UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINAVETERINÁRIA

UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINAVETERINÁRIA DETECÇÃO E BIOCONTROLE DE Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli v ar. fuscans (Smith) Dye EM SEMENTES DE FEIJOEIRO COMUM (Phaseolus vulgaris L.) VANESSA ANDRÉIA AGOSTINI Dissertação apresentada à Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da UPF, para obtenção do título de Mestre em Agronomia - Área de Concentração Fitopatologia. Passo Fundo, setembro de 2004.

2 UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINAVETERINÁRIA

3 DETECÇÃO E BIOCONTROLE DE Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Smith) Dye EM SEMENTES DE FEIJOEIRO COMUM (Phaseolus vulgarisl.) VANESSA ANDRÉIA AGOSTINI ORIENTADORA: Prof. Dra. NORIMAR DÁVILA DENARDIN CO-ORIENTADOR: Prof. PhD. CARLOS A FORCELINI Dissertação apresentada à Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da UPF, para obtenção do título de Mestre em Agronomia - Área de Concentração Fitopatologia. Passo Fundo, setembro de 2004.

4 A275d Agostini, Vanessa Andréia Detecção e biocontrole de Xanthomonas axonopodis fuscans (Smith) Dye em sementes de pv. phaseoli var. feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) / Vanessa Andréia Agostini ; orientado por Norimar Dávila Denardin. 2004. 103 f. Dissertação (mestrado) Universidade de Passo Fundo, 2004. 1. Feijoeiro 2. Patologia da semente 3. Fitopatologia 4. Phaseolus vulgaris I. Denardin, Norimar Dávila, orient. II. Título CDU: 635.652 Catalogação na fonte: bibliotecária Daiane Citadin Raupp - CRB 14/887

5 AGRADECIMENTOS À Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo, pela oportunidade de ter realizado o curso e pelo aprimoramento profissional alcançado. À Capes pela concessão da bolsa. À professora orientadora, Dra. Norimar D'Ávila Denardin, pela amizade, carinho e total dedicação e apoio durante os trabalhos e, acima de tudo pelo exemplo de integridade e profissionalismo. Ao professor co-orientador, Dr. Carlos Alberto Forcelini, pela amizade e incondicional apoio e incentivo durante a iniciação científica na graduação e durante o mestrado. Ao professor Dr. Erlei Melo Reis, pela confiança que primeiramente depositou em mim, grande incentivo e apoio, fundamentais para a realização do curso e pela oportunidade para iniciar na Fitopatologia. Ao professor Dr. Florindo Luiz Castoldi, pelo auxílio nos trabalhos de análise estatística. A todos os professores do Curso que contribuíram para a minha formação.

6 Aos funcionários da FAMV-UPF, em especial aos funcionários do Laboratório de Solos, pelo auxílio prestado. Aos meus colegas pela amizade e carinho. Em especial à colega Jucenara Soares, pela colaboração, amizade e dedicação durante os trabalhos de laboratório À colega Andréia Iraci Tumelero, pela amizade, apoio e incansável disponibilidade para auxiliar durante todo o curso. Aos alunos do curso de Agronomia, Tiago Antonio Webber e, em especial ao Reginaldo Mateus Giongo pela grande colaboração para a execução dos trabalhos e amizade. À Deus, pela oportunidade de poder estar aqui e proteção constante durante este caminho. Aos meus pais, que não pouparam esforços para a minha formação, especialmente pelo carinho, apoio e incentivo constante.

7 SUMÁRIO Lista de Tabelas... xii Lista de Figuras... xiii RESUMO... 1 SUMMARY... 3 1. INTRODUÇÃO... 5 2. REVISÃO DE LITERATURA... 7 2.1. Crestamento Bacteriano Comum do Feijoeiro... 7 2.1.1 Etiologia... 7 2.1.1.1 Taxonomia... 7 2.1.1.1.1 Variante "fuscans"... 8 2.1.1.2 Características Morfologicas, Fisiológicas e bioquímicas... 10 2.1.2 Sintomatologia causada por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var fuscans no feijoeiro... 10 2.1.3 Aspéctos epidemiológicos... 11 2.1.3.1 Condições de ambiente e doença... 11 2.1.3.2 Fontes de inóculo e sobrevivência... 12 a. Sementes... 12 b. Hospedeiros secundários e alternativos... 13 c. Restos de cultura... 14 2.1.3.3 Transmissão... 14

