Prevalência de an t i c o r p o an t i PGL-1 em co n t a t o s domiciliares de pacientes com hanseníase Prevalence of antibodies to PGL-1 in household contacts of Hansen s disease patients Rossilene Conceição da Silva Cruz 1, Maria da Graça Souza Cunha 2, Felicien Gonçalves Vásquez 3 Re s u m o O glicolipídio fenólico 1 (PGL-1) é um antígeno específico para o Mycobacterium leprae. A detecção do anticorpo anti-pgl-1 pode sugerir infecção pelo M. leprae e identificar indivíduos com maior risco de desenvolver a doença. Utilizou-se o teste ML Flow para conhecer a prevalência do anticorpo anti-pgl-1 em contatos domiciliares de pacientes com hanseníase, diagnosticados no período de junho de 2003 a maio de 2004 no Centro de Referência em Dermatologia e Doenças Sexualmente Transmissíveis Fundação Alfredo da Matta, responsável pela Coordenação Estadual do Programa de Hanseníase, e onde se concentram 73,0% dos doentes diagnosticados na cidade de Manaus. O grupo de estudo foi constituído por 234 contatos domiciliares de 69 casos-índice (26 paucibacilares e 43 multibacilares). A prevalência do anticorpo anti-pgl-1 entre os contatos domiciliares foi de 15,0%. Não foi encontrada diferença estatisticamente significante no resultado da sorologia, em relação a sexo e idade dos contatos examinados. O mesmo foi observado quando se relacionou a sorologia positiva com a classificação e o índice baciloscópico dos casos-índice. Durante o estudo, dois contatos soronegativos desenvolveram a forma paucibacilar, sendo os mesmos contatos de pacientes multibacilares. Pa l a v r a s-c h a v e Hanseníase, anti-pgl-1, glicolipidiofenólico, ML flow, contatos de hanseníase Ab s t r a c t The Phenolic GlycoLipid 1 (PGL-1) is considered a specific antigen for Mycobacterium leprae. The presence of antibodies to PGL-1 may suggest M. leprae infection and also identifies individuals with higher risk of developing the disease. In this study, ML flow test was used to investigate the prevalence of antibodies to PGL-1 in household contacts of leprosy patients. The cases were detected between June 2003 and May 2004 at the Alfredo da Matta Foundation, which concentrates 73.0% of all cases detected in Manaus, the capital city of the State of Amazonas. Furthermore, the Foundation is a Reference Centre in Dermatology and Sexually Transmitted Diseases, and it is also in charge of the Amazonas State Leprosy Control Program. The group studied was comprised of 234 household contacts coming from 69 index cases (26 paucibacillary and 1 Mestre em Patologia Tropical. Médica Dermatologista e Alergologista da Fundação Alfredo da Matta. End: Rua 15, Quadra 12, casa 06. Residencial Villa Verde I. Santo Agostinho. Manaus Amazonas. CEP: 69036-800. E-mail: rossilenecruz@fuam.am.gov.br / rossilenecruz@uol.com.br 2 Doutora em Medicina. Médica Dermatologista da Fundação Alfredo da Matta. 3 Mestre em Saúde, Sociedade e Endemias na Amazônia. Estatístico da Fundação Alfredo da Matta. C a d. Sa ú d e Co l e t., Rio d e Ja n e i r o, 17 (1): 261-271, 2009 261
R o s s i l e n e Co n c e i ç ã o d a Si l v a Cr u z, Ma r i a d a Gr a ç a So u z a Cu n h a, Fe l i c i e n Go n ç a l v e s Vá s q u e z 43 multibacillary). The prevalence of the antibody to PGL-1 amongst the household contacts was 15.0%. No statistically significant difference was found regarding the result of the serology in its relation to gender and age of the contacts included in this study. The same result was observed when we compared positive serology, classification and bacterial index of the cases. During this study, two contacts of multibacillary cases with negative serology developed paucibacillary leprosy. Key words Leprosy, Phenolic GlycoLipid 1 (PGL-1), ML flow, household contacts 1. In t r o d u ç ã o Na hanseníase, do ponto de vista imunológico, a imunoglobulina