RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, INTERDISCIPLINAR, ACERVO, PIBIT, EBTT E FAPESPA Período: 31/07/2016 a 01/08/2017 (x) PARCIAL ( ) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Título do Projeto de Pesquisa: Caracterização da dinâmica da biodiversidade microbiana e aperfeiçoamento dos processos metabólicos envolvidos na fermentação do cacau no estado do Pará. Nome do Orientador: Alessandra Santos Lopes Titulação do Orientador: Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Faculdade: Engenharia de Alimentos (FEA). Instituto/Núcleo: Instituto de Tecnologia (ITEC). Laboratório: Laboratório de Processos Biotecnológico (LABIOTEC) Título do Plano de Trabalho: Avaliação do potencial fermentativo de leveduras isoladas da fermentação de cacau amazônico para produção de cerveja. Nome do Bolsista: Felipe de Andrade Maia 1

Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/CNPq AF ( ) PIBIC/CNPq- Cota do pesquisador ( x ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA AF ( ) PIBIC/INTERIOR ( ) PIBIC/PRODOUTOR ( ) PIBIC/PRODOUTOR RENOVAÇÃO ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/ACERVO ( ) PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR ( ) PIBIC/VOLUNTÁRIO ( ) PIBIC/PIBIT 2

1. INTRODUÇÃO A produção de cerveja devido ao seu extenso histórico pode ser considerada como uns dos mais antigos processos biotecnológicos. Atualmente, existe diversos tipos de formulações dependo do tipo de cerveja, porém o processo produtivo e os componentes principais para a elaboração do produto são basicamente os mesmos (DRAGONE et al., 2007). A produção de cerveja é constituída das etapas de mosturação, fermentação primária e maturação. A cerveja é a bebida obtida pela fermentação alcoólica do mosto cervejeiro oriundo do malte de cevada e água potável, por ação da levedura, com adição de lúpulo (BRASIL, 1997). O mosto cervejeiro pode ser adicionado de alguns adjuntos que o suplementam. Os adjuntos mais comuns são o milho, o arroz e o trigo, na qual são adicionados na etapa de mosturação. Conforme Venturini (2005), o amido presente nessas fontes amiláceas é hidrolisado em açúcares fermentescíveis pelas enzimas contidas no próprio malte. As células de leveduras apresentam necessidades nutricionais durante o processo fermentativo, as quais influenciam diretamente na multiplicação, no crescimento celular e na eficiência da transformação de açúcar em álcool (BADER, et al., 2010). Um dos fatores essenciais para se obter uma cerveja de boa qualidade é a correta condução da etapa de fermentação do mosto, que segundo Bader et al. (2010), o crescimento do microrganismo envolvido na fermentação confere mudanças no aroma, sabor e textura da matéria-prima. Compostos como álcoois superiores, ésteres, aldeídos, cetonas, compostos de enxofre e ácidos orgânicos fazem parte da enorme gama de compostos sensoriais excretados pelas leveduras (ERTEN et al., 2007). A modificação da matéria prima resultante da fermentação pode servir também como uma proteção natural para a cerveja decorrente da síntese de substâncias inibidoras de crescimento de microrganismos patogênicos e deterioradores, como alguns ácidos e o etanol (SCHWENNINGER; MEILE, 2004). Os vários tipos de cerveja encontrados no mercado decorrem da maneira como são processadas as matérias-primas, da proporção em que elas são utilizadas, da duração das etapas de produção e do processo tecnológico empregado. 3

