Centro Brasileiro-Argentino de Biotecnologia Introdução à Biologia Computacional Determinação da Estrutura de Proteínas Paulo enrique C. Godoi
Bioinformática objetivo principal é determinar a função de todos os genes no genoma; Proteínas produtos de genes, constituem não apenas as estruturas físicas mas também uma complexa rede de reações químicas que mantém os organismos vivos; Estrutura de Proteínas responsável pela função Determinado pela seqüência de aminoácidos, derivados da transcrição e tradução do DNA; A seqüência de aminoácidos será, em grande parte, o determinante no enovelamento de proteínas;
...AUCCGAUUCGGCUACUGAUCGAGCUACUGCAACCUGCAGUGACGU... mrna 1...DLTRNMTRAPMIDMI... proteína 2 3
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Métodos para a determinação da estrutura de proteínas: 1. cristalografia de raios-x (experimental) modelo estático 2. ressonância magnética nuclear (experimental) modelo dinâmico 3. modelagem molecular por homologia (teórico) baseado em conhecimento prévio 4. ab initio (teórico) totalmente teórico com algumas restrições
Cristalografia de raios-x de proteínas RMN vantagens e desvantagens... 1. não há limite para o tamanho da(s) molécula(s) em estudo; i.e. Desde que sejam cristalizadas 2. a solubilidade é menos crítica 3. definição simples de resolução 4. cálculo direto dos dados para a densidade eletrônica 5. a amostra (cristais) sofrem com danos causados pela radiação aplicada 6. problema das fases 1. amostras analisadas em solução! mas com limite máximo de cerca de 30kDa. Eliminando cerca de 50% das proteínas 2. análise dinâmica das interações entre proteínas / substratos / outros ligantes 3. a solubilidade é crítica! 4. a amostra não é danificada durante as medidas 5. não há o problema de fases equipamentos caros! Método ideal?
Cristalografia de raios-x de proteínas etapas experimentais... 1. extração ou expressão em sistema heterólogo; 2. purificação; 3. cristalização; 4. coleta de dados de difração de raios-x; 5. cálculo de fases e mapas de densidade eletrônica; 6. construção e refinamento de um modelo molecular; 7. análise da estrutura;
Notas: expressão Análise da seqüência de aminoácidos e modificação quando apropriado (engenharia) para facilitar a purificação / cristalização; Escolha do hospedeiro e do sistema de expressão desejável: alta solubilidade em soluções tampão Notas: purificação Estabilidade e integridade estrutural (nova definição de pureza) rendimento alto: >95% pureza / miligramas de proteínas
Cristalização
Coleta de dados Tamanho: 0,01 a mais de 1,0 mm Coleta de dados em condições criogênicas temperatura: 10 a 100K (-263 a -173 o C)
Coleta de dados
Coleta de dados Radiação síncrotron ESRF, ID14 Goniômetro
Coleta de dados Thi1-P, ESRF ID29
Função de densidade eletrônica e o problema das fases
Resolução do problema das fases
Cristalografia e RMN
Ressonância Magnética Nuclear ~~~~ ~~~~ ~~~~ pulsos de rádio Tempo de Relaxação
Ressonância Magnética Nuclear O C3 N O O O C 3 N O N O Proteína de ligação de ácido graxo intestinal sobreposição de 20 estruturas
Ressonância Magnética Nuclear 900 Mhz NMR (Oxford 21.1 tesla magnet) / Varian console
Modelagem Molecular por omologia Proteínas com seqüências de aminoácidos similares devem apresentar enovelamentos similares. Etapas: 1. alinhamento entre as seqüências de proteínas homólogas com estrutura já determinada (cristalografia ou RMN); 2. alinhamento com o alvo; 3. análise do ambiente químico, aplicação de restrições espaciais, reconstrução de loops e minimização de energia;
Ab initio Quando não há modelos em banco de dados de estruturas de proteínas para a modelagem molecular por homologia Em geral: 1. necessária amostragem de todo o espaço conformacional da proteína-alvo, de maneira a produzir-se um grande número de possíveis conformações nativas; 2. determinação de uma função de discriminação/pesos/energia para distinguir entre conformações nativas e não-nativas;