M (IgM) é aquela que é detectada em maiores níveis e durante o longo período da doença por Mycobacterium leprae devido à permanência do antígeno no organismo. Entretanto, anticorpos específicos IgG e IgA também são detectados (Chujor et al., 1991). As técnicas sorológicas utilizadas na hanseníase incluem ensaio imunoenzimático (ELISA), ML Dipstick e o ML flow, este último um teste imunocromatográfico de fita, de fácil utilização e resultado rápido. Essas técnicas são baseadas na detecção de anticorpos específicos anti-m. leprae, os quais refletem infecção passada ou presente (Klatser et al., 1994; 1993) e são úteis no acompanhamento durante a terapia e na investigação da prevalência da doença, bem como da disseminação da infecção na comunidade (Bach et al., 1986; Desforges et al., 1989; Chanteau et al., 1987; 1989; 1993; Lefford et al., 1991; Cho et al., 1983; 2001). O glicolipídio fenólico 1 (PGL-1) é um antígeno específico para o M. leprae (Hunter & Brenan, 1981). A detecção do anticorpo anti-pgl-1 sugere infecção pelo M. leprae e identifica indivíduos com maior risco de desenvolver a doença (Buhrer-Sékula et al., 2003). Além disso, o PGL-1 apresenta relação com a carga bacilar em pacientes com hanseníase (Klatser, 1989), sugerindo infecção multibacilar. A identificação de anticorpo anti PGL-1 em contato de pacientes com hanseníase pode contribuir para a detecção precoce da doença e a prevenção da transmissão, podendo auxiliar de forma complementar na orientação das ações dos programas de controle (Douglas & Worth, 1984). Buhrer-Sékula et al. (2007) e Lyon et al. (2008) demonstraram uma correlação entre os resultados dos testes sorológicos, sugerindo que o teste ML flow poderia ser utilizado para auxiliar na classificação clínica da hanseníase, contribuindo para a melhor alocação dos casos nos esquemas terapêuticos, principalmente em áreas de atuação das equipes de atenção básica que não possuem um laboratório com infraestrutura e recursos humanos capacitados para a realização da baciloscopia. 262 C a d. Sa ú d e Co l e t., Rio d e Ja n e i r o, 17 (1): 261-271, 2009
P r e v a l ê n c i a d e a n t i c o r p o a n t i PGL-1 e m c o n t a t o s domiciliares d e p a c i e n t e s c o m h a n s e n í a s e Douglas et al. (1987), mostraram que contatos PGL-1 soropositivos tem um elevado risco de desenvolver hanseníase quando comparados com contatos PGL-1 soronegativos e, quando desenvolvem a doença, o fazem principalmente na forma multibacilar (MB). Portanto, o acompanhamento dos contatos com a utilização da detecção do anticorpo anti-pgl-1 pode ajudar a identificar indivíduos provavelmente infectados, que podem estar incubando a doença e constituir-se em fonte potencial de infecção. Desse modo utilizou-se o teste ML flow, para conhecer a prevalência do anticorpo anti-pgl-1 em contatos domiciliares de pacientes com hanseníase, diagnosticados no período de junho de 2003 a maio de 2004, na Fundação de Dermatologia Tropical e Venereologia Alfredo da Matta (FUAM). Este centro é responsável pela Coordenação Estadual do Programa de Hanseníase do Amazonas e concentra aproximadamente 70% dos casos novos detectados anualmente na cidade de Manaus. O estudo teve como objetivo conhecer a prevalência do anticorpo anti-pgl-1 em contatos domiciliares de hanseníase. 