SEQÜENCIAMENTO DO PROTO-ONCOGENE RET

SEQÜENCIAMENTO DO PROTO-ONCOGENE RET Importância da identificação das mutações do proto-oncogene RET e sua atuação no desenvolvimento dos diversos fenótipos das neoplasias endócrinas múltiplas tipo 2 As neoplasias endócrinas múltiplas tipo 2 (NEM 2) são síndromes de câncer, que podem apresentar carcinoma medular da tireóide (CMT), feocromocitoma e/ou hiperparatireoidismo (HPT), o que justifica suas classificações conforme as manifestações clínicas presentes, em NEM 2A, NEM 2B e CMTF. (Tabela 1) A agressividade do CMT difere entre estes subtipos, sendo que, em ordem crescente, CMTF < NEM 2A < NEM 2B. O carcinoma medular da tireóide, responsável por 5 a 8% dos tumores malignos da tireóide, é um tumor da crista neural derivado das células C parafoliculares, que produzem principalmente calcitonina. O CMT pode ter origem esporádica (75 a 80%) ou hereditária (20 a 25%), com herança autossômica dominante, sendo a primeira manifestação neoplásica da NEM 2, devido a sua precocidade e alta penetrância (90%) e também a principal causa de morbidade. Tabela 1: Classificação da NEM 2 conforme as principais manifestações clínicas presentes e suas freqüências (%) de ocorrência NEM 2A NEM 2B CMTF CMT (95%) CMT (90%) CMT (100%) isolado em Feocromocitoma (30-50%) Feocromocitoma (50%) no mínimo 4 membros da HPT (10-20%) Ganglioneuromatose (100%) Hábitos marfanóides (65%) mesma família A NEM 2A, forma mais comum da NEM (90% dos casos), surge freqüentemente entre os 30 e 50 anos. Provém das mutações do RET que modulam a dimerização da proteína tirosino quinase, cujo resultado são diferentes fenótipos. A NEM 2B consiste numa variante extremamente agressiva (5% dos casos) e precoce, que se manifesta por CMT em 90% dos casos, feocromocitoma em 50%, além de anormalidades de desenvolvimento, incluindo hábitos marfanóides (dedos e extremidades longas), ganglioneuromas na língua, lábios e olhos e distúrbios do trato gastrointestinal (diarréia, constipação, obstrução intestinal, etc). Na NEM 2B, há alteração das propriedades catalíticas da proteína RET. O carcinoma medular da tireóide familiar (CMTF) é caracterizado pela presença isolada de CMT em múltiplos membros da família (quatro ou mais). Apresenta menor agressividade e idade de manifestação mais tardia. A GENÉTICA DA NEM 2 A NEM 2, uma síndrome autossômica dominante com penetrância dependente da idade, está relacionada ao estado ativado do proto-oncogene RET, através de mutações

missense localizadas principalmente nos exons 10, 11, 13, 14, 15 e 16. As mutações do RET são encontradas em 95% dos casos índices de NEM 2, quando o screening genético é desenvolvido rigorosamente e tem sido consideradas como a causa básica da NEM 2. A proteína RET é constituída por 3 domínios (Figura 1): 1. Domínio extracelular, constituído por regiões ricas em cisteínas, é codificado pelos primeiros 11 exons do gene. Mutações nestas cisteínas, transcritas dos codons 609, 611, 618, 620 do exon 10 e 634 do exon 11, prejudicam as ligações intramoleculares e passam a favorecer ligações bissulfeto intermoleculares, viabilizando a dimerização e fosforilação da proteína tirosino quinase RET, tornando-a ativa, mesmo na ausência de ligantes. 2. Domínio transmembrana 3. Domínio intracelular, com função na fosforilação de resíduos tirosina. Mutações nos codons 768 e 790 do exon 13 e 804, 883 e 918 dos respectivos exons 14, 15 e 16 alteram diretamente o sítio de reconhecimento do substrato no interior do domínio tirosino quinase, aumentando sua afinidade com o ligante ou alterando sua especificidade; o que resulta numa variante precoce de CMT, freqüentemente fatal, quando acomete nódulos linfáticos e órgãos à distância. Domínio extracelular: NEM 2A e CMTF Domínio transmembrana Domínio intracelular: NEM 2B e CMTF Figura 1: Representação esquemática dos exons 10, 11, 13, 14 e 16 do proto-oncogene RET. Falchetti, A; Brandi, M.L. 1998. GENÓTIPO VERSUS FENÓTIPO As mutações codons específicas do RET têm relação direta sobre os diversos fenótipos da NEM 2 (tabela 2), observando que a freqüência de cada mutação é estipulada pelo background genético da população em estudo e que a agressividade do tumor relaciona-se ao tipo de mutação apresentada. Assim, o CMT é estratificado por grau de risco 1, 2, e 3 (tabela 3). Em adição, mutações somáticas no proto-oncogene RET, principalmente M918T no exon 16 e S836S no exon 14, tem sido encontradas nos casos esporádicos de CMT, enquanto mutações germinativas do RET são encontradas em 40% dos casos de doença de Hirschsprung familiar e em 3 a 7% dos casos esporádicos desta.

