EFEITO DO PROCESSO DE OZONIZAÇÃO NA DEGRADAÇÃO DE DESOXINIVALENOL E NA QUALIDADE DA FARINHA DE TRIGO INTEGRAL

EFEITO DO PROCESSO DE OZONIZAÇÃO NA DEGRADAÇÃO DE DESOXINIVALENOL E NA QUALIDADE DA FARINHA DE TRIGO INTEGRAL A.P.S.Alexandre 1, N.Castanha 2, M.A.Calori-Domingues 3, P.E.D.Augusto 4 1-Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição (LAN), Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ) da Universidade de São Paulo (USP) CEP: 13418-900 Piracicaba SP Brasil, Telefone: (19) 3429-4196 Fax: (19) 3422-5678 e-mail: (allana@usp.br) 2- LAN/ESALQ/USP e-mail: (nanci.castanha@gmail.com) 3- LAN/ESALQ/USP e-mail: (macdomin@usp.br) 4- LAN/ESALQ/USP e-mail: (pedro.ed.augusto@usp.br) RESUMO A combinação de fatores ambientais pode resultar na infecção de plantas por fungos, e consequentemente por micotoxinas, como a Desoxinivalenol (DON). DON é frequentemente encontrado em grãos e derivados, comprometendo sua segurança e comercialização. A degradação de compostos indesejáveis por oxidação é bastante utilizada, sendo o ozônio (O 3) uma alternativa interessante. A ozonização, tecnologia emergente, apresenta fácil aplicação, segurança, baixo custo e baixo impacto ambiental. Neste trabalho avaliou-se a descontaminação de DON em farinha de trigo integral (FTI) com ozônio, em amostras com 10 e 25% de umidade por 120 minutos. Os resultados foram promissores, obtendo-se uma degradação de 78% no valor de DON. Além disso, o impacto nas propriedades reológicas utilizando RVA também foram avaliados, observando-se uma diminuição nas viscosidades aparentes máxima e final e no setback. Portanto, o ozônio foi eficaz na degradação de DON, porém alterando a reologia da FTI - destacando-se a necessidade de mais estudos. ABSTRACT The combination of environmental factors can result in infection of plants by fungi, and consequently mycotoxins, as Desoxynivalenol (DON). DON is frequently found in grains and derivatives, compromising their safety and commercialization. The degradation of undesirable compounds by oxidation is widely used, been the ozone (O 3) an alternative of interest. The ozonation, an emerging technology, is easy to use, safe and with low cost and low environmental impact. In this work, the decontamination of DON in whole wheat flour by processing it with ozone was evaluated, in samples with 10 and 25% of moisture for 120 minutes. The obtained results are promising, yielding a degradation of 78% in the amount of DON. Furthermore, the impact of ozonation in the rheological properties were evaluated by using RVA, resulting in a decrease in the maximum and final apparent viscosities and setback. Therefore, the ozone was effective in the degradation of DON, but changing the rheological profile of the flour - highlighting the need for further studies. PALAVRAS-CHAVE: micotoxinas, farinha de trigo, ozônio, descontaminação, tecnologias emergentes. KEYWORDS: mycotoxins, wheat flour, ozone, decontamination, emerging technologies. 1. INTRODUÇÃO As micotoxinas são metabólitos secundários, produzidos sob condições específicas por alguns fungos e que podem causar sérios danos à saúde humana e animal, além de perdas econômicas ao

agronegócio. Dentre as principais micotoxinas estudadas no mundo, os tricotecenos (desoxinivalenol (DON), nivalenol, toxina T-2, diacetoxiscirpenol), já foram detectadas em diversos tipos de alimentos, como milho, arroz, trigo, soja, cevada, centeio e em rações animais (Cast, 2003). Embora haja variações geográficas e climáticas na produção e ocorrência de micotoxinas, a exposição a essas substâncias ocorre em todo o mundo, das quais cerca de 25% da oferta mundial de alimentos apresentam presença positiva de alguma micotoxina (Park et al., 1999), representando um problema de saúde pública. Uma