X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 23 O PERFIL DE EXPRESSÃO DO GENE KCNJ11 AFETA CARACTERÍSTICAS RELACIONADAS COM EFICIÊNCIA ALIMENTAR EM BOVINOS THE EXPRESSION PROFILE OF KCNJ11 GENE AFFECTS EFFICIENCY-RELATED TRAITS IN CATTLE Kamila de Oliveira da Rosa (1) Polyana Cristine Tizioto (2) Gustavo Gasparin (3) Gerson Barreto Mourão (3) Luiz Lehmann Coutinho (3) Luciana Correia de Almeida Regitano (4) Abstract Genes involved in metabolic pathways associated to feed efficiency traits are sought for better understanding the underlying molecular and regulatory mechanisms related to them. The KCNJ11 gene ispotentially a functional candidate for these traits since it is involved in pathways regulating energy metabolism and insulin secretion in cattle and regulation of glycogen storage and body fat in mice. Thus, this study aimed to determine whether the transcriptional profile ofkcnj11 gene is associated with feed efficiency-related traits. Steers totaling 593 Nellore were evaluated for the feed efficiency traits, of which 79 were used to analyze the expression profile of KCNJ11 gene in muscle. Quantitative cycle values (Cq)were corrected using BLUP estimates predicted by a model that considered fixed and random effects originated from the experimental design and other variables. After adjusting the Cq values, a mixed model which includes effects of slaughter, birth location, kinship and age was applied to assess the association between the level of KCNJ11 expression and the target traits. The expression levels of KCNJ11 gene were associated with daily weight gain calculated by regression (kg/day), Dry matter intake (kg/day), total digestible nutrients (kg/day) and relative growth rate (%/day), however, no significant association was found for feed efficiency 1 Aluna de Mestrado em Genética e Melhoramento Animal, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, SP; 2 Pós doutoranda, Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos, SP; 3 Professor do departamento de Zootecnia da Esalq-USP, Piracicaba, SP; 4 Pesquisadora, Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos, SP. E-mail: oliveira.kamila@ymail.com
X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 24 (Kg/kg) and efficiency of weight gain (kg/mcal). These results contribute to the understanding of the molecular mechanisms that affect feed efficiency. Keywords:qPCR, Nelore, residual feed intake, feed conversion 1 Introdução Disputa de área entre a pecuária brasileira e grãos/ cana-de-açúcar é uma das mudanças estruturais que vem acontecendo. Esta competição tende a prosseguir e vai exigir que a bovinocultura de corte seja cada vez mais eficiente no Brasil (POLL et al, 2013). O conhecimento do perfil transcricional de genes candidatos pode auxiliar no entendimento de mecanismos moleculares e regulatórios que afetam características de interesse para a pecuária. O gene KCNJ11pode ser um candidato funcional paracaracterísticas relacionadas à eficiência alimentar. Em bovinos este gene está envolvido com a via metabólica de diabetes, integração do metabolismo energético e regulação da secreção de insulina (http://www.reactome.org/reactomegwt/entrypoint.html). Além disso, um estudo em camundongos demonstrou o papel deste gene na redução de depósitos de glicogênio e gordura corporal (ALEKSEEV et al., 2010). Desta forma, este estudo objetivou verificar se os níveis de expressão do gene KCNJ11 estão associadoà características deeficiência alimentar e a medidas de consumo alimentar residual(car). 2 Material e Métodos 593 novilhos foram gerados a partir de 34 touros registrados da raça Nelore, escolhidos de forma a representar reprodutores típicos da raça. Os novilhos gerados nasceram em três estações de monta por meio de inseminação artificial em tempo fixo (IATF), sendo nos anos de 2007, 2008 e 2009. Foram criados na base física da Embrapa Pecuária Sudeste (São Carlos/SP), na Embrapa Gado de Corte, situada (Campo Grande/MS), e em três propriedades particulares dos Estados de Mato Grosso do Sul e Mato Grosso, após a recria foram confinados na Embrapa Pecuária Sudeste, onde foram avaliados para a característica de eficiência alimentar. No período de confinamento, a dieta foi fornecida duas vezes ao dia e a quantidade de ração oferecida (mistura total composta de silagem de milho + concentrado) foi ajustada em função das sobras observadas, procurando garantir consumo à vontade (ad libitum). A dieta fornecida aos animais foi formulada para ter 13% de proteína bruta e 71% de nutrientes digestíveis totais, numa proporção de 60:40 (volumoso:concentrado).
