ImmunoComb FELINE TOXOPLASMA & CHLAMYDOPHILA ANTIBODY TEST KIT Kit de teste para detecção de anticorpos IgG de Toxoplama gondii e Chlamydophilose felina USO VETERINÁRIO N Cat. do Produto: 50FTC201/50FTC210 PRODUTO IMPORTADO Proprietário e Fabricante: Biogal Galed Laboratories Asc. Ltd., Galed, 19240000 Israel Tel: 972-4-9898605 / Fax: 972-4-9898690 Instruction Cat. No: 63FTC511 12.06.13 Representante Exclusivo no Brasil, Importador e Distribuidor: JMR TRADING LTDA CNPJ 11.857.347/0001-71 Rua Santa Alves Petra, 173 - Pinhais - Paraná-Brasil Fone (41)3779-2130 e-mail: info@vpdiagnostico.com.br Responsável Técnica: Dra. Margareth Carvalho S. Agottani CRMV PR nº 3288
I. FINALIDADE DO KIT O kit Feline Toxoplasma & Chlamydophila Antibody Test Kit determina no soro de gatos, o anticorpo IgG da Toxoplasma gondii e Chlamydophila sp. O principal objetivo do presente kit consiste em proporcionar uma ferramenta útil para avaliar o estado de imunidade em gatos, relativas a estes agentes patogênicos e para ajudar no diagnóstico de casos clínicos. II. INFORMAÇÕES GERAIS Toxoplasma gondii e Chlamydophila felis infectam gatos em todo o mundo, causando doença, especialmente em gatos jovens, porém os gatos adultos também podem ser infectados. A toxoplasmose constitui preocupação especialmente zoonótica. Não existe vacina contra T. gondii, somente contra Chlamydophila. O monitoramento do nível de anticorpos por sorologia pode auxiliar no diagnóstico. III. O QUE É O TESTE IMMUNOCOMB? O teste ImmunoComb é um kit de ELISA portátil. É um teste sensível que detecta níveis de anticorpos no soro. Os resultados da IgG contida no sangue do paciente felino, são obtidas em torno de 40 minutos. IV. COMO FUNCIONA O IMMUNOCOMB? O Kit ImmunoComb contém dois componentes principais: um cartão de plástico em forma de pente e uma placa com multi compartimento para desenvolvimento do teste. O Pente tem 12 dentes - suficientes para 12 testes. Cada dente será utilizado em uma coluna correspondente de poços na placa de desenvolvimento. Amostras individuais ou múltiplas podem ser testadas, basta destacar a quantidade desejada de dentes do pente. Antígenos de Toxoplasma e Chlamydophila são adsorvidos em pontos em cada dente do pente. O ponto superior é referência positiva. Antígeno purificado de Chlamydophila está adsorvido no ponto médio, o antígeno purificado de Toxoplasma gondii adsorvido no ponto inferior (ver figura na secção X). A primeira etapa do ensaio é depositar amostra de soro ou plasma, no poço da linha A da placa de desenvolvimento. Em seguida, o pente é inserido no poço (s) já com a amostra (s) e transferidos para os poços restantes (B- F), em intervalos de tempo informados na instruções passo a passo (ver secção VII). Os anticorpos IgG específicos da espécie, se presentes, ligam-se aos antígenos adsorvidos nos pontos do pente. O pente é transferido para o poço seguinte (linha B) em que os anticorpos não ligados são lavados. O pente é inserido no poço seguinte (linha C), que contém enzima marcada anti-anticorpos IgG de felino, que ligamse aos complexos antigeno-anticorpo. Após mais duas lavagens (linhas D & E), o pente é movido para o poço seguinte (linha F), onde ocorre o desenvolvimento de cor através de uma reação enzimática. A intensidade do resultado de cor corresponde diretamente ao nível de anticorpos na amostra. Os resultados são registrados com o ponto de Referência Positiva e CombScale (ver secção IX). 2
V. DESCRIÇÃO DAS DOENÇAS Toxoplasmose Toxoplasma gondii, parasita intracelular obrigatório que pode infectar o sistema nervoso central de animais de sangue quente, incluindo seres humanos. A infecção é adquirida, principalmente, pela ingestão de oocistos ou cistos teciduais. Os gatos têm um papel importante na propagação de toxoplasmose, porque são os únicos mamíferos que segregam oocistos resistentes através das suas fezes. Oócitos ingeridos podem migrar para o músculo e cérebro. T. gondii também pode ser transmitido através da placenta e leite. As principais fontes de infecção de um gato são através de carne crua, presa infectada, ainda filhotes no útero ou através do leite. No entanto, em gatos saudáveis, a infecção será geralmente assintomática. Os sinais de toxoplasmose em animais