ANÁLISE METAGENÔMICA DAS COMUNIDADES BACTERIANAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DO QUEIJO CANASTRA

ANÁLISE METAGENÔMICA DAS COMUNIDADES BACTERIANAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DO QUEIJO CANASTRA S.N. Melo 1, L.A. Cruvinel 1, A.A. Pereira 1, M.P. Ávila 2, A.M.A. Nascimento 2, G.A. Lacorte 1 1- Laboratório de Biologia Molecular - Departamento de Ciências e Linguagens Instituto Federal de Minas Gerais, Campus Bambuí CEP: 38900-000 Bambuí MG Brasil, Telefone: (37) 3431-4900 e-mail: (saulomelobio@hotmail.com) 2- Laboratório de Genética de Microrganismos Departamento de Biologia Geral Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas CEP: 31270-901 Belo Horizonte MG Brasil, Telefone: (31) 3409-2588 RESUMO O processo de produção do Queijo Tipo Canastra tem como característica a utilização do leite cru e parte do soro residual como fermento endógeno que confere as características sensoriais peculiares deste produto. Este trabalho tem o objetivo de descrever a riqueza das comunidades em cada etapa, a contribuição das comunidades de cada etapa para o produto final e avaliar se existem diferenças nestas comunidades entre produtos de maior e menor valor agregado. A análise da riqueza das comunidades mostrou que nos produtos de menor valor as comunidades bacterianas eram mais ricas apenas na massa dessorada e no queijo fresco. Já análise da dinâmica e composição das comunidades ao longo do processo de produção revelou que as comunidades seguem um padrão decrescente de riqueza e que as comunidades do processo são similares do leite ao queijo fresco, mas durante o processo de maturação a riqueza cai drasticamente permanecendo os grupos bacterianos presentes no pingo. ABSTRACT Canastra Cheese production is characterized by the use of raw milk and residual whey as an endogenous ferment that gives the peculiar sensorial characteristics of this product. This paper aims to describe the bacterial community richness of each stage, the contribution of each bacterial community to final product and to verify if there are differences in these communities between products of higher and lower market value. The richness analysis revealed that in the lower market value products, the bacterial communities were richer only in two stages: massa dessorada and queijo fresco. The composition analysis showed that the dynamics of community richness followed a decreasing pattern of richness and the composition of the communities were similar from raw milk to fresh cheese, but during the ripening process the richness falls dramatically, remaining predominantly bacterial groups present in the residual whey. PALAVRAS-CHAVE: alimentos; leite; cru; pingo; artesanal. KEYWORDS: food; milk; raw; whey; artisanal 1. INTRODUÇÃO A fabricação artesanal de queijos no estado de Minas Gerais, sobretudo o Queijo Canastra da região centro-oeste do estado, tem como principal característica a utilização do leite cru no qual a microbiota presente no leite torna-se parte fundamental no processo de produção conferindo as características sensoriais típicas deste produto (NOBREGA, 2007). Além do leite cru, a utilização de parte do soro residual do processo de produção - conhecido como pingo - como fermento endógeno, insere no processo de produção uma microbiota diversificada, representativa da região na qual o

produto é fabricado, que direcionam a fermentação e maturação do queijo conferindo características sensoriais peculiares (MARINO et al, 2003). Apesar do antigo conhecimento prático da importância da utilização do fermento endógeno no processo de produção de Queijos Minas Artesanais, pouco se sabe a respeito da sua composição, além de que ele é formado por uma complexa associação microbiana de comunidades de bactérias do ácido lático (BAL) e comunidades de leveduras (PARENTE et al., 1997). Até a década de 1980 a classificação e identificação de bactérias, se baseavam em comparações fenotípicas, incluindo características morfológicas, fisiológicas, metabólicas e químicas das células. Entretanto a partir dos anos 2000, com a consolidação do uso das técnicas de sequenciamento em larga escala do gene de RNA ribossômico 16S (rrna) como marcador molecular de caracterização de grupos bacterianos de bactérias, conhecida como Era da Metagenômica, tornouse possível a obtenção de milhares de sequencias de DNA de e caracterização de qualquer comunidade bacteriana presente numa amostra de qualquer material - água, solo, alimentos, efluentes - e fornecendo informações consideráveis sobre a composição e o papel desempenhado por estas comunidades de bactérias que participam tanto do