2. Material e métodos Estudo transversal da detecção do anticorpo anti-pgl-1 em contatos domiciliares de pacientes com hanseníase, diagnosticados no período de junho de 2003 a maio de 2004, que residiram com casos de hanseníase nos últimos cinco anos e que concordaram em participar do estudo e foram atendidos na FUAM-AM. Os contatos que aceitaram participar do estudo foram submetidos a exame dermatológico e ao teste ML flow, utilizando-se kits fabricados pelo Instituto Real Tropical (2003), em Amsterdã, Lote ML-3-012, 2004-04. O teste consistiu na puntura do dedo com uma lanceta; o sangue total coletado com um tubo capilar foi colocado no receptáculo do cartucho e adicionado à solução tampão, com o resultado em cinco minutos (Instituto Real Tropical, 2003). O resultado positivo foi indicado pela presença de uma linha vermelha na zona do teste e na zona de controle, e o resultado negativo pela ausência da linha vermelha na zona de teste (Instituto Real Tropical, 2003). Os contatos eram devidamente orientados independentemente do resultado do teste. O presente estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação Alfredo da Matta, conforme Resolução 196/96 Comissão Nacional de Ética em Pesquisa CONEP. C a d. Sa ú d e Co l e t., Rio d e Ja n e i r o, 17 (1): 261-271, 2009 263
R o s s i l e n e Co n c e i ç ã o d a Si l v a Cr u z, Ma r i a d a Gr a ç a So u z a Cu n h a, Fe l i c i e n Go n ç a l v e s Vá s q u e z Os dados estão apresentados em tabela simples e de dupla entrada, com cálculo de frequências absolutas simples, relativas e estatística de teste quiquadrado de Pearson para análise de associação em nível de 5% de significância ou qui-quadrado com correção de Yates quando infringidas as regras do teste de Pearson. Para estimar a prevalência do anticorpo anti-pgl-1 utilizou-se intervalo de confiança em nível de 95%, e para as variáveis quantitativas foi calculada a média, mediana e o desvio padrão (DP). 3. Re s u l t a d o s No período de junho de 2003 a maio de 2004 foram registrados 1.098 casos novos de hanseníase no Estado do Amazonas. Entre esses, 579 foram detectados em Manaus, dos quais 425 diagnosticados e tratados na FUAM-AM, representando 73,0% dos casos detectados na capital do Estado. Foram incluídos no estudo 234 contatos. A Tabela 1 apresenta as características gerais do grupo de contatos, referentes a 69 casos-índice. Entre os contatos examinados, 59,4% eram do sexo feminino e 67,1% pertenciam ao grupo etário >15 anos. Tabela 1 Distribuição dos contatos segundo sexo e idade em contato domiciliar com casos de hanseníase Variáveis Sexo n (n=234) Feminino 139 59,4 Masculino 95 40,6 Idade (anos) < 15 77 32,9 > 15 157 67,1 Média (DP) 26,59 (19,04) Mediana 21,00 Em relação aos 69 casos-índice, estes foram agrupados segundo a classificação de Ridley e Jopling (1966), havendo predominância de casos Borderline Tuberculoide BT (36,3%). Também foi utilizada a classificação operacional (WHO, 1982), na qual a proporção de MB foi 62,3% e de PB de 37,7%. Quanto ao índice baciloscópico, 66,7% apresentaram baciloscopia negativa. O tempo médio de evolução da doença, desde o início dos sintomas até o diagnóstico, referido pelos casos, foi de 20,5 meses (DP= 34,90) (Tabela 2). % 264 C a d. Sa ú d e Co l e t., Rio d e Ja n e i r o, 17 (1): 261-271, 2009
P r e v a l ê n c i a d e a n t i c o r p o a n t i PGL-1 e m c o n t a t o s domiciliares d e p a c i e n t e s c o m h a n s e n í a s e Tabela 2 Distribuição dos contatos segundo classificação de Ridley e Jopling, classificação operacional, índice baciloscópico e tempo de duração dos casos- índice n % Classificação de Ridley e Jopling HBT (Borderline Tuberculoide) 25 36,3 HT (Tuberculoide) 16 23,2 HBB (Borderline Borderline) 8 11,6 HBL (Borderline Lepromatosa) 8 11,6 HI (Indeterminada) 7 10,1 HL (Lepromatosa) 5 7,2 Classificação operacional PB (Paucibacilar) 26 37,7 MB (Multibacilar) 43 62,3 Índice baciloscópico Negativo 46 66,7 Positivo 23 33,3 Média (DP) 2,10(2,37) Mediana 1,70 Tempo de evolução (meses) Média (DP) 20,5 (34,9) Mediana 12 A detecção do anticorpo anti-pgl-1, utilizando-se o teste ML flow, mostrou uma prevalência de 15% entre os contatos examinados (Tabela 3). Na Tabela 3, observa-se a distribuição do resultado do teste ML flow em relação à classificação de Ridley e Jopling do caso-índice, onde a proporção