de estimação são inespecíficos: febre, perda de apetite, depressão. Outros sinais podem ocorrer, dependendo se a infecção é aguda ou crônica, e onde o T. gondii é encontrado no corpo, os mais graves são localizados no sistema nervoso. Chlamydiose Chlamydophila felis (anteriormente Chlamydia psittaci var. Felis) é uma bactéria intracelular obrigatória, com paredes de células que se assemelham às de bactérias Gram-negativas. C. felis é principalmente um patógeno conjuntival, capaz de causar conjuntivite aguda a crônica, com blefaroespasmo, quemose, congestão e secreção ocular serosa a mucopurulenta. Febre transitória, inapetência e perda de peso, pode ocorrer logo após a infecção, embora a maioria dos gatos, aparentemente, continuam bem e continuam a comer. Os sinais clínicos melhoram após algumas semanas, mas conjuntivite leve, muitas vezes, persiste por meses. VI. DIAGNÓSTICO A medição de anticorpos de T. gondii no sangue é o melhor método para diagnosticar a toxoplasmose. Às vezes, os oocistos podem ser encontrados nas fezes, mas são tão semelhantes a alguns outros parasitas que este não é um método confiável de diagnóstico. Além disso, os gatos lançam os oocistos apenas por um curto periodo de tempo (cerca de 2-3 semanas) e muitas vezes não são mais vistos mesmo quando eles estão mostrando sinais da doença. PCR pode ser utilizado para confirmar a infecção e para o monitoramento da eficiência do tratamento. Entre todas as técnicas de sorologia existentes: teste de aglutinação em látex (LAT), Imunofluorescência (IF) e ELISA, a técnica dot- ELISA, utilizada pelo ImmunoComb, é a técnica mais prática e confiável. 3
VII. TÉCNICA PASSO A PASSO DO IMMUNOCOMB Preferencialmente realizar o teste em sala com temperatura entre 20 0-25 0 C. Misturar os reagentes agitando suavemente a placa várias vezes antes do uso. Antes de realizar o teste manter todos os elementos do kit e amostras à temperatura ambiente por 60-120 minutos ou incubar somente a placa durante 20 minutos a 37 ºC. (1) Coleta do sangue felino. (2) Usar uma pipeta calibrada ou tubo capilar* e pipetar 5μL do soro/plasma. (3) Use a pinça para perfurar a tampa de alumínio de proteção da linha A. Um poço para cada amostra. (4) Depositar uma amostra na cavidade da fileira A. Levantar e abaixar o pistão da pipeta/tubo capilar, várias vezes para homogeneizar a amostra e o diluente do poço. Não abra qualquer cavidade da linha A ou de outras linhas que você não pretenda usar. * Unidade de 40 tubos capilares e um pistão podem ser adquiridos mediante solicitação. 4
(5) Retire o pente de seu envelope de proteção. Para testar menos do que 12 amostras, cortar ou romper o pente por dobragem nos entalhes, para a quantidade de testes necessários. Inserir o Pente no poço aberto (s) na linha A (o lado impresso de frente para você) e incubar por 10 minutos. Para melhorar a mistura, mergulhe suavemente para cima e para baixo o pente, no início de cada incubação. Repetir este movimento, pelo menos, duas vezes até terminar o teste. 11FTC200 (6) Use a pinça para furar o alumínio do próximo poço (linha B), e introduza o pente por 2 minutos. Antes de transferir o pente de um poço para o seguinte, perfure o alumínio do poço seguinte. Gentilmente retire o excesso do liquido que está no pente batendo sobre um lenço absorvente colocado em cima de uma superfície plana. Introduza o pente no poço (linha C) por 10 minutos. Introduza o pente nos demais poços (linha D & E) por 2 minutos cada e no último poço (linha F) por 10 minutos FTC200 (7) Quando a cor dos pontos estiverem desenvolvidas na linha F, retorne o pente para a linha E por 2 minutos para fixação da cor. Retire o pente e deixe secar entre 1 e 10 minutos. 11FTC200 Columns (1 to 12) 5