maneira de minimizar parte dos riscos associados à contaminação por micotoxinas é a aplicação de um sistema de gerenciamento da mesma. No entanto, há situações que a presença de micotoxina é inevitável, mesmo adotando-se todas as boas práticas. Durante o desenvolvimento das culturas no campo, podem ocorrer condições climáticas que favorecem as infecções fúngicas (Calori- Domingues et al., 2016). Por tal razão, é de extrema importância o desenvolvimento de alternativas que reduzam a contaminação por micotoxinas em produtos agrícolas, seus derivados e coprodutos. Um método de descontaminação promissor é a utilização do ozônio (O 3). O ozônio é um gás com alto potencial oxidante, gerado eletricamente no momento da utilização, e que não deixa resíduos, sendo considerado um "processo químico verde" (Green Chemical Process). O ozônio é reconhecido como substância segura - Generally Recognised As Safe (GRAS, em inglês) - e sua utilização, sob fase gasosa ou aquosa está regulamentada pelo FDA, em produtos agrícolas in natura (FDA, 2001, Rice e Graham, 2001). O presente trabalho teve por objetivo quantificar o efeito do ozônio na descontaminação de desoxinivalenol (DON) em farinha de trigo integral, bem como avaliar seu efeito nas propriedades reológicas do produto. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Obtenção e Preparo da Farinha de Trigo Integral Foram avaliadas amostras de farinha de trigo integral provenientes de grãos naturalmente contaminados, condizentes com a distribuição natural das micotoxinas e as condições reais de campo. As amostras continham em média 3.201±862 µg/kg de DON. O ozônio se decompõe mais facilmente em presença de água do que na atmosfera, formando assim radicais livres, que são poderosos oxidantes (Wu et al., 2006). A presença de água, portanto, acelera o processo de reação do ozônio, tornando importante o aumento da umidade da amostra a ser processada. Assim, aumentou-se a umidade inicial da amostra da farinha de trigo integral de 10% para 25±1% através de pulverização de água e acondicionamento em recipiente fechado sob refrigeração (5 C) durante 5 dias. O teor de água da amostra foi determinado empregando-se o equipamento Moisture Analyzer (A&D company, modelo AND MX-50, Japão). 2.2 Ozonização das amostras O sistema de ozonização foi constituído por uma unidade geradora de ozônio (Ozone & Life, modelo O&L 3.0 RM, São José dos Campos, Brasil) a partir de oxigênio gasoso industrial (95%). O gerador de ozônio estava ligado a um reator cilíndrico de vidro. Cerca de 15 g de amostra foram colocadas dentro do reator, onde uma corrente gasosa de 0,5 L/min rica em ozônio foi conduzida a partir da parte superior do reator até a base, percolando a amostra durante 120 minutos a uma concentração de ozônio na corrente gasosa de 71 mg/l. Após contato com as amostras, a corrente de

gás foi conduzida para fora do reator e convertida a oxigênio em um destruidor térmico de ozônio (Ozone & Life, São José dos Campos, Brasil). Após o processamento, as amostras foram acondicionadas em sacos de polietileno que foram selados e armazenados a temperatura de -18 C até o momento da análise. 2.3 Análise de Micotoxinas A análise de DON foi baseada na metodologia empregada por Pascale et al. (2014), associadas às recomendações do fabricante de colunas de imunoafinidade (NEOCOLUMN DON, S.D., UK). A extração foi realizada com água destilada e a purificação dos extratos em coluna de imunoafinidade (NeoColumm TM 8340 para DON, NeogenCo. Ayr, UK). A separação e quantificação foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e detector de arranjo de diodos (DAD). O cromatógrafo (Shimadzu, Kyoto, Japão) foi constituído por bomba (LC-20AT) com câmara de misturas de solventes (FCV-10AL vp), degaseificador (DGU-20A5), injetor automático (SIL-20A) e forno (CTO-20A) mantido a 40 C. A separação cromatográfica de DON foi realizada utilizando coluna Hypersil ODS (dimensão: 250 x 4,6 mm, tamanho da partícula: 3 μm Thermo, Bellefonte, PA, USA). A fase utilizada foi constituída de água:acetonitrila (92:8 v/v) com vazão de 0,8 ml/min e volume de injeção de 50 μl. A identidade de DON foi confirmada por meio da sobreposição do espectro de absorção no pico representativo das amostras analisadas e das soluções padrões de referência (λ = 219 nm), e da verificação da similaridade. Os resultados das concentrações antes e após os processos foram expressos em base seca para avaliação da diminuição efetiva da contaminação. 2.4 Propriedades reológicas da farinha de trigo integral As propriedades reológicas foram avaliadas utilizando o equipamento o Rapid Visco Analyzer (RVA, Newport Scientific Pvt. Ltd., Austrália) com o software Thermocline for windows (versão 3.0, Newport Scientific, Warriewood, Austrália). Empregou-se 3 g da amostra (corrigido para 14% de umidade) e 25 g de água destilada; a suspensão foi mantida a 50 C durante 1 minuto, em seguida foi aquecida durante 4 minutos, até atingir a temperatura de 95 C, na qual foi mantida por cerca de 2 minutos e 30 segundos, sendo em seguida resfriada por cerca de 3 minutos e 30 segundos até atingir novamente 50 C, sendo mantida a esta temperatura por mais 2 minutos. A viscosidade aparente da suspensão foi determinada ao longo do ciclo. 2.5 Análises Estatísticas Os processamentos e as análises foram realizados no mínimo em duplicata. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o software Statistica 13.0 (StatSoft, USA), onde foram calculadas as médias e aplicado o teste de Tukey para comparações múltiplas. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Efeito do processo de ozonização na concentração de DON A contaminação da farinha de trigo integral continha em média 3.201±862 µg/kg, acima dos limites máximos toleráveis (LMT) pela Legislação brasileira (Brasil, 2011) e Comunidade Europeia

(European Commission, 2006), que são de 2.000 µg/kg, no entanto a partir de 2017 esse limite será de 1.000 µg/kg, e 750 µg/kg, respectivamente, destacando a escolha da amostra. A Figura 1 apresenta a variação na concentração de DON em farinha de trigo integral com 10% e 25% de umidade, antes e após o tratamento com ozônio, destacando a eficiência dessa tecnologia na descontaminação da amostra avaliada. Após 120 min de processo, nas condições utilizadas, pode-se observar que a concentração de DON na farinha com 25% de umidade diminuiu significativamente (p<0,05) de 3.340±459 µg/kg para 727±88 µg/kg, correspondendo degradação de 78%. Na farinha com 10% de umidade, a concentração diminuiu para 2.311±807 µg/kg, correspondendo à degradação de 24,5%. Esse resultado expressa que, após o processo de ozonização a farinha de trigo integral com 25% de umidade, atendeu as condições permitidas pela Legislação brasileira quanto ao LMT, enquanto a farinha com 10% de umidade continuou imprópria para o consumo mesmo após processamento. Demonstra-se assim a possibilidade de utilização da ozonização para destruição de micotoxinas em farinhas, porém destacando-se a importância da umidade do produto na eficiência do processo. De fato, a umidade aumenta o potencial de oxidação do ozônio (Luo et al., 2014). Figura 1 Efeito do processamento com ozônio sobre DON na farinha de trigo integral com 10% e 25% de umidade e ozonizado durante 120 minutos. Wang et al. (2016b) estudaram a aplicação do ozônio em grãos de trigo naturalmente contaminados com micotoxinas, com umidades de 15 a 16% e tempo de exposição máximo de 90 minutos. Os pesquisadores observaram degradação de DON 26,4 a 53,5%. Reinholds et al. (2016) obtiveram