8 2.1.3.4 Disseminação... 15 2.1.4 Danos... 16 2.1.5 Controle... 17 2.1.5.1 Práticas culturais... 17 2.1.5.2 Resistência genética... 18 2.1.5.3 Controle químico... 20 2.1.5.4 Controle biológico... 21 2.1.5.4.1 Actinomicetos... 23 2.1.5.5 Controle por métodos físicos "Termoterapia"... 24 2.1.5.6. Certificação de sementes... 24 2.2 Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var fuscans em sementes... 25 CAPITULO I... 28 DETECÇÃO DE Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans EM SEMENTES DE FEIJOEIRO COMUM Phaseolus vulgaris L.... 28 RESUMO... 28 SUMMARY... 29 1. INTRODUÇÃO... 30 2. MATERIAL E MÉTODOS... 31 2.1 Técnicas de extração de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var fuscans em sementes de feijoeiro comum... 31 2.1.1 Tratamentos... 31 2.1.2. Preparo das amostras... 32 2.1.3. Procedimento... 32

9 2.1.4. Quantificações e análise estatística... 33 2.2. Performance de meios de cultura para os processos de detecção e de quantificação de Xapf... 34 2.2.2. Preparo das amostras... 34 2.2.3. Procedimento... 35 2.2.4. Quantificação e análise estatística... 35 2.3 Caracterização dos isolados de Xapf obtidos de sementes de feijoeiro... 36 2.4 Preservação dos isolados obtidos das sementes.. 37 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 37 3.1 Técnicas de extração e meios de cultura para detecção de Xapf em sementes de feijoeiro comum... 37 4. CONCLUSÕES... 42 CAPITULO II... 43 BIOCONTROLE DE Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Smith) Dye EM SEMENTES DE FEIJOEIRO COMUM (Phaseolus vulgaris L.)... 43 RESUMO... 43 SUMMARY... 44 1. INTRODUÇÃO... 45 2. MATERIAL E MÉTODOS... 46 2.1 Preparo do inóculo de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var fuscans... 47 2.2 Inoculação de sementes com Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var fuscans... 48 2.3 Preparo do biocontrolador em

10 "Formulação... 48 2.4 Microbiolização de sementes... 49 2.5 Tratamentos... 50 2.6 Instalação dos ensaios na casa-de-vegetação.. 2.6.1 Ensaio de casa-de-vegetação, em substrato esterilizado... 2.6.2 Ensaio de casa-de-vegetação, em vasos com solo... 2.7 Instalação do ensaio de campo... 2.7.1. Correção de solo e instalação do ensaio... 2.7.2 Controle de doenças e pragas... 2.8 Avaliações do CBCF no inicio do ciclo... 2.8.1 Ensaio de casa-de-vegetação, com substrato esterilizado... 2.8.1.1 Avaliações da emergência de plântulas... 2.8.1.2 Avaliações da incidência do CBCF nas folhas cotiledonares... 2.8.1.3 Avaliações da incidência do CBCF nas folhas primárias... 2.8.2 Ensaio de casa-de-vegetação, em vasos com solo... 2.8.2.1 Avaliações da incidência do CBCF nas folhas cotiledonares... 2.8.2.2 Avaliação da severidade do CBCF nas folhas primárias... 2.8.3 Ensaio a campo... 2.8.3.1 Avaliação da incidência nas folhas cotiledonares... 51 51 52 53 53 53 54 54 54 54 55 56 56 56 57 57

11 2.8.3.2 Avaliação da incidência do CBCF, nas folhas primárias... 2.8.3.3 Avaliação da incidência do CBCF, no primeiro trifólio... 57 57 2.8.3.4 Avaliação da severidade do CBCF, no primeiro trifólio... 2.9 Avaliações da evolução do CBCF ao longo do ciclo da cultura... 2.9.1 Ensaio de casa-de-vegetação, em vasos com solo... 2.9.1.1 Avaliações da severidade do CBCF nas folhas primárias... 2.9.1.2 Avaliações da severidade do CBCF nas folhas trifolioladas... 2.9.1.3 Massa de matéria seca da parte aérea, nitrogênio total e massa seca de raízes... 2.9.2 Ensaio a campo... 2.9.2.1 Avaliações da incidência e severidade do CBCF... 2.9.2.2 Rendimento de grãos e peso de mil sementes... 2.10 Detecção e quantificação de Xapf nas sementes produzidas em ensaio de campo... 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Avaliações do CBCF no início do ciclo... 3.1.1 Ensaio de casa-de-vegetação, com substrato esterilizado... 58 58 58 58 59 59 60 60 60 61 61 61 61

