PRODUÇÃO DE LIPASE POR Yarrowia lipolytica A PARTIR DO RESÍDUO DO PROCESSAMENTO AGROINDUSTRIAL DA MANGA (Mangifera Indica L. Var Ubá), SUPLEMENTADO COM DIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO A.S. Pereira 1, G.C. Fontes 2, P.F. F Amaral 1 1 - Departamento de Engenharia Bioquímica, Escola de Química Universidade Federal do Rio de Janeiro, CEP: 21941-909 Rio de Janeiro RJ Brasil, Telefone: 00 55 (21) 3938-7623 e-mail: (adejanildo@yahoo.com.br). 2 Departamento de Tecnologia de Processos Bioquímicos Universidade Estadual do Rio de Janeiro CEP: 20550-013 Rio de Janeiro RJ Brasil, Telefone: 00 55 (21) 2334-0138 e-mail: (gizelecf@yahoo.com.br) RESUMO O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de lipase por Yarrowia lipolytica, utilizando o resíduo do processamento da manga variedade Ubá, suplementado com diferentes fontes de nitrogênio, em fermentação submersa. Os resultados preliminares mostraram que apenas o meio de cultivo contendo casca de semente apresentou a produção de lipase, porém em baixa quantidade (52 U/L). Desse modo, diferentes fontes de nitrogênio foram empregadas objetivando aumentar essa produção. Ureia, cloreto de amônio, sulfato de amônio, extrato de levedura, triptona de soja, triptona T1 foram as fontes investigadas. Os resultados evidenciaram que o emprego de extrato de levedura, triptona e triptona de soja aumentou consideravelmente a produção da enzima de interesse, sendo o extrato de levedura a melhor fonte, com uma produção máxima de 3412 U/L. O emprego das demais fontes não mostrou potencial de aplicação. Conclui-se, portanto, que a casca da semente da manga variedade Ubá possui bom potencial para a produção de lipase. ABSTRACT The objective of this work was to study the lipase production by Yarrowia lipolytica, using the residue of the processing of mango variety Ubá, supplemented with different sources of nitrogen. Preliminary results showed that only the culture medium containing seed husk presented lipase production, but in low amount (52 U/L). Thus, different nitrogen sources were used in order to increase this production. Urea, ammonium chloride, ammonium sulfate, yeast extract, soybean tryptone, tryptone T1 were investigated as nitrogen sources. The results showed that the use of yeast extract, tryptone tryptone and soy increases the production of the enzyme of interest, and yeast extract was the best source, with a maximum production of 3412 U/L. The use of other sources showed no potential application. It follows, therefore, that seed husk variety sleeve Ubá to have good potential for the production of lipase. PALAVRAS-CHAVE: Bioprocessos; Yarrowia lipolytica; Enzimas; Lipase. KEYWORDS: Bioprocesses; Yarrowia lipolytica; Enzymes; Lipase 1 INTRODUÇÃO Lipases são enzimas pertencentes à classe das hidrolases, que têm como principal função catalisar a hidrólise de óleos e gorduras liberando ácidos graxos, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol (JAEGER & REETZ, 1998). Além disso, em baixas concentrações de água, estas enzimas podem catalisar reações de esterificação, transesterificação e interesterificação (REIS et al., 2009).
Características como a estabilidade a solventes orgânicos, não exigência de cofatores e especificidade ao substrato, tornam essas enzimas bastante atrativas para o setor de biotecnologia industrial. As lipases podem ser de origem vegetal, animal ou microbiana, sendo as últimas as mais utilizadas. Os microrganismos, como as bactérias e fungos, são reconhecidos como potenciais produtores de lipase extracelular (TREICHEL et al., 2010). Dentre os fungos a espécie de levedura Yarrowia lipolytica possui grande potencial para ser usada em processos fermentativos. Essa levedura além de degradar substratos hidrofóbicos de uma forma muito eficiente, também apresenta dimorfismo, ou seja, a capacidade de alterar sua morfologia celular de acordo com as condições do ambiente (RUIZ-HERRERA & SENTRANDEU, 2002, COELHO et al., 2010) Para a obtenção de enzimas por processos fermentativos, o meio de cultura utilizado deve atender à demanda nutricional do microrganismo produtor, aos objetivos do processo e à escala de operação. No Brasil, país com abundância em agroindústrias, a utilização de resíduos como substrato para a produção de bioprodutos, como enzimas, contribuem para a redução dos custos dos bioprocessos, diminuem a poluição ambiental e também agrega valor a esses materiais. Entre os resíduos gerados pelas indústrias alimentícias, estão presentes os resíduos provenientes do processamento da manga. No processamento dessa fruta, a única parte que é aproveitada é a polpa, sendo o caroço e a casca, descartados. Esse