de contatos domiciliares com teste ML flow positivo foi maior entre os contatos de casos-índice da forma Lepromatosa (LL). Quanto ao resultado do teste ML flow entre os contatos e sua relação com a Classificação Operacional, observamos que dos 35 contatos que apresentaram sorologia positiva para anti-pgl-1, 15,7% são contatos de MB e 13,6%, contatos de PB. Ao considerar a distribuição do resultado do teste ML flow em relação à idade dos contatos, observou-se que 10 (13,0%) dos contatos positivos eram menores de 15 anos e 24 (15,9%) maiores de 15 anos, não havendo diferença estatisticamente significante. C a d. Sa ú d e Co l e t., Rio d e Ja n e i r o, 17 (1): 261-271, 2009 265
R o s s i l e n e Co n c e i ç ã o d a Si l v a Cr u z, Ma r i a d a Gr a ç a So u z a Cu n h a, Fe l i c i e n Go n ç a l v e s Vá s q u e z Tabela 3 Resultado do ML flow entre contatos domiciliares em relação à classificação clínica, classificação operacional e grupo etário dos casos-índice Variável Classificação Ridley e Jopling * Positivo ML flow Negativo n % n % LL 4 22,2 14 77,8 18 BL 4 12,1 29 87,9 33 BB 4 14,8 23 85,2 27 BT 14 16,1 73 83,9 87 TT 8 14,3 48 85,7 56 HI 1 7,7 12 92,3 13 Classificação operacional do Caso Índice ** Multibacilar 24 15,7 129 84,3 153 Paucibacilar 11 13,6 70 86,4 81 Grupo etário *** < 15 anos 10 13,0 67 87,0 77 > 15 anos 25 15,9 132 84,1 157 Total 35 15,0 199 85,0 234 *Não foi possível aplicar o teste estatístico do χ 2 por existirem valores esperados menores de cinco unidades. **χ 2 = 0,18, p-valor = 0,6674. ***χ 2 = 0,35, p-valor = 0,55. A distribuição do resultado do teste ML flow em relação ao sexo apresentou maior proporção de soropositividade entre contatos domiciliares do sexo feminino, 26 (18,7%). Entre os casos-índice classificados como MB, 23 (53,4%) apresentavam baciloscopia positiva. Ao se relacionar os resultados do ML flow dos contatos com o índice baciloscópico dos casos acima de 0 e < 3 ou > 3, observou-se que dos 77 (32,9%) contatos de pacientes bacilíferos, 10 (13,0%) apresentaram ML flow positivo, e que não houve diferença significativa entre os resultados de contatos de casos-índice com diferentes índices baciloscópicos (Tabela 4). Tabela 4 Distribuição do resultado do ML flow em contatos domiciliares que participaram do estudo em relação ao índice baciloscópico positivo dos casos-índice Índice baciloscópico do caso-índice Positivo ML flow Negativo n % n % < 3 8 80,0 43 64,2 51 > 3 2 20,0 24 35,8 26 Total 10 13,0 67 87,0 77 χ 2 de Yates = 0,39 p = 0,5297 Total Total 266 C a d. Sa ú d e Co l e t., Rio d e Ja n e i r o, 17 (1): 261-271, 2009
P r e v a l ê n c i a d e a n t i c o r p o a n t i PGL-1 e m c o n t a t o s domiciliares d e p a c i e n t e s c o m h a n s e n í a s e 4. Discussão De 234 contatos domiciliares estudados, a maior proporção de contatos do sexo feminino examinada poderia ser explicada pela dificuldade de os contatos do sexo masculino comparecerem ao serviço e submeterem-se aos exames, em virtude de sua maior participação no mercado de trabalho. A prevalência do anticorpo anti-pgl-1 na população estudada foi de 15,0%. Os resultados da sorologia anti-pgl-1 quando relacionados com forma clínica e índice baciloscópico dos casos índices, idade e sexo dos contatos não apresentaram diferença estatisticamente significante. Entre os casos-índice, observou-se diferença na proporção de MB em relação a PB (62,3% e 37,7%, respectivamente) com significância estatística em nível de 5% (p = 0,0038). Levando-se em consideração que a proporção de pacientes MB entre os casos novos detectados no período do estudo, na FUAM, foi de 55,86% e, tendo sido a amostra de contatos selecionada de modo aleatório, não seria esperado encontrar essa diferença. Possivelmente o tempo de tratamento mais curto dos casos PB contribuiu para que esses pacientes