MICROBIOLOGIA BÁSICA ENZIMAS, DESIDROGENASE, CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA, ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA E QUOCIENTE METABÓLICO MARCELO DE ANDRADE BARBOSA Doutorando em Agronomia (Ciência do Solo) - UNESP Jaboticabal SP 2016
COMPOSIÇÃO DAS PLANTAS 70 a 90% = H 2 O 10 a 30% = Matéria Seca +/- 96% = C, O e H +/- 45% = C Taiz e Zeiger (2012). +/- 45%= O +/- 6%= H +/- 4% Minerais (Fertilizantes, Ciclagem, Fixação biológica...) +/- 3,5% = N, P, K, Ca, Mg e S +/- 0,5% = Zn, B, Mn, Fe, Si e Cu
Mineralização do nitrogênio Aminização N org. R-NH 2 + CO 2 + outros produtos + E Amonificação R-NH 2 + H 2 O NH 3 + R-OH + E NH 3 + H 2 O NH 4+ + OH - Nitrificação 2NH 4+ + 3O 2 2NO 2- + O 2 Nitrosomonas Nitrobacter 2NO 2- + 2H 2 O + 4H + + E 2NO 3- + E
Por que os microrganismos atuam nos processos de ciclagem de nutrientes?
ESTRUTURAS DE ARMAZENAMENTO DE NUTRIENTES Polihidroxibutirato (PHB) Glicogénio Vacúolo Nitrato Protozoários
ESTRUTURAS DE ARMAZENAMENTO DE NUTRIENTES Sulfeto de hidrogênio Intra e extra-celular
ENZIMAS Definição: As enzimas são proteínas especializadas em catalisar reações biológicas (LEHNINGER et al., 1995).
ORIGEM DAS ENZIMAS NO AMBIENTE 346 isolados Mata atlântica P. Solo P. Planta Figura 1. Percentual de isolados microbianos a partir do solo, planta, e amostras de água com a atividade de cada um dos cinco enzimas investigadas. Fonte: Alves et al., (2014).
ORIGEM E OCORRÊNCIA DAS ENZIMAS NO SOLO Biônticas ou endoenzimas? Abiônticas ou exoenzimas? e Melo (1988).
ESTUDOS ENZIMÁTICOS EM AMOSTRAS DE SOLO Amostragem de solo
ESTUDOS ENZIMÁTICOS EM AMOSTRAS DE SOLO Temperatura Armazenamento Umidade Fonte: Longo e Melo (2005)
DESIDROGENASE Importante na oxidação da matéria orgânica Enzima da membrana envolvida no processo de transporte de elétrons, que é acoplado a síntese ATP. Ocorre apenas em células intactas (vivas) Correlação + com o consumo de O 2 Não acumula extracelularmente Moreira e Siqueira (2006)
MÉTODO DE DETERMINAÇÃO Taxa de redução do TTC (trifeniltetrazolium chloride) (Aceptor artificial de elétrons) Para TPF (trifenil formazan)
PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 1- Pesar 3 g de solo seco (< 2 mm) em tubo de ensaio 18 x 180.
PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 2- Adicionar 0,03 g de carbonato de cálcio em cada tubo, agitar em agitador de tubos.
PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 3- Pipetar 0,5 ml de cloreto de 2,3,5 tripheniltetrazolio (TTC). 4- Pipetar 1,3 ml de água destilada em cada tubo.
PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 5- Vedar os tubos com filme plástico (PVC), e agitar vagarosamente entre as mãos. 6- Encubar em banho maria a 37 C por 24 horas.
PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 7- Inserir 10 ml de metanol e agitar.
PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 8- Filtrar em papel filtro Whatman 42, transferindo para erlenmeyers de 125 ml.
PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 9- Fazer leitura em especfotômetro com absorbância de 485 nm. 10- Fazer cálculo, com auxílio de curva padrão.
Influência do manejo e da adubação na atividade enzimática da desidrogenase a longo prazo Eficiência da taxa oxidativa Figura 2. Atividade enzimática da desidrogenase em solo de área de plantio de milho cultivado em sistema convencional, com adubação com ureia (PC M) e com esterco bovino (PC E), plantio direto com adubação com ureia em sucessão milho/milho (PD M/M) e leguminosa/milho (PD L/M). Fonte: Barbosa (2015).
Influência do manejo e da adubação na atividade enzimática da desidrogenase a longo prazo Figura 3. Atividade da desidrogenase sob a aplicação a longo prazo de adubo orgânico e mineral, em rotação trigo e milho. Fonte: Chu et al. (2007).
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA Parte viva da MOS, representando de 2 a 5% desta fração no solo (JENKINSON; LADD, 1981). Composto por diversas espécies de microrganismos (HUNGRIA et al., 2009).
COMO ANALISAR? Os métodos mais freqüentemente utilizados para determinação da biomassa microbiana são fumigação-incubação (JENKINSON e POWLSON, 1976), fumigação-extração (VANCE et al., 1987) e irradiação com microondas (ISLAM e WEIL, 1998).
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 1- Pesar 10 g de solo em Erlenmeyer de 250 ml.
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 2- Capacidade de Campo a 70 ou 100%?
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 3- Irradiados e não irradiados
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 4- Solução de Sulfato de Potássio
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 5- Agitador Horizontal, 30 minutos.
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 6- Filtrar
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 7- Pipetar 10 ml do extrato para Erlenmeyer de 125 ml.
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 8- Pipetar 2 ml de dicromato de potássio para os Erlenmeyers de 125 ml.
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 9- Pipetar 10 ml de ácido sulfúrico, aguardar esfriar e, em seguida acrescentar 50 ml de água deionizada.
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 10- Inserir quatro gotas de phenanthroline (ferroin) e títular com sulfato ferroso amoniacal.
Permite: ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA Avaliar a atividade biológica do solo, sendo definida como a produção de CO 2. Quociente Metabólico Corresponde à razão entre o carbono da biomassa microbiana (CBM) e atividade respiratória microbiana (ARM). Reflete processos importantes relacionados às adições e transformações da matéria orgânica. Em situação em que a biomassa experimenta algum fator de estresse (deficiência de nutrientes, acidez, déficit hídrico...).
ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA 1- Pesar 100 g de solo em vidro.
ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA 2- Colocar o solo em 100% da capacidade de campo.
ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA 3- Inserir dois beckers no interior do vidro (1 contendo 20 ml de NaOH e outro com 20 ml de água destilada, vedar a boca do vidro com filme plástico).
ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA 4- Incubar por, quatro, sete ou dez dias?
ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA 5- Adicionar aos Beckers 2 ml de solução de cloreto de bário a 30% e 3 gotas de fenolftaleína a 1%.
APLICAÇÕES Figura 4. ARM e CBM em solo sob plantio de milho em manejo convencional, adubado com esterco bovino.
APLICAÇÕES Figura 5. qco 2 em solo sob plantio de milho em manejo convencional, adubado com esterco bovino.
APLICAÇÕES Figura 6. CBM sob a aplicação a longo prazo de adubo orgânico e mineral, em rotação trigo e milho. Fonte: Chu et al. (2007).
CONSIDERAÇÕES FINAIS Obrigado pela atenção! barbosamarcelo.unesp@hotmail.com