Desse modo, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial fermentativo de leveduras isoladas a partir da fermentação do cacau amazônico para a produção de cerveja. 2. JUSTIFICATIVA A diversidade de leveduras presentes na fermentação do cacau tem sido frequentemente associada às diferentes localidades de fermentação, bem como as condições do processo fermentativo (como nutrientes, ph, temperatura, presença ou ausência de oxigênio, entre outros). Vários estudos revelam uma abundante diversidade de leveduras na fermentação de sementes de cacau em diferentes países. Estes microrganismos são bastante versáteis em termos de atividade metabólica, especialmente fisiológica (BADER et al., 2010). Leveduras são microrganismos unicelulares que se multiplicam sexuada e assexuadamente e são importantes devido a sua capacidade de realizar a fermentação alcoólica dos açúcares (MADIGAN et al., 2004). Por esta característica de seu metabolismo, são consideradas como as formadoras de muitos produtos fermentados. As leveduras do gênero Saccharomyces possuem diversas aplicações tecnológicas, principalmente, na produção de álcool na cerveja e vinho (VERSTREPEN et al., 2003). Na indústria cervejeira de acordo com Cervieri (2014), o Brasil se consolidou como o terceiro maior produtor de cerveja mundial, ficando atrás somente da China e Estados Unidos, que ocupam respectivamente o primeiro e segundo lugar. Consequentemente, setor cervejeiro é responsável por 2% do PIB brasileiro, sendo este setor um dos que mais empregam no país. Apesar de existirem centenas de variedades de leveduras sendo que, habitualmente, se dividem em dois grandes grupos: as leveduras de fermentação alta (Saccharomyces cerevisiae, típicas das cervejas do tipo Ale) e as leveduras de fermentação baixa (Saccharomyces uvarum, antes conhecidas por Saccharomyces carlsbergensis, típicas das Lager) (BEKATOROU; PSARIANOS; KOUTINAS, 2006). O estudo cinético de um processo fermentativo é importante, pois, permite a aquisição de conhecimento básico do processo. A cinética de biotransformação está relacionada com a velocidade de consumo de substrato e de formação de produto. Os processos de fermentação utilizando leveduras utilizam-na determinação dos 4

parâmetros cinéticos a velocidade de crescimento celular e o efeito que estas sofrem por influência das condições do meio em processo (ANDRIETTA, 1999). A seleção de leveduras para o desenvolvimento de processos fermentativos favorece o início mais rápido do processo e os riscos de contaminação apresentados pela fermentação espontânea podem ser evitados, favorecendo menor competição por nutrientes essenciais, maior rendimento e qualidade do produto resultante (SANNI et al, 1993). 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo geral Avaliar o desempenho de 3 leveduras de leveduras isoladas durante a fermentação do cacau nativo da região Amazônica (Theobroma cacao), para a produção de cerveja. 3.2. Objetivo específico Estudar a cinética de fermentação através dos parâmetros de ph, sólidos solúveis e teor alcoólico para as leveduras L22, L33 e L74 e uma levedura comercial. 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Procedências das leveduras de leveduras As leveduras de leveduras L22, L33 e L74 foram selecionadas da coleção de microrganismos presentes no Laboratório de Processos Biotecnológicos (LABIOTEC) da Faculdade de Engenharia de Alimentos. Estas cepas foram isoladas no ano de 2014, a partir da fermentação do cacau sendo a levedura L22 da espécie Zygosaccharomyces bailii do município de Tucumã e as leveduras L33 e L74 da espécie Saccharomyces cerevisiae do município de Medicilândia. As leveduras L33 e L74 foram escolhidas para este estudo por apresentarem maior diferenciação genética intra-espécie observada através do estudo filogenético (Figura 1). 5

Figura 1. Trecho da árvore filogenética das cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas em Medicilândia, PA. 4.2. Reativação das cepas e preparo do inóculo A reativação das cepas foi realizada em tubos de ensaio contendo meio YEPD (2% glicose, 2% peptona, 1% extrato de levedura, 1,5% ágar). Os tubos foram colocados em estufa incubadora por 48 h a 30 ºC. Em seguida as cepas de leveduras foram inoculadas em 100 ml de caldo YEPD e colocadas em agitador orbital (TECNAL, modelo TE-421), durante 36 h a 30 ºC e 120 rpm para o desenvolvimento do inóculo/biomassa. A biomassa obtida foi centrifugada a 800xg por 10 min em centrífuga refrigerada de bancada (Centribio, modelo 80-2B). 4.3. Elaboração das cervejas O mosto cervejeiro foi formulado com uma proporção de 158 g de extrato de malte/l de água adicionado de 1,8 g de lúpulo de amargor/l de água e 0,45 g de lúpulo aromático/l de água. O extrato de malte foi transferido para um recipiente contendo a água a 40 ºC. Em seguida, a mistura aquecida até fervura por 60 min e, após 15 min do início da fervura, adicionou-se o lúpulo de amargor e, nos 15 min finais, adicionou-se o lúpulo de aroma. Após a fervura do mosto, foi adicionado 2,5 g de Whirfloc, um agente floculante que atua na sedimentação de partículas suspensas, seguido de resfriamento em banho de gelo (-10 ºC) para a coagulação de proteínas. Essas 6