resultado semelhante ao avaliar a ozonização para redução de DON em trigo maltado. Após 40 min de exposição, observaram redução de 16% e após 130 min, de 25%. Em outro trabalho, Wang et al. (2016a) obtiveram degradação de até 78,7% de DON em farinha de trigo integral processada com ozônio, com umidade de 20,1%. A diferença entre os resultados deve-se as concentrações e vazão do gás, que foram distintas, bem como particularidades e umidade das amostras. Savi et al. (2014) também avaliaram a eficácia do ozônio (concentrações de ozônio de 40 µmol/mol e 60 µmol/mol, com tempo de ozonização máxima de 180 minutos) na redução de DON, porém em amostras de trigo artificialmente contaminadas no pericarpo e endosperma. No pericarpo a taxa de degradação máxima foi de 86,6%, enquanto no endosperma a redução máxima foi 34%. Os autores observaram que o aumento do tempo de exposição e a dose do ozônio provocaram maior degradação, sendo o maior impacto de redução no pericarpo, a parte externa do grão em contato com ozônio. Os resultados obtidos demonstram que a ozonização foi um método eficiente na descontaminação de DON na farinha de trigo. 3.2 Avaliação das propriedades reológicas da farinha de trigo integral

Os principais parâmetros reológicos das amostras de farinha de trigo integral com 25% de umidade podem ser observados na Tabela 1. Tabela 1: Resultados de RVA para a farinha de trigo integral (FTI) a 25% de umidade antes e após tratamento com ozônio*. Viscosidade Viscosidade Temperatura de Breakdown Setback Tratamentos Aparente Aparente empastamento (mpa.s) (mpa.s) Máxima (mpa.s) Final (mpa.s) ( C) FTI* 25%, sem 441 ± 5 a 89 ± 4 b 643 ± 17 a 995 ± 22 a 88,7 ± 0,4 b ozonização FTI* 25%, ozonizado 269 ± 15 b 152 ± 3 a 120 ± 9 b 237 ± 21 b 91,5 ± 0,4 a por 120 min *Médias na mesma coluna acompanhadas da mesma letra não diferem entre si ao nível de significância de 5% (p < 0,05). No presente trabalho observaram-se alterações nas propriedades viscoamilográficas da farinha de trigo integral processada com ozônio gasoso, observando-se diminuição nos valores das viscosidades aparente máxima e final e no setback, e um aumento nos valores de breakdown e na temperatura de empastamento. Pode-se afirmar que estes resultados são devidos às alterações que ocorreram no amido e nas proteínas presentes na amostra, os quais sofreram uma oxidação devido ao tratamento com o ozônio. A viscosidade aparente máxima está relacionada à capacidade da amostra em formar ligações e, portanto, valores mais baixos deste parâmetro podem representar uma clivagem parcial de ligações após o tratamento com ozônio, que ocasionam na diminuição do peso molecular do amido e proteínas (Mei et al., 2016), menor capacidade de se associar e menor resistência ao aquecimento e ao cisalhamento. Setback está relacionado ao poder de reassociação molecular após o resfriamento da amostra (associado à retrogradação no caso de amidos). Breakdown é a diferença entre as viscosidades aparente máxima e mínima, indicando o grau de colapso da amostra durante seu aquecimento e, portanto, sua resistência à força de cisalhamento durante o aquecimento. O aumento após o processo de ozonização pode ser atribuído ao enfraquecimento da estrutura do amido na farinha (Mei et al., 2016). A temperatura de empastamento indica a temperatura em que a amostra começa a aumentar sua consistência (início da gelatinização no caso dos amidos). Todos estes parâmetros foram claramente afetados pela oxidação diminuindo assim seu poder de reassociação molecular. 6. CONCLUSÕES O processo de ozonização foi eficaz na degradação de DON, e quando associado a umidade seu efeito foi maior, permitindo que a farinha de trigo integral atendesse aos critérios estabelecidos pela Legislação. O perfil reológico da farinha também foi alterado a partir do tratamento com ozônio. Contudo, mais estudos são necessários a fim de determinar até que ponto essas alterações interferem na aplicação tecnológica da farinha, como por exemplo, na fabricação de pães. 7. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasil) pelo financiamento ao projeto n 401004/2014-7 e à Coordenação de Aperfeiçoamento