VIII. LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS O ponto superior é a Referência Positiva do teste e deve ter uma cor roxo-cinza. Esta é a mesma tonalidade de cor gerada com um soro que que tem uma reação positiva antianticorpos de Chlamydophila com título de 1:32 no teste de Fixação de Complemento e anticorpos anti Toxoplasma com título 1:32 na técnica de Imunofluorescência (veja Fig.1). Ao fazer a leitura utilizando a CombScale, este ponto deve ser lido como S3 (veja seção IX). O ponto mediano do Pente dá o resultado da IgG anti Chlamydophila. O ponto inferior do Pente da o resultado da IgG anti Toxoplasma. Compare a tonalidade da cor do ponto da Chlamydophila e Toxoplasma com o ponto Referência Positiva (separadamente). A tonalidade de cor igual ou mais forte que o ponto da Referência positiva considera-se resultado positivo. Tonalidade igual ou mais fraca do que S1 considera-se resultado negativo. Para avaliar a pontuação de anticorpos, utilizar o CombScale fornecido no kit (ver secção IX) IX. LEITURA COM O COMBSCALE O valor CombScale S é o número que aparece na janela amarela correspondente ao tom da cor, do ponto referência positiva, que é calibrada em S3. Quando o pente estiver completamente seco, alinhá-lo com o CombScale fornecido no kit. Encontrar o tom de roxo-cinza no CombScale que mais se aproxima do ponto de Referência Positiva (ponto superior). Deslize a régua amarela até a marca C+ aparecer na janela, acima da cor que você encontrou. Segure a régua nesta posição durante toda a leitura. Este passo realmente calibra a C + à S3, que é o ponto de cut-off, que os pontos de teste serão comparados Enquanto mantém a régua fixa, encontrar o tom de roxo-cinza no CombScale que mais se aproxima do ponto do resultado do teste desejado (um dos pontos mais baixos). O número que aparece na janela acima é a pontuação CombScale (S0-S6). Repita este passo com cada ponto de teste separadamente. Outra forma de ler os resultados é usando o CombScan. É um programa de software que utiliza um computador e um escaner compatível com TWAIN. Quando é colocado o pente no escaner, o programa traduz os resultados da cor em valores numéricos. O CombScan além dos resultados, armazena os dados. É fornecido gratuitamente, mediante solicitação 6
IX. EXEMPLO DE TESTE ImmunoComb POSITIVE REFERENCE CHLAMYDOPHILA TOXOPALSMA GONDII Cat: 11FTC200 Lot: S.N: Dente No. Resultados da Chlamydophila Resultados da Toxoplasma 1 S5 Fortemente positivo <S1 Negativo 2 S0 Negativo S6 Fortemente Positivo 3 S5 Fortemente positivo S5 Fortemente positivo 4 S0 Negativo S0 Negativo 5 S0 Negativo S1-2 Inconclusivo 6 S1-2 Inconclusivo S4 Positivo 7 S5 Fortemente positivo S0 Negativo 8* Inválido Inválido 9** Inválido Inválido 10 S1-2 Inconclusivo S3 Positivo 11 S3 Positivo S3 Positivo 12*** S3 Positivo S3 Positivo Observações: * O Ponto Referência (+) não reagiu. Repetir o teste. ** Cor de fundo muito escura. Repetir o teste. *** Cor de fundo escura com resultado positivo. Para auxílio adicional contatar: Distribuidor local pelo telefone/fax: (41)3779-2130 e-mail: info@vpdiagnostico.com.br - website: www.vpdiagnostico.com.br Fabricante: Laboratórios da Biogal Galed pelo telefone: 972-4-9898605 / Fax: 972-4-9898690 e-mail: info@biogal.co.il - website: www.biogal.co.il 7
XI. ESTOCAGEM E MANUSEIO 1. Armazenar o kit sob refrigeração normal (2-8 ºC ). Não congelar o kit. 2. Antes de realizar o teste manter todos os elementos do kit e amostras à temperatura ambiente, de preferência por 60-120 minutos (ou apenas incubar a placa durante 22 minutos 37 ºC. Realizar ensaio à temperatura ambiente de 20-25 C 3. Evite derramamento e contaminação cruzada de soluções. 4. Misturar os reagentes agitando suavemente a placa várias vezes antes do uso. 5. Não misturar reagentes de diferentes kits ou de diferentes compartimentos do mesmo kit. 6. Não toque nos dentes do cartão ImmunoComb. 7. Quando se utiliza o desenvolvimento de placa, perfure a tampa de cada compartimento de acordo com as instruções do procedimento de teste. Não retire a proteçao de alumínio. 8. O kit contém material biológico inativado. O kit deve ser manuseado e eliminado de acordo com as exigências sanitárias local. XII. COMPONENTES DO KIT Components Kit com 12 testes (50FTC201) Kit com 120 testes (50FTC210) A. Cartão ImmunoComb 1 10 B. Placa reveladora 1 10 C. Pinça de pláastico 1 1 D. Escala de cores CombScale 1 1 E. Tubo com 12 microcapilares e um pistão 1 Incluído mediante solicitção. Instruções de uso 1 1 XIII.REFERÊNCIAS Dubey (1986). Feline Practice 16: 12-26, 44-45. Montoya & Liesenfeld (2004) Lancet, 363: 1965-1976. Molina & Ridley-Dash (2008) USM R & D J: 16(1): 53-55. Sykes JE (2005) Feline chlamydiosis. Clin Tech Small Anim Pract. 20(2):129-34.