processo de produção de alimentos quanto aquelas que são consideradas contaminantes de alimentos e causam danos à saude, sem a necessidade de isolamento e cultivo (RAPPÉ & GIOVANNONI, 2003; TRINGE & HUGENHOLTZ, 2008). Dessa forma, a caracterização de comunidades bacterianas na indústria de alimentos passou de uma tarefa extremamente árdua na década de 80 para uma tarefa relativamente simples na década atual (ERCOLINI, 2013). Considerando o contexto do projeto, é sabido que existem variações nas características sensoriais (aparência, consistência, aroma e sabor) entre os produtores da região e estas variações têm influenciado no valor agregado do produto final. Como as comunidades bacterianas intrínsecas ao processo de produção contribuem para a determinação destas características sensoriais, neste trabalho foi utilizada análise metagenômica para caracterização das comunidades bacterianas presentes em todas as etapas do processo de produção do queijo Queijo Minas Artesanal tipo Canastra, com o objetivo principal de descrever a riqueza das comunidades em cada etapa bem como a contribuição das comunidades de cada etapa no produto final que é o queijo maturado. Por fim, foi avaliado também se existem diferenças nesta contribuição para o produto final de produtores cujos queijos apresentam características de maior valor agregado e produtores cujos queijos apresentam características de menor valor agregado. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Delineamento amostral Como forma de descrever a riqueza das comunidades bacterianas em cada etapa do processo, foram coletadas amostras do produto em seis etapas do processo: (1) leite cru; (2) pingo adicionado; (3) massa quebrada após adição de coalho e pingo; (4) massa dessorada; (5) queijo fresco; (6) queijo maturado. Adicionalmente, como forma de avaliar a influencia das comunidades presentes nos instalações e utensílios utilizados no processo, foram coletadas amostras de swab do: (1) recipiente no qual o leite recebe o coalho e pingo chamado de latão ; (2) pá utilizada para mistura leite coalho e pingo; (3) mão do produtor; (4) saco de pano para remoção do soro; (5) bancada de manipulação; (6) prateleira de maturação. Para se avaliar se existem diferenças nesta dinâmica das comunidades entre os processos cujos produtos finais possuem características de maior ou menor valor agregado, todas a amostragem foi realizada em 3 queijeiras cujos produtos possuem características geram maior valor agregado e 3 queijeiras cujos produtos possuem características geram menor valor agregado.

2.2 Análise metagenômica A extração do DNA de cada amostra da etapa do processo foi realizada utilizando o kit comercial de extração de DNA ambiental E.Z.N.A. Soil DNA Kit e seguindo o protocolo disponibilizado pelo fabricante. A caracterização dos grupos bacterianos presentes foi realizada utilizando a amplificação e o sequenciamento da região V3-V4 do gene do RNA ribossomal 16S. As análises bioinformáticas de avaliação das sequencias de DNA geradas foram realizadas utilizando o software PRINSEQ (SCHMIEDER & EDWARDS, 2011) para descarte de sequencias de baixa qualidade (Q-score < 25), o software MOTHUR v.1.33.0 (SCHLOSS et al., 2009) para busca de bases ambíguas e homopolímeros, e o software UCHIME (EDGAR et al., 2011) para detecção de quimeras. A classificação das sequencias finais (OTUs) foi realizada por meio o software MOTHUR, utilizando a base de dados de sequencias de DNA Greengenes, utilizando o critério de similaridade de 97% proposto por DRANCOURT et al. (2000). 2.3 Análise estatística A análise da dinâmica das comunidades bacterianas presentes em cada etapa do processo foi realizada através de uma análise de beta-diversidade conhecida como Unifrac ponderada que considera tanto a presença/ausência e a frequência relativa das espécies (neste caso as OTUs ou sequenciais de DNA das amostras encontradas) para calcular a similaridade entre as amostras, quanto a distância genética entre os indivíduos da comunidade, resultando numa descrição mais robusta das similaridades e diferenças das amostras. Para melhor visualização das diferenças na composição das comunidades em cada etapa do processo, os resultados da análise foram ordenados numa análise de coordenadas principais (PCoA) de forma que quanto mais próximos dois pontos no gráfico, mais similares são as comunidades dessas amostras. As análises de Unifrac ponderada foram realizadas utilizando o software MOTHUR v.1.33.0 (Schloss et al., 2009). As estimativas da riqueza total da comunidade bacteriana de cada etapa do processo foram realizadas por contagem total dos gêneros bacterianos identificados na análise metagenômica. As análises de comparação entre médias foram realizadas por meio Teste T, implementado no pacote de análise estatística do software Microsoft Excel 2010. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO A análise metagenômica das amostras de cada etapa do processo de produção do Queijo Minas Artesanal tipo Canastra bem como as principais portas de entrada de novos microrganismos no processo (tratadas aqui como fonte de microrganismos ) gerou cerca de um milhão de sequencias de DNA de qualidade adequada para análise conforme mostra a tabela 1. Das sequencias geradas, cerca de 10 mil não puderam ser classificadas pelo menos ao nível de família e não foram incluídas na análise. A análise metagenômica apresentou resultados de rendimento similares aos encontrados em outros estudos desta natureza já desenvolvidos (Delcenserie et al., 2014; Dalmasso et al., 2016). Com relação a amplitude taxonômica caracterizada nesta análise, foram encontrados 35 diferentes filos pertencentes aos domínios Archaea e Bacteria. Dentre os filos mais representativos, cerca de 87% das sequencias identificadas correspondiam a 2 filos e 3 classes: Firmicutes (Classe Bacilli) e Proteobacteria (Classes Alphaproteobacteria e Gammaproteobacteria). Estes grupos também foram predominantes em outros estudos de análise metagenômica de comunidades bacterianas presentes em queijos, revelando a típica capacitada de adaptação de determinadas famílias destes filos a este ambiente como por exemplo as bactérias do ácido lático (Latic acid bactéria - LAB) (Riquelme et al., 2015; Dalmasso et al., 2016).

Tabela 1. Rendimento da análise metagenômica das comunidades Categoria taxonômica Nº total Sequencias de DNA analisadas (reads) 1005119 Filos identificados 35 Classes identificadas 60 Ordens identificadas 113 Famílias identificadas 219 Gêneros identificados 894 A identificação de 849 diferentes gêneros, agrupados 219 famílias, permitiu a realização de estimativas da riqueza das comunidades bacterianas de cada etapa do processo, bem como estimativas de riqueza de cada potencial fonte de novos microrganismos para a comunidade bacteriana presente nos queijos. A comparação entre as riquezas médias entre produtos de maior e menor valor agregado revelou que as comunidades dos queijos de menor valor agregado são mais ricas em microrganismos na massa dessorada e no queijo fresco conforme mostra a tabela 2. A análise ainda revelou que uma potencial explicação para esta diferença nestas etapas finais de produção do queijo pode estar no utensílio de pano utilizado para remover o excesso de líquidos totais da massa, uma vez que a única fonte de microrganismos que apresentou diferenças entre os grupos foi justamente em amostras do pano utilizado. Embora as diferenças na riqueza não tenham permanecido da etapa de queijo fresco para o produto final, estes microrganismos adicionais podem ter gerado alterações na composição do produto ainda antes da maturação resultando em produtos finais com características sensoriais que conferem menor valor agregado. Dessa forma, análises adicionais de identificação quais são estes grupos adicionais devem realizadas a fim de se buscar alguma relação de causa e efeito entre a presença de determinado grupo bacteriano e a determinação de características sensoriais que desagregam valor ao produto. Tabela 2. Análise da riqueza de gêneros entre produtos de maior e menor valor agregado. Amostra Queijo maior valor Queijo menor valor Prod 1 Prod 3 Prod 4 Média Prod 2 Prod 5 Prod 6 Média Etapa do processo Leite 169 158 155 160,7a 106 134 146 128,7a Massa quebrada 109 139 96 114,7a 161 148 151 153,3a Massa dessorada 66 103 100 89,7a 121 136 134 130,3b Queijo Fresco 89 102 105 98,7a 126 154 158 146,0b Queijo Maturado 21 24 27 24,0a 31 74 36 47,0a Fonte de microrganismos Latão 100 102 138 113,3a 128 138 72 112,7a Pá 91 80 59 76,7a 104 90 125 106,3a Pingo 54 35 36 41,7a 97 87 44 76,0a Bancada 38 84 69 63,7a 66 72 53 63,7a Mão 96 91 105 97,3a 83 172 54 103,0a Pano 62 69 74 68,3a 96 111 119 108,7b Prateleira 113 92 118 107,7a 135 90 93 106,0a Ainda utilizando os valores médios de riqueza, foi possível caracterizar a dinâmica da riqueza das comunidades ao longo do processo de produção no qual ambos os grupos analisados apresentaram o mesmo padrão: (1) o leite fornece a comunidade mais rica em bactérias para o processo; (2) ao longo da passagem para massa quebrada e massa dessorada as comunidades vão decrescendo em riqueza, mesmo que várias fontes de microrganismos estejam contribuindo para as comunidades (Pá, Latão e Pingo); (3) na transição de massa dessorada para queijo fresco as comunidades voltam a ganhar