que já se encontravam de alta por cura, apesar de convidados, não comparecessem para trazer seus contatos. Dos 43 casos-índice MB, 46,0% apresentavam baciloscopia de pele negativa, a possível explicação para esse achado seria decorrente da utilização da classificação operacional que leva em consideração o número de lesões cutâneas, e não o resultado da baciloscopia no diagnóstico de formas multibacilares, conforme já registrado na literatura (Scollard et al., 2004). Ao proceder-se à análise simultânea dos grupos (LL, BL, BB, BT e TT) com base na Classificação de Ridley e Jopling (1966) em relação ao resultado do teste ML flow entre os contatos, apesar de não ser possível aplicar o teste estatístico, observou-se que 22,2% dos contatos de LL apresentaram teste positivo, seguido de contatos de Borderline Lepromatosa (BL), Borderline Borderline (BB) e BT. O maior percentual (18,7%) de soropositividade do sexo feminino entre os contatos domiciliares poderia ser explicado pelo predomínio de mulheres no grupo selecionado. Não se observou significância estatística quanto à frequência de positividade ao teste, em relação ao grupo etário dos contatos examinados, semelhante ao estudo realizado por Menzel et al. (1987). A positividade ao teste no grupo estudado não mostrou relação com a carga bacilar do caso-índice, ao contrário do observado por Klatser et al. (1996) e Bakker et al. (2004). Na literatura há registros de que em áreas endêmicas, a prevalência do PGL-1 em contatos varia de 12,0 a 20,0% (Chanteau et al., 1987; Gonzalez-Abreu et al., 1989). A soropositividade de 15,0% encontrada entre os contatos domiciliares incluídos no estudo foi superior aos achados de Gonzalez-Abreu et al. (1989), C a d. Sa ú d e Co l e t., Rio d e Ja n e i r o, 17 (1): 261-271, 2009 267
R o s s i l e n e Co n c e i ç ã o d a Si l v a Cr u z, Ma r i a d a Gr a ç a So u z a Cu n h a, Fe l i c i e n Go n ç a l v e s Vá s q u e z que registraram 9,3% de positividade em estudo realizado em Cuba e próxima à percentagem de soropositividade, 13,3%, encontrada por Sulçebe e Nakuçi (1990) na Albânia e por Cho et al. (1991) em estudo realizado nas Filipinas, quando encontraram uma prevalência de 13,4% de contatos soropositivos. Segundo Cunanan (1998), o risco relativo de adoecer foi 26 vezes maior em contato domiciliar do que em contatos da comunidade e o risco relativo do contato soropositivo desenvolver a doença foi 24 vezes maior quando comparado com contatos soronegativos, sendo, ainda, 47 vezes maior o risco de o contato soropositivo desenvolver a forma MB da doença. Tada et al. (2003) mostram que o risco de adoecer entre os contatos foi de 1,9 vez em contatos de doentes PB e de 5,7 vezes em contatos de MB; o risco de adoecer entre os contatos intradomiciliares foi 3,8 vezes maior e o risco de adoecimento foi 27 vezes maior entre contatos soropositivos. Em nosso estudo, dois contatos soronegativos desenvolveram a forma paucibacilar, sendo os mesmos contatos de pacientes multibacilares, semelhante ao ocorrido em outros estudos (Tada et al., 2003, Cellona et al., 1993, Sinha et al., 2004). A interpretação desse achado pode levar em consideração que mais de 50% dos casos PB apresentam sorologia negativa para o anti-pgl-i e o período de incubação nas formas PB é mais curto do que nas formas MB. Desse modo, os contatos com sorologia positiva teriam maior probabilidade de, ao adoecerem, o fazerem na forma MB e mais tardiamente. O ML flow, com alto grau de concordância com o teste de ELISA (Burher- Sékula et al., 2003), facilitou a realização de estudos de campo como este, que teve como objetivo estudar a prevalência do anticorpo anti-pgl-1 no sangue periférico de contatos de pacientes com hanseníase. O tempo de duração do estudo foi curto para avaliar a frequência de casos entre os contatos