etapas são necessárias para remoção de sólidos em suspensão que causam turvação na cerveja. Em seguida, foram transferidos 500 ml do mosto para 4 kitassatos estéreis com capacidade de 1L, sendo adicionado 1 g de biomassa das leveduras L22, L33, L74 e da levedura comercial em cada kitassato, posteriormente foram agitados para que houvesse uma melhor oxigenação do mosto. Uma pequena quantidade de oxigênio dissolvido no começo da fermentação é importante para que a levedura tenha uma boa adaptação, vitalidade e crescimento celular (WHITE; ZAINASHEFF, 2010). O sistema do processo fermentativo foi montado (Figura 2) e armazenado em uma câmara de refrigeração (Gelopar, modelo GRCS-4P) durante as primeiras 24 h a 20 ºC. A partir de 24 h, a temperatura de fermentação foi estabelecida em 17 ºC até o término do processo (144 h). Figura 2. Processo de fermentação em escala laboratorial. 4.4. Analises físico químicas Foram retiradas assepticamente (vidraria estéril em cabine de fluxo unidirecional vertical VECO, modelo FUV-06) alíquotas de 10mL nos tempos: 0, 24, 48, 72, 96, 120, e 144 h. Foram analisados os parâmetros: ph, teor de sólidos solúveis, teor alcoólico (IAL, 2008). O ph foi determinado pela leitura direta em potenciômetro (BEL, modelo W3B), o teor de sólidos solúveis e o teor alcoólico foi determinado com auxílio de um densímetro digital (ANTON PAAR, modelo DMA 35). 7

4.5. Cinética do processo fermentativo Os parâmetros cinéticos analisados foram as velocidades instantâneas de consumo de substrato (equação 1) e de formação de produto (equação 2). A produtividade das leveduras (equação 3), além dos coeficientes de rendimento (equação 4) e eficiência (equação 5) (SCHMIDELL et al, 2001). (Equação 1) (Equação 2) (Equação3) (Equação 4) (Equação 5) Onde, (rs) - velocidade de consumo de substrato em g/l (rp) - velocidade de produção de etanol em g/l.h (P0) - concentração inicial de produto em g/l (S0) - a concentração inicial de substrato em g/l (Yp/s) o coeficiente de rendimento. O valor teórico do coeficiente de rendimento é 51,1% e está relacionada a estequiometria do processo. 5. Resultados e Discussão A Figura 3 mostra a evolução do ph do mosto durante a fermentação primária para as 4 leveduras de leveduras. 8

Figura 3. Variação de ph para as 4 leveduras estudadas. O mosto com a levedura comercial foi a que apresentou menor valor de ph durante o processo fermentativo (ph 144h - 4,07), em contrapartida as leveduras L74, L33, L22 apresentaram ph valores de ph superiores à levedura comercial (ph 144h - 4,21, 4,18 e 4,23, respectivamente). A maior variação de ph durantes as primeiras 48 h de fermentação para as quatro leveduras decorrem da maior performance metabólica das leveduras para formação de compostos secundários, como ácidos orgânicos. Este comportamento se deve principalmente a uma maior concentração de substrato. De acordo com Dorta (2006), alguns dos ácidos orgânicos produzidos por essas leveduras são os ácidos acético, succínico, málico, tartárico, lático, cítrico e aconítico. Segundo Castro (2012), quanto maior o ph da cerveja maior é sua estabilidade sensorial. Muitas reações de degradação da cerveja são aceleradas em ph menor que 4,2 e retardadas em ph superior a este valor. Do ponto de vista microbiológico quanto menor o ph, maior é a estabilidade microbiológica e da espuma na cerveja. O desempenho das leveduras em função do consumo de substrato e de substrato e formação de produto para cada levedura é apresentado nas Figuras 3, 4, 5 e 6. 9