representantes, potencialmente por efeito das fontes de microrganismos adicionais nestas etapas (Mão do produtor, Bancada de manipulação e Pano para remoção dos líquidos totais da massa); (4) por fim a riqueza das comunidades cai drasticamente após o processo de maturação do queijo fresco no produto final, o queijo maturado conforme é observado na figura 1. Figura 1. Dinâmica da riqueza das comunidades bacterianas em cada etapa do processo de produção do Queijo Artesanal tipo Canastra Embora a riqueza apresente um padrão geral do processo, a análise de composição das comunidades mostra o quão relacionado são as comunidades, em termos de seus gêneros representantes, ou seja, o quanto uma comunidade também está presente na outra. A partir desta análise duas observações relevantes puderam ser realizadas, conforme é observado na Figura 2. Primeiro, as comunidades de bactérias presentes nas etapas do processo de produção são mais similares entre si do que entre as comunidades consideradas fonte de novos microrganismos exceto pelo queijo maturado cuja comunidade está mais relacionada com a comunidade presente no pingo. Este padrão observado indica que, embora existam várias fontes de novas bactérias para o produto aquela que mais contribui para o produto final é o pingo. Por outro lado, o leite que é a matéria-prima inicial do processo e que possui a comunidade bacteriana mais rica, contribui para o processo até a fase de queijo fresco de forma que, à medida que o processo de maturação se perfaz, os grupos bacterianos do leite, predominantes no início da maturação, vão sendo perdido e se mantém aqueles grupos predominantemente advindos do pingo. Segundo, comparando os produtores de maior e menor valor agregado, nota-se uma maior proximidade das comunidades do produto final com as comunidades consideradas fontes nos produtos de menor valor agregado do que naqueles considerados de maior valor. Esta relação indica que possivelmente os microrganismos que geram as características que desagregam valor aos produtos estão nestas fontes que constituem os utensílios e instalações de trabalho dos produtores. Dessa forma, controlar a contaminação da massa pelos grupos bacterianos presentes nos utensílios e equipamentos pode ser uma forma de evitar a presença de microrganismos que conferem características que desagregam valor ao produto final.

Figura 2. Análise de composição das comunidades bacterianas presentes em cada etapa do processo de produção do Queijo Canastra 4. CONCLUSÃO A análise metagenômica das comunidades bacterianas presentes no processo de produção do Queijo Artesanal tipo Canastra permitiu a identificação de uma grande diversidade de grupos bacterianos, evidenciando o notável rendimento da aplicação desta técnica. A análise comparativa da riqueza das comunidades mostrou que nos produtos de menor valor as comunidades bacterianas mais ricas apenas na massa dessorada e no queijo fresco. Já análise da dinâmica e composição das comunidades ao longo do processo de produção revelou as comunidades seguem um padrão decrescente de riqueza e que as comunidades do processo são similares do leite ao queijo fresco, mas durante o processo de maturação a riqueza cai drasticamente permanecendo os grupos bacterianos presentes no pingo. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Dalmasso, A., Civera, T., Pattono, D., Cardazzo, B., & Bottero, M. T. (2016). Characterization of microbiota in Plaisentif cheese by high-throughput sequencing. LWT-Food Science and Technology, 69, 490-496. Delcenserie, V., Taminiau, B., Delhalle, L., Nezer, C., Doyen, P., Crevecoeur, S., Roussey D., Korsak N., & Daube, G. (2014). Microbiota characterization of a Belgian protected designation of origin cheese, Herve cheese, using metagenomic analysis.journal of dairy science, 97(10), 6046-6056. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., & Knight, R. (2011). UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection.bioinformatics, 27(16), 2194-2200. Riquelme, C., Câmara, S., Maria de Lurdes, N., Vinuesa, P., da Silva, C. C. G., Malcata, F. X., & Rego, O. A. (2015). Characterization of the bacterial biodiversity in Pico cheese (an artisanal Azorean food). International journal of food microbiology, 192, 86-94. Schloss, P. D., Westcott, S. L., Ryabin, T., Hall, J. R., Hartmann, M., Hollister, E. B.,... & Sahl, J. W. (2009). Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and environmental microbiology,75(23), 7537-7541. Schmieder, R., & Edwards, R. (2011). Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics, 27(6), 863-864.