de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasil) na concessão de bolsa de doutorado à APS Alexandre e mestrado à N Castanha. 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Ministério da Saúde (2011). Dispõe sobre limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos (RDC n 7, de 18 de fevereiro de 2011). Diário Oficial da República Federativa do Brasil. Calori-Domingues, M. A., Bernardi, C. M. G., Nardin, M. S., Souza, G. V., Santos, F. G. R., Stein, M. A., Gloria, E. M., Dias, C. T. S., & Camargo, A. C. (2016). Co-occurrence and distribution of deoxynivalenol, nivalenol and zearalenone in wheat from Brazil. Food Additives & Contaminants: Part B: Surveillance, 9(2), 142-151. Council for Agricultural Science and Technology (Cast). (2003). Mycotoxins: risks in plant, animal, and human systems. Ames. Commission Regulation (EC) (2006). Setting the maximum levels for certain contaminants in foodstuffs. (EC n. 1881/2006 of 19 of December of 2006). Official journal of the European Union v. 364, 5-24. FDA. Hazard analysis and critical control point. (2001). (HACCP): procedures for the safe and sanitary processing and importing of juice; final rule, Federal Register, 66, 6137-6202. Luo, X., Wang, R., Wang, L., Li, Y., Wang, Y., & Chen. Z. (2014b). Detoxification of aflatoxin in corn flour by ozone. Journal of the Science of Food and Agriculture, 94(11), 2253-2258. Mei, J., Liu, G., Huang, X., Ding, W. (2016). Effects of ozone treatment on medium hard wheat(triticum aestivum L.) flour quality and performance in steamed bread making. CYTA Journal of Food, 14(3), 449 456. Park, D. L., Njapau, H., Boutrif, E. (1999). Minimizing risks posed by mycotoxins utilizing the HACCP concept. Food Nutrition and Agriculture, 49-54. Disponivel em: ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/x2100t/x2100t10.pdf. Pascale, M., Panzarini, G., Powers, S., & Visconti, A. (2014). Determination of Deoxynivalenol and Nivalenol in Wheat by Ultra-Performance Liquid Chromatography/Photodiode-Array Detector and Immunoaffinity Column Cleanup. Food Analytical Methods, 7(3), 555-562. Reinholds, I., Juodeikiene, G., Bartkiene, E., Zadeike, D., Bartkevics, V., Krungleviciute, V., Cernauskas, D., & Cižeikiene, D. (2016). Evaluation of ozonation as a method for mycotoxins degradation in malting wheat grains. World Mycotoxin Journal, 9(3), 409-417. Rice, R. G., & Graham, D. M. (2001). U.S FDA regulatory approval of ozone as an antimicrobial agent what is allowed and what needs to be understood. Ozone News, 29(5), 22-31. Savi, G. D., Piacentini, K. C., Bittencourt, K. O., & Scussel, V. M. (2014). Ozone treatment efficiency on Fusarium graminearum and deoxynivalenol degradation and its effects on whole wheat grains (Triticum aestivum L.) quality and germination. Journal of Stored Products Research, 59, 245-253. Wang, L., Luo, Y., Luo, X., Wang, R.; Li, Y., Li, Y., Shao, H., & Chen, Z. (2016b). Effect of deoxynivalenol detoxification by ozone treatment in wheat grains. Food Control, 66, 137-144. Wang, L., Shao, H., Luo, X., Wang, R., Li, Y., Li, Y., Luo, Y., & Chen, Z. (2016b). Effect of ozone treatment on deoxynivalenol and wheat quality. PLoS ONE, 11(1), 1-13. Wu, J. N., Doan, H., & Cuenca, M. A. (2006). Investigation of gaseous ozone as an anti-fungal fumigant for stored wheat. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 81(7), 1288-1293.