X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 25 As medidas de desempenho mensuradasforam:ea (eficiência alimentar (Kg/Kg))calculada utilizando os dados de consumo individual diário de matéria seca, ganho de peso e conversão alimentar;cms (consumo de matéria seca (Kg/dia)) obtido pela diferença entre a oferta e a recusa; GPDREG (ganho de peso diário calculado por regressão (kg/dia)) calculado para cada animal a partir do coeficiente de inclinação da reta resultante da regressão das medidas individuais de peso vivo sem jejum; CNDT (consumo de nutrientes digestíveis totais (kg/dia)) e EFGP (eficiência de ganho de peso (kg/mcal)) foram calculadas levando em consideração o GPD (ganho de peso diário (kg/dia) e PVMM (peso vivo médio metabólico(kg0,75); ea medida da TRC (taxa relativa de crescimento (%/dia)) medida a partirdo ganho de peso referente aotamanho instantâneo do corpo. Após cerca de 100 dias de confinamento, os animais foram abatidos para avaliação de composição e qualidade da carcaça e da carne. Apesar dos valores BLUP para eficiência alimentar terem sido estimados para os 593 novilhos, destes, apenas 79 amostras de músculo, provindas de uma mesma safra e local de confinamento,foram utilizadas para realização do presente estudo. No momento do abate foram coletadas amostras de músculo longissimusdorsias quais foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e mantidas em freezer -80 º C. A extração de RNAdo de tecido muscular foi realizada utilizando o reagente Trizol (Invitrogen ), seguindo as instruções do fabricante. Após a quantificação do material extraído,1μg de RNA total de cada amostra foi utilizado para realizar a síntese de cdna (DNA complementar) feita a partir do ImProm-II Reverse Transcription System kit (Promega). Para a análise da expressão do gene KCNJ11 foi utilizando o sistema de detecção LightCycler 480 (Roche). Os três genes escolhidos como referência foram:rpl-19 (ribosomalprotein L19), GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) e EEF1A (Eukaryoticelongationfactor 1A).As análises estatísticas e os ajustes do ciclo de quantificação (Cq) foram realizados utilizando a metodologia adotada por Tiziotoet al, 2013. Foi utilizado um modelo linear geral misto, que considera os efeitos fixos e aleatórios originados a partir do desenho experimental e outras variáveis, de acordo com a seguinte equação:y ij = μ + G i + S j + e ij, onde:y ij é o Cqpara cada gene i na amostra j;μ é a media geral do Cq;G i é o efeito fixo para o gene i th (i=1,..., 5);S j é o efeito aleatório associado com a amostra considerando s j ~ NID (0, σa 2 );eij é efeito aleatório residual, com e ij ~ NID (0, σe 2 ).Após o ajuste dos valores de Cq, um modelo linear geral misto que inclui efeitos de local de nascimento, parentesco e
X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 26 idade,foi aplicado para verificar a associação entre osníveis de expressão do genekcnj11e as características de interesse. 3 Resultados e Discussão Os níveis de expressão do gene KCNJ11 encontram-se associados (P 0,05) com GPDREG, CMS, CNDT e TRC, no entanto, não foi encontrada associação significativa paraas características deea (P 0,2174) e EFGP (P 0,2286). Níveis mais baixos de expressão do gene KCNJ11 foram relacionados com menor GPDREG, CMSc, CNDTc e TRCc (Tabela 1). Um estudo realizado por Alekseevet al. (2010) mostrou que o nocaute do gene KCNJ11 em camundongosprovoca menor peso corporal, maior gasto energético e fraqueza muscular, reforçando os resultados que obtivemos neste estudo para bovinos. Outro estudo conduzido por Tiziotoet al. (2013) demonstrou que níveis mais baixos de expressão do gene KCNJ11 foram relacionados com carne mais macia. Sendo assim, níveis de expressão mais baixos do gene KCNJ11têm efeitos positivos para características de qualidade de carne, no entanto, parecem influenciar de maneira negativa características relacionados com EA. Tabela 1 - Valores de efeito estimado e P valor das características associadas. Característica Efeito estimado ±EP P valor GPDREG -0,02984 ±0,01437 0,0419 CMS -0,1065 ± 0,05282 0,0478 CNDT -0,09145 ± 0,04405 0,0417 TRC 0.00274 ± 0.001347 0,0461 4 Conclusões Níveis mais baixos de expressão do gene KCNJ11estão relacionados com consumo alimentar, ganho de peso calculado por regressão e taxa relativa de crescimento. Estes resultados contribuem para melhor conhecimento dos mecanismos moleculares que afetam a eficiência alimentar em bovinos. Comparando os resultados obtidos neste estudo com os de
X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 27 um estudo previamente descrito,constatamos que os níveis de expressão menores do gene KCNJ11 pode influenciar positivamente a maciez de carne, no entanto, devem afetar de maneira negativa características relacionados com eficiência alimentar em bovinos de corte da raça Nelore. 5 Apoio Financeiro CAPES, FAPESP n o processo 2010/06515-4 e CNPq. 6 Referências ALEKSEEV, A.E. et al. Sarcolemmal ATP-Sensitive K+ Channels Control Energy Expenditure Determining Body Weight. CellMetabolism. v.11, p. 58 69, 2010. POLL, H. et al. Pronto para ir além Anuário Brasileiro da pecuária 2013 Editora: Gazeta Santa Cruz, Santa Cruz do Sul/RS, 2013. TIZIOTO, P.C. et al. Identification of KCNJ11 as a functional candidate gene for bovine meat tenderness. Physiol Genomics. v.45, n.24, p.1215-21, 2013.