Figura 4. Cinética da fermentação (LC). Figura 5. Cinética da fermentação (L74). Figura 6. Cinética da fermentação (L33). Figura 7. Cinética da fermentação (L22). Todas as leveduras apresentaram um comportamento linear mais acentuado durante a durante as 48 h iniciais da fermentação, tanto para consumo de sacarose, quanto para formação de etanol. De acordo com a Tabela 2 a levedura comercial apresentou maior velocidade de consumo e produção. 10

Tabela 2. Velocidade de formação de etanol e consumo de sacarose. Etanol (g/l.h) Levedura 0-48 h 48 h - 144 h LC 1,037 0,673 L74 0,334 0,038 L33 0,360 0,045 L22 0,324 0,028 Sacarose (g/l.h) LC -2,705-0,151 L74-0,940-0,064 L33-0,967-0,114 L22-0,894-0,080 Após 48 h de fermentação, as leveduras isoladas da fermentação do cacau apresentaram uma redução média de 88,8% na velocidade de produção de etanol. Para as quatro leveduras, a redução média no consumo de sacarose foi similar, em torno de 91,7%. A maior velocidade nas primeiras 48 h está relacionada a uma menor concentração de etanol e maior concentração inicial de sacarose no mosto. Sousa (2011) relata que uma elevada de sacarose resulta em alto teor alcoólico, que pode causar toxicidade à levedura por desestabilizar a membrana plasmática desse microrganismo. Por outro lado, o teor alcoólico serve como controle para a multiplicação excessiva desses microrganismos, o que poderia ocasionar um desvio da quantidade de substrato para a produção de biomassa em detrimento ao álcool. A Tabela 3 apresenta os parâmetros de produtividade, rendimento e eficiência do processo de fermentação, considerando a produção de etanol. Tabela 3. Produtividade, rendimento e eficiência do processo de fermentação. Levedura Produtividade (g/l.h) Rendimento (%) Eficiência (%) LC 0,425 38,82 75,97 L74 0,140 38,66 75,66 L33 0,142 37,50 73,39 L22 0,129 36,42 71,27 11

As leveduras apresentaram valores de rendimento similar aos reportados por Ferrari (2013), que encontrou valores entre 37,4% a 44,8%. Este resultado mostra que as leveduras isoladas da fermentação de cacau possuem potencial para na produção de cerveja. Em relação às espécies utilizadas, as duas leveduras de Saccharomyces cerevisiae do município de Medicilândia apresentaram valores de produtividade próximas. A levedura L22 (Zygosaccharomyces bailii) apresentou rendimento de produção de etanol 5% inferior às leveduras comercial, L33 e L74, no entanto, outros metabólitos importantes para o sabor e aroma da cerveja podem ter sido excretados pela levedura L22. Segundo Zarnkow (2016) relata que leveduras não-saccharomyces já são utilizadas no processo de vinificação e a utilização de um mix de leveduras (Saccharomyces e não-saccharomyces) proporciona impacto positivo no sabor da cerveja. A levedura comercial foi a que apresentou a maior eficiência, consequentemente a maior produtividade. Essa característica se dá, devido a levedura comercial ter sofrido melhoramento genético para aumentar sua capacidade produtiva e resistência às mudanças físicas e químicas, como ph, teor de oxigênio e teor alcóolico, do meio fermentativo (OLIVEIRA, 2011). 12