resíduo corresponde de 40% a 60% do peso total da mesma, e contém compostos fenólicos, lipídios, proteínas e fibras, cuja quantidade se dá em função da variedade, características de cultivo e características ambientais (KAUR, et al, 2004). Deste modo, o estudo da utilização dos resíduos da indústria da manga como meio de cultura para o crescimento celular, pode indicar rotas econômicas alternativas para a produção de lipases. Portanto, neste trabalho, objetivou-se contribuir para o conhecimento dos processos fermentativos usando materiais sólidos, estudando a produção de lipases por fermentação submersa a partir da cepa Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682, utilizando como substrato o resíduo industrial da manga Variedade Ubá. 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Matéria-prima O resíduo agroindustrial da manga foi fornecido pela Tial Tropical Indústria de Alimentos S/A e utilizado como matéria-prima nas fermentações. O material foi previamente seco, e seus componentes separados manualmente. Posteriormente foi realizada a moagem e peneiragem em peneira com tamanho de partícula menor que 0,80 mm. Após esses procedimentos os componentes foram embalados em sacos de polietileno até o momento de serem empregados. 2.2 Preparação do Inóculo Foi utilizada a levedura Y. lipolytica IMUFRJ 50682, isolada da Baía de Guanabara, estocada em meio YPD contendo ágar (1% extrato de lêvedo, 2% peptona, 2%glicose) a temperatura de 4 C. O pré-inóculo foi realizado em erlenmeyer de 1000 ml contendo 400 ml de meio YPD, agitado em shaker a 160 rpm, 28 C por 72h. A absorbância (570 nm) de uma amostra deste cultivo foi determinada visando encontrar a concentração inicial células por meio da curva de peso seco; em seguida as células foram centrifugadas em tubos falcon de 50 ml a 3000 rpm por 5 minutos e adicionadas ao meio de produção.
2.3 Produção de lipase Foi empregada a fermentação submersa no processo de produção. Essa, foi conduzida em erlenmeyer de 500 ml contendo 200 ml meio fermentativo e mantidos em shaker a 160 rpm a 28 C. Os meios foram elaborados contendo os componentes separados do resíduo e suas combinações, conforme apresentado na Tabela 1. Foram utilizadas 5 g de resíduo em cada fermentador. O experimento foi realizado por meio do acompanhamento do perfil cinético, em que periodicamente eram retiradas amostras de 3 ml, as quais eram centrifugadas a 4 C, 3000 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante recolhido e congelado para a avaliação da lipase extracelular. O Componente que proporcionou maior produção foi submetido a um novo estudo com suplementação de diferentes fontes de nitrogênio na concentração de 2 g/l. Ureia, cloreto de amônio, sulfato de amônio, extrato de levedura, triptona de soja, triptona T1 foram as fontes investigadas. Tabela 1 Proporções dos componentes do resíduo da manga variedade Ubá empregados nos fermentadores Tratamentos Componentes Casca % Casca da semente % Amêndoa % Resíduo total 33,33 33,33 33,33 Casca + Amêndoa 50,00-50,00 Casca da semente + Amêndoa 50,00 50,00 - Casca da semente + casca - 50,00 50,00 Casca 100,00 - - Casca da semente - 100,00 - Amêndoa - - 100,00 2.4 Avaliação da Atividade da Lipase A atividade da lipase foi estimada mediante a variação da absorbância a 410 nm em espectrofotômetro, devido à oxidação do p-nitrofenil laurato (p- NFL) com uma concentração de 0,162 mg.ml -1 em tampão fosfato de potássio (0,05 M), ph 7,0 (PEREIRA & MEIRELLES, 1997). O substrato (p-nfl) foi preparado solubilizando 0,018 g deste em 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Em seguida, uma alíquota foi diluída 100 vezes em tampão fosfato de potássio (0,05 M). Um tubo de ensaio contendo 1,9 ml do substrato foi previamente preparado e aclimatado a 37ºC por 15 minutos. Após esse tempo, foi adicionado 0,1 ml do sobrenadante do meio de cultura e a absorbância acompanhada em espectrofotômetro a 410 nm contra o branco de reação (0,1 ml do tampão fosfato de potássio adicionados a 1,9 ml do substrato). 3 RESULTADO E DISCUSSÃO Os resultados iniciais mostraram não haver a produção da lipase extracelular quando se empregou o resíduo total e suas combinações, e nem para a casca e a amêndoa estudadas separadamente. Foi observado atividade da lipase apenas quando se utilizou a casca da semente como matéria-prima, porém em baixa quantidade. Desse modo, os experimentos posteriores foram realizados com a casca da semente suplementados com diferentes fontes de nitrogênio. Na Figura 1 encontra-se o gráfico do perfil cinético da atividade da lipase em meio de cultivo contendo a casca da semente da manga sem suplementação de nitrogênio.