Tabela 2: Mutações no Proto-oncogene RET e seus respectivos fenótipos de NEM 2. Exon Codon Aminoácido Fenótipo 10 609* Cys para Arg NEM 2A, CMTF Cys para Tyr NEM 2A 611* Cys para Tyr NEM 2A Cys para Trp NEM 2A, CMTF Cys para Gly CMTF 618* Cys para Phe NEM 2A Cys para Ser NEM 2A, CMTF Cys para Ser NEM 2A, CMTF Cys para Gly NEM 2A Cys para Arg NEM 2A, CMTF Cys para Tyr NEM 2A, CMTF Cys para Stop NEM 2A 620* Cys para Arg NEM 2A, CMTF Cys para Tyr NEM 2A Cys para Phe NEM 2A Cys para Ser NEM 2A Cys para Gly NEM 2A 11 630 Cys para Phe CMTF 634* Cys para Tyr NEM 2A, CMTF Cys para Arg NEM 2A Cys para Phe NEM 2A, CMTF Cys para Gly NEM 2A Cys para Trp NEM 2A Cys para Ser NEM 2A Cys para Ser NEM 2A, CMTF 13 768* Glu para Asp CMTF 790 Leu para Phe NEM 2A, CMTF Leu para Phe NEM 2A, CMTF 791 Tyr para Phe CMTF 14 804* Val para Leu CMTF Val para Met NEM 2B 806 Tyr para Cys NEM 2B 15 883 Ala para Phe NEM 2B 891 Ser para Ala CMTF 16 918* Met para Thr NEM 2B *O símbolo representa as mutações do proto-oncogene RET, reconhecidas pelo International RET Mutation Consortium, por estarem envolvidas na etiologia das Síndromes de Neoplasias Endócrinas Múltiplas.

Tabela 3: Classificação do risco de desenvolvimento de NEM 2 e seus componentes, de acordo com o genótipo RET dos pacientes portadores Nível de risco Codon com Fenótipo Conseqüências de NEM 2 mutação associado 1 (Baixo) 609 768 790 791 804 891 NEM 2A e CMTF * CMT de comportamento variável * CMT de crescimento lento * Idade mais tardia * Tireoidectomia total, mas não há consenso sobre a idade adequada 2 (Alto) 3 (Muito alto) Fonte: Brandi et al, 2001 611 618 620 634 NEM 2A e CMTF 883 918 922 NEM 2B NEM 2 - DIAGNÓSTICO E ACOMPANHAMENTO * Risco alto de CMT * Tireoidectomia antes dos 5 anos de idade * Maior agressividade do CMT * Tireoidectomia nos 6 primeiros meses de vida com dissecção nódulo central Baseando-se em resultados bioquímicos e genéticos, a efetuação de um diagnóstico prematuro viabiliza a intervenção cirúrgica em tempo hábil, o que pode prevenir a evolução de metástases do CMT e também aumentar a sobrevida do paciente. Conseqüentemente, diferentes protocolos de acompanhamento para indivíduos portadores ou não das mutações são utilizados. Estas melhorias ampliam-se quando a análise laboratorial pode ser somada a uma detalhada história familiar. Por outro lado, muitas vezes é a história familiar que desperta a iniciativa de se realizar os testes e que leva à conscientização da necessidade de medidas preventivas. É importante estar claro que tanto os testes genéticos quanto bioquímicos apresentam vantagens e desvantagens e que quando desenvolvidos isoladamente não permitem uma avaliação clínica eficaz do paciente e sua família. Na verdade, o papel de um é complementar o outro, de forma que juntos possam fornecer informações úteis e personalizadas na rastreabilidade, no estabelecimento do grau de risco, na prevenção, no diagnóstico e na monitorização das famílias com membros afetados pela neoplasia endócrina múltipla. Testes bioquímicos Habitualmente, o screening bioquímico é empregado para identificar manifestações clínicas da NEM 2 em indivíduos com um risco de desenvolvê-las. Calcitonina é o marcador mais empregado no screening bioquímico. A periodicidade da monitorização bioquímica é ditada pelo tipo de NEM 2 presente, pelo genótipo do RET e pelas manifestações clínicas da família. Os testes bioquímicos apresentam importância clínica na rastreabilidade fenotípica da doença, no acompanhamento pós-cirúrgico e na avaliação de indivíduos afetados ou não,

