 300 ml Tracer Spinosad Suspensão 100 ml concentrada Testemunha nenhum isenta - (Água) As avaliações foram feitas durante sete semanas e os produtos foram aplicados quando necessário com o uso de um pulverizador costal marca Jacto, com capacidade para cinco litros. A primeira avaliação foi realizada 28 dias após o transplante, no início da formação das cabeças. A irrigação por meio de aspersão foi realizada de duas a três vezes por semana. Ao final do ciclo da cultura, 10 plantas de cada parcela foram escolhidas ao acaso e avaliadas de acordo com os danos (Villas Bôas et al., 1990), fazendo a atribuição das seguintes notas: nota 1 (para plantas sem nenhum furo), nota 2 (para plantas com furos inferior a 2 mm), nota 3 (para plantas com furos superior a 2 mm) e nota 4 (para plantas com perda total) (Monnerat, 1995). Os repolhos foram medidos ainda em seu diâmetro para distinção de classe.

49 Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância, sendo as médias comparadas pelo teste de agrupamento de médias Scott-Knott (P=0,05). O programa computacional utilizado foi Sistema para análises estatísticas e genéticas (SAEG 8.0).

50 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Criação Massal da Traça-das-Crucíferas (P. xylostella) (L.) (Lep.:Plutellidae) As coletas realizadas nas regiões do Distrito Federal durante os meses de Agosto a Novembro, foram satisfatórias, pois foram obtidos, grande quantidade de larvas e pupas. Durante a quarentena dos insetos, toda a população da traça-das-crucíferas foi observada e os indivíduos que não apresentaram bom desenvolvimento foram descartados, evitando possíveis contaminações aos demais. Durante o período da produção massal de P. xylostella, foram observados que nas primeiras semanas alguns problemas relacionados com a mortalidade de larvas e mariposas que foi considerada alta, acima de 60%. Alguns autores descreram esses problemas e atribuem esse acontecimento a fatores bióticos e abióticos diferentes das condições de campo. Outro fator atribuído é a contaminação por microrganismos ou outros agentes biológicos (Gallo et al.,1988; Crespo e Lecuona, 1996; Alves e Jr. Moino, 1998). Após esse período de adaptação e minimizado os problemas com os agentes contaminantes, mantenve-se o máximo de assepsia na criação e os insetos da segunda geração, apresentaram-se mais vigorosos. As mariposas apresentaram um bom desenvolvimento quanto à sua fertilidade e longevidade. Com esse sistema de criação observou-se que descrito a longevidade do adulto foi em torno de dias e aproximadamente ovos foram coletados diariamente. Os ovos foram depositados, preferencialmente, de forma isolada nas folhas, porém foi possível observar grupos com mais de sete ovos, discordando dos dados observados por Montagne (1972), quando estudou uma população de P. xylostella em laboratório, descreveu a presença de grupos de postura com números de 3-7 ovos.

51 As larvas se desenvolveram bem e tiveram baixa mortalidade, menos de 40%, aproximadamente. Observou-se que o período larval variou em torno de 7-11 dias, constando de quatro ínstares concordando com os resultados obtidos por Fernandez e Alvarez, 1988, onde avaliaram o comportamento de P. xylostella em laboratório e determinaram o número de instares larvais através da medição da cápsula cefálica de larvas de P. xylostella com a utilização da régua de Dyar. O período pupal, nas condições da criação, foi de 3-5 dias e foram coletadas aproximadamente, 1000 pupas por semana. As pupas são muito sensíveis e a coleta foi feita a cada dois dias, a mortalidade das pupas foi considerada baixa, em torno de 10%. A criação estabelecida forneceu insetos para a realização dos bioensaios com o uso de B. thuringiensis com o intuito de pesquisar formas alternativas de controle para P. xylostella Teste de Patogenicidade No bioensaio seletivo apenas sete das 203 estirpes avaliadas apresentaram alta toxicidade para a traça em relação ao padrão utilizado, B. thuringiensis subsp. kurstaki (HD-1), com mortalidade de 100% conforme apresentado na Tabela 3.