domiciliares. Porém, numerosos estudos têm registrado que os contatos domiciliares apresentam um maior risco de adoecer e, quando soropositivos, existe maior probabilidade de adoecerem da forma MB (Cunaman et al., 1998). Faz-se necessário o seguimento dos contatos com sorologia positiva, visando à detecção precoce dos que venham a desenvolver a doença no futuro, especialmente na forma multibacilar. A interrupção da transmissão da hanseníase é um dos grandes desafios para os programas de controle, já que não existem evidências consistentes de que tenha sido reduzida após a introdução da poliquimioterapia. *Agradecimentos: Agradecimento aos voluntários que participaram do estudo, às Irmãs Missionárias de Maria pela contribuição financeira para aquisição dos kits ML flow e à FAPEAM (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas) pelo apoio financeiro no desenvolvimento do estudo. 268 C a d. Sa ú d e Co l e t., Rio d e Ja n e i r o, 17 (1): 261-271, 2009
P r e v a l ê n c i a d e a n t i c o r p o a n t i PGL-1 e m c o n t a t o s domiciliares d e p a c i e n t e s c o m h a n s e n í a s e Referências Ba c h, M. A.; Wa l l a c h, D.; Fl a g e u l, B.; Hoffenbach, A.; Co t t e n o t, F. Antibodies to phenolic glycolipid-1 and to whole Mycobacterium leprae in leprosy patients: evolution during therapy. International Journal of Leprosy. v. 54, n. 2, p. 256-267, 1986. Ba k k e r, M. I.; Ha t t, M.; Kw e n a n g, A.; Fa b e r, W. R.; Va n Be e r s, S. M.; Kl a t s e r, P. R.; Os k a m, L. Population survey to determine risk factors for Mycobacterium leprae transmission and infection. International Journal of Epidemiology. v. 33, n. 6, p. 1329-1336, 2004. Bü h r e r-sekula, S.; Sm i t s, H. L.; Gu s s e n h o v e n, G. C.; Le e u w e n, J.; Am a d o r, S.; Fujiwara, T.; Kl a t s e r, P. R.; Os k a n, L. Simple and Fast Lateral Flow Test for classification of leprosy patients and identification of contacts with high risk of developing leprosy. Journal of Clinical Microbiology. v. 41, n. 5, p. 1991-1995, 2003. Bü h r e r-sékula, S.; Visschedijk, J.; Grossi, M. A.; Dh a k a l, K. P.; Na m a d i, A. U.; Kl a t s e r, P. R.; Os k a m, L. The ML flow test as a point of care test for leprosy control programmes: potential effects on classification of leprosy patients. Leprosy Review. Inglaterra, v. 78, n. 1, p. 70-79, 2007. Ce l l o n a, R.; Wa l s h, G. P.; Fa j a r d o, T. T.; Ab a l o s, R. M.; De La Cruz, E. C.; Gu i d o-villahermosa, L.; Felicio-Balagon, M. V.; St e e n b e r g e n, G. J.; Do u g l a s, J. T. Cross-sectional assessment of ELISA reactivity in leprosy patients, contacts, and normal population using the semisynthetic antigen natural disaccharide octyl bovine albumin (ND-O-BSA) in Cebu, the Philippines. International Journal of Leprosy. v. 61, n. 2, p. 192-198, 1993. Ch a n t e a u, S.; Ca r t e l, J. L.; Gu i d i, C.; Pl i c h a r t, R.; Ba c h, M. A. Seroepidemiological study in 724 household contacts of leprosy patients in French Polynesia using disaccharide-octyl-bsa antigen. International Journal of Leprosy. v. 55, n. 4, p. 626 632, 1987. Ch a n t e a u, S.; Ca r t e l, J. L.; Ce l e r i e r, P.; Pl i c h a r t, R.; De s f o r g e s, S.; Ro u x, J. PGL-I antigen and antibody detection in leprosy patients: evolution under chemotherapy. International Journal of Leprosy. v. 57, n. 4, p. 735-743, 1989. Chanteau, S.; Gl a z i o u, P.; Pi c h a r t, C.; Lu q u i a u d, P.; Pl i c h a r t, R.; Fa u c h e r, J.; Ca r t e l, J. L. Low predictive value PGL-1 serology for the early diagnosis of leprosy in family contacts: results of a 10 year prospective field study in French Polynesia. International Journal of Leprosy. v. 61, n. 4, p. 533-541, 1993. C a d. Sa ú d e Co l e t., Rio d e Ja n e i r o, 17 (1): 261-271, 2009 269
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