Figura 1 Perfil cinético da atividade da lipase em meio de cultivo contendo a casca da semente da manga sem suplementação com nitrogênio. Analisando o gráfico é possível perceber que o pico da produção da lipase foi com 12 horas de cultivo (52 U/L), havendo uma redução após este tempo. Essa redução pode ser devido à presença de inibidores de lipase produzidos pelo próprio metabolismo celular do microrganismo ou pela produção extracelular de proteases. Brigida et al (2014) detectaram a presença de proteases no cultivo de Y. lipolytica em meio contendo glicose como fonte de carbono. Na Figura 2 são apresentados os resultados obtidos para a atividade da lipase em meio de cultivo contendo a casca da semente da manga suplementada com diferentes fontes de nitrogênio. Figura 2 Atividade da lipase em meio de cultivo contendo a casca da semente da manga suplementada com diferentes fontes de nitrogênio Conforme observado, a melhor fonte de nitrogênio foi o extrato de levedura, apresentado uma atividade máxima (3412 U/L) após 20 horas de fermentação. O extrato de levedura é eficiente na produção de lipases, pois além de ser uma fonte de nitrogênio é também uma boa fonte de vitaminas
(Li et al., 2004). Galvagno et al. (2011) também obteve aumento na produtividade de lipase ao usar o extrato de levedura. Quando foi empregado a triptona T1 e a triptona de soja, observou-se uma atividade máxima de 1142 U/L e 475 U/L respectivamente. A utilização da ureia, do sulfato de amônio e o cloreto de amônio não foram eficientes para a produção da lipase. Estes resultados confirmam dados relatados por Pereira-Meirelles et al. (1997) que encontraram valores baixos para a atividade da lipase quando a ureia foi utilizada. 4 CONCLUSÃO Os resultados obtidos indicam que a casca da semente manga com suplementação de nitrogênio apresenta potencial para a produção de lipase. O extrato de levedura foi a fonte de nitrogênio que mostrou maior potencial em aumentar a produção dessa enzima, apresentando uma produção máxima de 3412 U/L. Triptona T1 e triptona de soja também aumentou consideravelmente a produção, apresentando uma atividade máxima de 1142 U/L e 475 U/L respectivamente. A ureia, o sulfato de amônio e o cloreto de amônio não apresentaram potencialidade de aplicação neste estudo. Portanto, pode se concluir que a semente da manga variedade Ubá apresenta-se como uma alternativa para a produção de lipase extracelular pela levedura Yarrowia lipolytica. 5 REFERÊNCIAS Brígida, A. I. S.; Amaral, P. F. F.; Coelho M. A. Z.; Gonçalves, L. R. B.. Lipase from Yarrowia lipolytica: Production, characterization and application as an industrial biocatalyst. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 101, 148 158, 2014. Coelho M.A.Z.; Amaral P.F.F.; Belo, I.. Y.lipolytica: an industrial workhorse. Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, 930-944, 2010. Galvagno, M.A., Iannone, L.J., Bianchi, J., Kronberg F., Rost, E., Carstens, M.R., Cerrutti, P.P.. Optimization of biomass production of a mutant of Yarrowia lipolytica with an increased lipase activity using raw glycerol. Microbiology Argentina journal. 43, 218-225, 2011. Jaeger, K.; Reetz, M. T. Microbial lipases form versatile tools for biotechnology. Tibtech, v. 16, p. 396-403, 1998. Kaur, M., Singh, N., Sandhu, K. S., Guraya, H. S.. Physicochemical, morphological, thermal, and rheological properties of starches separated from kernels of some Indian mango cultivars (Mangifera indica L.). Food Chemistry, v. 85, p. 131-140, 2004. Li, C.Y., Cheng, C.Y., Chen, T.L.. Fed-batch production of lipase by Acinetobacter radioresistens using Tween 80 as the carbon source. Biochemical Engineering Journal. 19, 25 31, 2004. Pereira-Meirelles, F.V., Rocha-Leão, M.H. e Sant anna, G.L.. A stable lipase from Candida lipolytica cultivation conditions and crude enzyme characteristics, Applied Biochemical. Biotechnology, v.63-65, p.73-85, 1997. Reis, P.; Holmberg, K.; Watzke, H.; Leser, M. E.; Miller, R. Lipases at interfaces: A review. Advances in Colloid and Interface Science, Amsterdam, v. 147 148, p. 237 250, 2009. Ruiz-Herrera, J. & Sentandreu, R.. Different effectors of dimorphism in Yarrowia lipolytica, Arch Microbial, v. 178, p.477 483, 2002.
Treichel H.; Oliveira D.; Mazutti, M. A.; Luccio M.; Oliveira J. V. A.. Review on Microbial Lipases. Production Food Bioprocess Technology, 3,182 196, 2010.