52 Tabela 3. Mortalidade de P. xylostella após tratamentos com estirpes de Bacillus. thuringiensis - Brasília-DF, 2003 Estirpes de B. thuringiensis* Intervalos de mortalidade (%) S8, S18, S35, S39, S40, S48, S65, S78, S79, S86, S94, S99, S100, S101, S104, S106, S108, S111, S119, S123, S125, S132, S133, S140, S141, S143, S144, S148, S156, S158, S159, S168, S176, S178, S192, S211, S238, S243, S258, S266, S269, S273, S309, S354, S397, S403, S414, S415, S427, S433, S434, S435, S447, S458, S467, S468, S471, S479, S480, S481, S509, S545, S563, S565, S568, S573, S574, S575, S578, S598, S599, S619, S620, S623, S625, S631, S633, S640, S739, S741, S742, S844, S1082, S1329, S1350, S s10, S13, S29, S33, S38, S41, S55, S69, S70, S72, S73, S74, S105, S142, S145, S146, S185, S263, S274, S275, S278, S279, S287, S288, S292, S294, S310, S316, S328, S332, S333, S335, S339, S340, S348, S353, S356, S362, S366, S367, S371, S375, S376, S377, S378, S381, S383, S389, S392, S393, S396, S402, S405, S406, S408, S417, S418, S428, S430, S436, S441, S443, S446, S452, S454, S457, S472, S474, S475, S476, S478, S484, S S390, S764, S811, S845, S1265, S1269, S * Banco de Germoplasma de Bacillus entomopatogênicos - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Durante os bioensaios os sintomas observados nas larvas que se alimentaram de folhas contendo a estirpe tóxica foram: a redução ou parada alimentar, o não desenvolvimento das larvas, não foi observada a mudança de ínstar (ocorrido provavelmente devido a inanição). As larvas ficaram moribundas com pouca mobilidade e, finalmente, morreram devido a uma

53 infecção generalizada (Figura 18). Esses sintomas estão coerentes com aqueles já descritos por Monnerat e Bravo, (2000); Habib e Andrade, (1998). Figura 18: Larvas de P. xylostella contaminadas com B. thuringiensis As larvas utilizadas como testemunha tiveram, durante os bioensaios, um bom desenvolvimento, com mortalidade abaixo do limite permitido, ou seja, menos de 10% do total de insetos testados (Silva-Werneck e Monnerat, 2001), (Figura 19). Figura 19: Larvas de P. xylostella isentas de B. thuringiensis Tendo em vista que P. xylostella é bastante susceptível a B. thuringiensis, foram selecionadas as estirpes S390; S764; S811; S845;

54 S1265; S1269; S1905 que apresentaram mortalidade de 100%, as quais foram caracterizadas. 4.3 Caracterização morfológica das estirpes de Bacillus thuringiensis Através da microscopia com contraste de fases pode ser confirmado que todas as estirpes testadas eram pertencentes à espécie B. thuringiensis, devido às características morfológicas visualizadas, inerentes a essa espécie, como as células vegetativas, esporos e cristais (Habib e Andrade, 1998). 4.4 Análise de proteínas Cry de Bacillus thuringiensis As proteínas encontradas nas estirpes analisadas apresentaram dois polipeptídeos principais de aproximadamente 130 e 65 kda (Figura 20) e somente a estirpe S390 não apresentou perfil protéico de 130 kda. As estirpes S764 e S1905 apresentaram perfil semelhante ao B. thuringiensis subsp. kurstaki (HD-1) utilizado como padrão e efetivo no controle de lepidópteros. Monnerat e Bravo, 2000 e Herrero, 2002, observaram que as toxinas já descritas e efetivas para lepidópteros, possuem peso molecular de 130 e 65 kda, o que provavelmente, pode explicar a toxicidade destas estirpes para a traça-das-crucíferas. Kda Figura 20. Visualização dos perfis protéicos de estirpes de B. thuringiensis. 1-Marcador Full Range Rainbow Protein molecular weight; 2-HD-1, 3-S390, 4- S764, 5-S811, 6-S845, 7-S1265, 8- S1269, 9-S1905.

55 4.5 Caracterização molecular por meio da PCR A análise molecular com utilização dos primers cry1 geral gerou produtos de PCR com fragmento de tamanho esperado para todas as estirpes com exceção da estirpe S390 (Figura 21). pb Figura 21. Produtos de PCR obtidos com primers específicos para genes tipo cry1. 1- Marcador molecular, 100bp DNA Ladder (Pharmacia), 2- Controle, 3-HD-1, 4-S764, 5-S811, 6-S845, 7-S1265, 8-S1269, 9-S1905. Para os pares de primers CJ1/CJ2, foram observados fragmentos de 246pb indicando a presença de genes da subclasse cry1aa para as estirpes, S764, S845 e S1905 e também no padrão utilizado (Figura 22), e para os primers CJ3/CJ2 nenhum fragmento foi obtido.