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRIETTA, S.R.; MIGLIARI, P.C.; ANDRIETTA, M.G.S. Classificação de cepas de levedura de processos industriais de fermentação alcoólica utilizando capacidade fermentativa. STAB- Açúcar e Álcool e Subprodutos, v.17, n.5, p.54-59, 1999. BARDER, J.; MAST-GERLACH, E.; POPVIC, M. K.; BAJPAI, R.; STAHL, U. relevance of microbial coculture fermentations in biotechnology. Journal of Applied Microbiology, v.109, n.2, p.371-387, 2010. BEKATOROU, A.; PSARIANOS, C.; KOUTINAS, A. A. Food grade yeasts, Food Technology and Biotechnology, v.44, n.3, p.407-415, 2006. BRASIL. Decreto n. 2.314, de 4 de setembro de 1997. Regulamenta a Lei n. 8.918, de 14 de julho de1994, que dispõe sobre a padronização, a classificação, o registro, a inspeção, a produção e a fiscalização de bebidas. Diário Oficial da União. Brasília, 1997. CASTRO, M.P.; SERRA, S. G. Comparação entre quatro marcas de cervejas brasileiras. 25 p. Trabalho de conclusão de curso (Graduação em Engenharia Química) Universidade do Vale do Paraíba. São José dos Campos-SP, 2012. CERVIERI, J. O.; TEIXEIRA, J. J. R.; GALINARI, R.; RAWET, E. L.; SILVEIRA, C. T. J. O setor de bebidas no Brasil. BNDES Setorial 40, p. 93-130, 2014. DORTA, C. Sinergismo entre sulfito, ácido lático, ph e etanol na fermentação alcoólica de Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) Universidade Estadual Paulista UNESP, Rio Claro. 2006. 144 p. DRAGONE, G.; MUSSATTO, S. I.; SILVA, J. B. Utilização de mostos concentrados na produção de cervejas pelo processo contínuo: novas tendências para o aumento da produtividade, Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 27, p.37-40, 2007. ERTEN, H.; TANGULER, H.; CARRIOZ, H. The effect of pitching rate on fermentation and flavour compounds in high gravity brewing, Journal of Institute of Brewery. v.11, p.75-79, 2007. FERRARI, F.C.S. Fatores operacionais e cinética do processo fermentativo para otimização da produção de etanol em escala industrial. 2013. 57p. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Agropecuária) Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. UNESP, 2013. MADIGAN, T. M.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Microbiologia de Brock. 10. ed, 620 p. São Paulo: Prentice Hall, 2004. 13

Michel, M., Kopecká, J., Meier-Dörnberg, T., Zarnkow, M., Jacob, F., and Hutzler, M. Screening for new brewing yeasts in the non-saccharomyces sector with Torulaspora delbrueckii as model. Yeast, 33: p129 144, 2016. OLIVEIRA, N. A. M. Leveduras utilizadas no processo de fabricação de cerveja. 2011. 45 p. Trabalho de Conclusão (Especialista em Microbiologia Ambiental e Industrial) Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas. UFMG. Belo Horizonte, 2011. SANNI, A. I.; LONNER, C. I. Identification of yeasts isolated from Nigerian traditional alcoholic beverages, Food Microbiology, v.10, p.517-523, 1997. SCHWENNINGER, S.M.; MEILE, L. A mixed culture of Propionibacterium jensenii and Lactobacillus paracasei subsp. paracasei inhibits food spoilage yeasts, Syst Appl Microbiol, v.27, p.229 237, mar. 2004. SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia Industrial. São Paulo: Edgard Blücher, v.2, 2001. SOUSA, J. L. U.; MONTEIRO, R. A. B. Fatores interferentes na fermentação alcoólica para produção de etanol, FAZU em Revista, n.8, p.100-107, 2011. VENTURINI, F.; GASTONI, W. Tecnologia de bebidas: matéria-prima, processamento, BPF/APPCC, legislação e mercado. 1 ed. São Paulo: Edgard Blucher, 2005. VERSTREPEN K.J.; DERDELINCKX, G.; VERACHTERT, H.; DELVAUX, F.R. Yeast flocculation: what brewers should know, Appl Microbiol Biotechnol, v.61, p.197-205, 2003 WHITE, C.; ZAINASHEFF, J. Yeast: The pradical guide beer fermentation. Brewers Publications, 2010. 14

DIFICULDADES Não foram relatadas dificuldades pelo bolsista na execução das atividades programadas no projeto. PARECER DO ORIENTADOR: O bolsista Felipe de Andrade Maia teve excelente desempenho, inciativa e responsabilidade com as atividades programadas no projeto. DATA: 21/02/2017. ASSINATURA DO ORIENTADOR ASSINATURA DO ALUNO INFORMAÇÕES ADICIONAIS: 15