mas não é rara a ocorrência de resultados falso-positivos e falso-negativos, além da interpretação de níveis de calcitonina elevada em crianças ser ainda um pouco obscura. Em adição, estes testes não são capazes de determinar a predisposição hereditária à doença e nem o risco de seu desenvolvimento em pacientes assintomáticos. Um resultado negativo nos testes bioquímicos não exclui o risco de uma família afetada desenvolver a doença. Testes genéticos A recomendação da análise genética deve ser feita a todos indivíduos afetados e também a seus ascendentes e descendentes diretos, caso alguma mutação esteja presente. Isso permite a identificação de portadores de mutações no proto-oncogene RET, previamente ao início da sintomatologia e da morbidade e relacionadas. Geralmente, o prognóstico de pacientes NEM 2 é melhor quando o diagnóstico é precoce e há intervenção terapêutica em tempo hábil. Um indivíduo não portador de mutações no proto-oncogene RET, mas pertencente a uma família com histórico de NEM 2, apresenta baixo risco de desenvolver a doença e deve passar por monitorização bioquímica esporádica. Contudo, se um indivíduo é portador de alguma mutação no RET, este deve ser submetido a tireoidectomia total profilática e a análise bioquímica para feocromocitoma e HPT periodicamente, antes do aparecimento dos sintomas e da disseminação linfática. A recomendação de testes genéticos também se estende a CMT esporádicos, na tentativa de excluir ou incluir a hereditariedade do tumor em casos sugestivos, mas que envolvam famílias com poucos membros, tempo insuficiente para as manifestações do feocromocitoma ou do HPT, história familiar desconhecida e/ou ocorrência de mutações de novo. Portanto, em algumas situações, os resultados dos testes genéticos induzem à reclassificação do paciente quanto ao tipo de tumor apresentado, sendo comum o encontro de tumores hereditários entre tumores aparentemente esporádicos. Testes genéticos: por quê fazê-los? Identificação e intervenção precoces melhoram o prognóstico do CMT Tratamento precoce com tireoidectomia profilática é bem tolerada Maior taxa de resultados verdadeiros positivos Menor taxa de falso positivos e negativos 98% de casos índices de NEM 2 tem uma ou mais mutações RET 1-7% dos tumores esporádicos apresentem mutações RET Testes genéticos: quando são indicados? Todos casos de CMT esporádicos Suspeita de CMT hereditário Casos índices de NEM 2 e suas famílias NEM 2B Casos de feocromocitoma familiar e esporádico HPT familiar HSCR pediátrico

Prevenção Apesar de ainda não existir um consenso quanto a melhor idade para a tireoidectomia profilática, a maioria dos estudos sugerem que esta seja realizada na infância, visando remover a glândula antes que a displasia das células C progrida para carcinoma medular e que ocorra disseminação linfática. Há diversos centros de estudo investigando a possibilidade de alguma relação entre mutações específicas e época mais adequada para a cirurgia, o que pode contribuir para a diminuição das dissecções de cadeia linfinodal central e, conseqüentemente, para um menor índice de morbidade após cirurgia e maior taxa de cura. Referências bibliográficas 1. Machens A, Gimm O, Hinze R, et al. Genotype-Phenotpe correlations in hereditary medullary thyroid carcinoma: oncological features and biochemical properties. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 1104-1109. 2. Hansford J R, Mulligan L M. Multiple endocrine neoplasia type 2 and RET: from neoplasia to neurogenesis. J Med Genet 2000; 37: 817-827. 3. Smigiel R, Lebioda A, Patkowski D, et al. Single nucleotide polymorphisms in the RET gene and their correlations with Hirschsprung disease phenotype. J Appl Genet 2006; 47 (3): 261 267. 4. Brandi M L, Gagel R F, Angeli A, et al. Guidelines for diagnosis and therapy of MEN type 1 and type 2. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 5658-5671. 5. Mulligan L M, Marsh D J, Robinson B G. Genotype-Phenotpe correlations in multiple endocrine neoplasia type 2: report of the Internacional RET Mutation Consortium. J Internal Medicine 1995; 238: 343-346. 6. Eng C, Clayton D, Schuffenecker I, et al. The relationship between specific RET protoo-oncogene mutations and disease phenotype in multiple endocrine neoplasia type 2. JAMA 1996; 276: 1575-1579. 7. Falchetti A, Brandi M L. Genetic testing for multiple endocrines neoplasias. Endocrine-Related Cancer 1998; 5: 37-44.