56 pb Figura 22. Produtos de PCR obtidos com primers específicos para genes tipo cry1aa, por meio dos primers CJ1/CJ2. 1-Marcador molecular, 100bp DNA Ladder (Pharmacia), 2-HD-1, 3-S764, 4-S845, 5-S1905, 6-Controle. As reações feitas com os primers CJ4/CJ5 resultou em um fragmento de 216 pb, obtido normalmente quando o gene cry1ab está presente, esse fragmento foi detectado nas estirpes, S764, S811, S1905 e confirmanda sua presença também no padrão utilizado (Figura 23). Para os primers CJ6/CJ7, o produto obtido foi um fragmento de 180 pb, indicando a presença do gene cry1ac somente nas estirpes semelhantes ao padrão B. thuringiensis subsp. kurstaki (HD-1), a S764 e S1905. Já para os primers CJ8/CJ9 o produto obtido foi um fragmento de 367 pb indicando a possível presença do gene cry1b nas estirpes HD-1, S764, S845, S1905. Na PCR realizada com os outros primers específicos CJ10/CJ11, CJ12/CJ13, CJ14/CJ15, CJ16/CJ17 e CJ18/CJ19 para os genes das subclasses cry1, nenhum fragmento de tamanho esperado foi obtido.

57 Pb Figura 23. Produtos de PCR obtidos com primers específicos para genes tipo cry1ab, por meio dos primers CJ4/CJ5. 1-Marcador molecular, 100bp DNA Ladder (Pharmacia), 2-Controle, 3-HD-1, 4-S764, 5-S811, 6-S1905. A identificação destes genes cry1 nas estirpes que foram tóxicas para P. xylostella sugere que esse gene seja responsável pela patogenicidade dessas estirpes de acordo com o que foi observado por Herrero, 2002 onde o autor cita os modelos de sítio de união das toxinas Cry no epitélio intestinal de P. xylostella. Outros trabalhos também confirmam a atividade das proteínas tóxicas codificadas pelo gene cry1 como, por exemplo, Sayyed et al., 2000 na Malásia, onde os autores avaliaram a suceptibilidade e resistência de P. xylostella a várias toxinas Cry1 e destacaram a toxicidade da proteína Cry1Ab e Cry1Ac, semelhante também aos resultados obtidos por Monnerat et al., (1999) e Cardenás et al., (2001). O produto obtido da PCR onde utilizou-se o primer geral para cry2 confirmou a presença do gene, através do fragmento de 526 pb nas estirpes S390, S764, S811, S845, S1265, S1269, S1905, confirmando ainda, sua presença no padrão HD-1 (Figura 24). De acordo com o trabalho de Cardenás et al., 2001, a presença desse gene nos isolados é importante,

58 pois ele codifica proteínas tóxicas para lepidópteros e dípteros conforme já observado também por Monnerat et al. (1999). pb Figura 24. Produtos de PCR obtidos com primers específicos para genes tipo cry2, por meio dos primers Cry2(d)/Cry2(r). 1- Marcador molecular, 100bp DNA Ladder (Pharmacia), 2-Controle negativo, 3-HD-1, 4-S390, 5- S764, 6-S811, 7-S845, 8-S1265, 9-S1269, 10-S1905. A PCR com os primers para a identificação de genes cry9 não produziu fragmentos de tamanho esperado indicando que as estirpes não possuem esse gene. A não identificação dos genes cry9 nas estirpes avaliadas concorda com os resultados de Bravo et al., (1998) que cita a pouca freqüência da presença desses genes nas estirpes, apenas 2,50%, porém, difere dos resultados obtidos por Pinto e Fiúza, (2003) em que os autores verificaram a distribuição de genes cry de estirpes isoladas de solos do Estado do Rio Grande do Sul, obtendo uma alta frequência de genes cry9 de 47,82%. Os autores sugerem que essas diferenças podem estar associadas a fatores abióticos, como características físico-químicas do solo dentre outros fatores que foram avaliados na pesquisa.

59 Um resumo geral dos resultados obtidos por meio da caracterização Bioquímica e Molecular das estirpes selecionadas pode ser visualizado na Tabela 4. Tabela 4 Procedência, perfil protéico e comparação gênica das estirpes de Bacillus thuringiensis que causaram 100% de mortalidade em larvas de P.xylosttella. Estirpe Procedência Perfil Proteico (kda) Genes HD-1 RS 130 e 65 cry1aa, cry1ab, cry1ac,cry1b, cry2 S390 PA 45 e 65 cry2 cry1aa, cry1ab, S764 SC 130,65,30 cry1ac,cry1b, cry2 811 SC 130,65,30 cry1ab, cry2 S845 BA 130 cry1aa,cry1b, cry2 S1265 SP 130,45 cry1, cry2 S1269 SP 130, 80, e 65 cry1, cry2 cry1aa,cry1ab cry1ac,cry1b, cry2 4.6 Microscopia eletrônica de varredura Através da microscopia eletrônica de varredura nas estirpes, foi possível observar as diferentes formas em que se apresentam os cristais. Esses diferentes tipos morfológicos podem fornecer informações importantes a respeito da atividade entomopatogênica das estirpes para as diferentes ordens de insetos quando analisado em conjunto com a caracterização bioquímica e molecular (Habib e Andrade, 1998).

60 Nem todas as estirpes apresentaram as três formas distintas de cristais. A estirpe S390, por exemplo, apresentou somente cristais redondos (Figura 25B). Esse fato, provavelmente, pode estar relacionado com a presença do gene cry2, pois normalmente as estirpes com esse gene apresenta cristais redondos e possui atividade tóxica para lepidópteros e dípteros, com peso molecular em torno de 70kDa. Esse resultado concorda com aqueles já descritos por Pietrantonio et al. (1996) e Habib e Andrade, 1998, quando estudaram a ação tóxica dos cristais para os diversos genes codificadores das proteínas Cry. Esses autores ainda relacionaram os cristais bipiramidais com a presença do gene cry1 com peso molecular de aproximadamente 130 kda (Figura 25A). É importante ressaltar que mesmo sendo possível identificar os diferentes tipos morfológicos dos cristais nas estirpes analisadas, a presença de cristais bipiramidais foi mais abundante que as demais formas. No padrão utilizado HD-1 e nas estirpes com perfil semelhante a ele a S764 e S1905 podem ser visualizadas as três formas de cristais presentes em uma mesma estirpe, indicando a presença de proteínas tóxicas a lepidópteros e com pesos moleculares diferentes, o que foi notado na análise das proteínas (Figura 26, 27 e 28). cr cc cr cb ep cr ep (A) (B) Figura 25: Micrografia eletrônica de varredura do complexo esporo-cristal das estirpes de B. thuringiensis (A) HD-1 e (B) S390. ep-esporo, cb-cristal bipiramidal, cr-cristal redondo, cc-cristal cubóide (aumento de x).

61 cb cr cc cc ep cr cb (C) (D) Figura 26: Micrografia eletrônica de varredura do complexo esporo-cristal das estirpes de B. thuringiensis (C) 764 e (D) 811. ep-esporo, cb-cristal bipiramidal, cr-cristal redondo, cc-cristal cubóide (aumento de x). cr cr cb cb cr ep cb ep (E) (F) Figura 27: Micrografia eletrônica de varredura do complexo esporo-cristal das estirpes de B. thuringiensis (E) S845, (F) S1265. ep-esporo, cb-cristal bipiramidal, cr-cristal redondo, cc-cristal cubóide (aumento de x).

62 cb ep cr cc cb (G) (H) Figura 28: Micrografia eletrônica de varredura do complexo esporo-cristal das estirpes de B. thuringiensis (G) S1269, (H) S1905. ep-esporo, cb-cristal bipiramidal, cr-cristal redondo, cc-cristal cubóide (aumento de x). 4.7 Testes em campo Os resultados obtidos nos experimentos em campo com os produtos avaliados para o controle de P. xylostella seguem de acordo com a ordem de realização dos mesmos Experimento I No trabalho conduzido na região de Brazlândia foi constatado que a infestação da traça-das-crucíferas foi severa ao longo de todo o ciclo da cultura, o que pode ser evidenciado pelo nível de danos número de furos nas quatro folhas centrais do repolho e na parcela testemunha esta progressão foi mais acentuada, à medida que aumentava o tempo de exposição da cultura (Figura 29). Baseado no nível de danos, número de furos foram realizadas durante sete semanas 12 aplicações para os produtos Dipel, S 1450,