12 3.1.1.1. Avaliações da emergência das plântulas.. 3.1.1.2. Avaliações da incidência do CBCF nas folhas cotiledonares... 2.8.1.3 Avaliações da incidência do CBCF nas folhas primárias... 3.1.2 Ensaio de casa-de-vegetação, em vasos com solo... 3.1.2.1. Avaliações da incidência do CBCF nas folhas cotiledonares... 2.8.2.2 Avaliação da severidade do CBCF nas folhas primárias... 3.1.3 Ensaio a campo... 3.1.3.1 Avaliações da incidência do CBCF, no primeiro trifólio... 3.1.3.2 Avaliações da severidade do CBCF, no primeiro trifólio... 3.2 Estudo da evolução da doença ao longo do ciclo da cultura... 3.2.1 Ensaio de casa-de-vegetação, em vasos com solo... 3.2.1.1 Avaliações da severidade do CBCF nas folhas primárias... 3.2.1.2 Avaliações da severidade do CBCF nas folhas trifolioladas... 3.2.1.3 Massa de matéria seca da parte aérea, nitrogênio total e massa de matéria seca de raízes... 3.2.2 Ensaio a campo... 61 62 62 65 65 65 67 67 68 70 70 70 74 78 79

13 3.2.2.1 Avaliações de incidência do CBCF... 3.2.2.2 Avaliações de severidade do CBCF... 3.2.2.2 Rendimento de grãos e peso de mil sementes... 79 82 84 3.3 Detecção e quantificação de Xapf na sementes produzidas em ensaio de campo... 86 4. CONCLUSÕES... 89 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS... 90 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 92

14 LISTA DE TABELAS Tabela Página CAPÍTULO I Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans em sementes defeijoeiro comum Phaseolus vulgaris L. Tabela 1. Eficiência das técnicas de extração de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var fuscans em sementes de feijoeiro comum e contagem das UFCs ml -1 em meio de cultura... 38

15 LISTA DE FIGURAS Figura Página CAPÍTULO I Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans em sementes defeijoeiro comum Phaseolus vulgaris L. 1. Quantificação de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var fuscans (UFC ml -1 ) em quatro meios de cultura a partir de três lotes sementes de feijoeiro com diferentes níveis de infecção... 41 CAPÍTULO II Biocontrole de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Smith) Dye em sementes de feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). Experimento 1 1 - Incidência (%) do Crestamento bacteriano comum do

16 feijoeiro nas folhas primárias de plântulas de feijoeiro comum cultivadas em substrato estéril em casa-devegetação... 64 Experimento 2 2 - Severidade (%) do Crestamento bacteriano comum do feijoeiro nas folhas primárias de plântulas de feijoeiro comum cultivadas em vasos contendo solo em casa-devegetação... 66 3 - Incidência (%) do Crestamento bacteriano comum do feijoeiro no primeiro trifólio em plântulas de feijoeiro comum cultivado a campo... 68 4 - Severidade (%) do Crestamento bacteriano comum do feijoeiro no primeiro trifólio em plântulas de feijoeiro comum cultivado a campo... 69 5 - Severidade do Crestamento bacteriano comum do feijoeiro nas folhas primárias de feijoeiro comum em ensaio realizado em casa-de-vegetação... 72 6 - Área abaixo da curva de progresso da doença nas folhas primárias em ensaio realizado em casa-devegetação... 74

17 7 Severidade do Crestamento bacteriano comum do feijoeiro nas folhas trifolioladas em ensaio realizado em casa-de-vegetação... 76 8 - Área abaixo da curva de progresso da doença nas folhas trifolioladas em ensaio realizado em casa-devegetação... 78 9 - Incidência do Crestamento bacteriano comum do feijoeiro em plantas de feijoeiro comum.... 80 10 - Incidência (%) do Crestamento bacteriano comum do feijoiro em plantas de feijoeiro comum cultivada à campos, aos 40 dias após a emergência... 82 11 - Severidade (%) do Crestamento bacteriano comum do feijoeiro em plantas de feijoeiro comum cultivada a campo... 84 12 - Rendimento de grãos de plantas de feijoeiro em ensaio realizado à campo... 85 13 - Peso de mil sementes de feijoeiro comum em ensaio realizado à campo... 86 14 - Quantificação de Xapf (UFC ml -1 ) nas sementes

18 produzidas de plantas de feijoeiro comum em ensaio realizado à campo... 88

19 DETECÇÃO E BIOCONTROLE DE Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Smith) Dye EM SEMENTES DE FEIJOEIRO COMUM (Phaseolus vulgaris L.) Autora: VANESSA ANDRÉIA AGOSTINI Orientadora: NORIMAR D'ÁVILA DENARDIN Co-orientador: CARLOS ALBERTO FORCELINI RESUMO - O crestamento bacteriano comum do feijoeiro (CBCF), incitado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Xapf), é responsável por grandes reduções no rendimento e na qualidade de grãos. A principal forma de disseminação dessa bactéria é através das sementes. Nesse contexto, o trabalho teve por objetivos consolidar técnicas de detecção de Xapf e determinar o potencial de biocontrole do CBCF, pela microbiolização de sementes com actinomiceto, veiculado em polímeros, na incidência e severidade do CBCF no inicio do ciclo, e na evolução do CBCF ao longo do ciclo da cultura de feijoeiro, bem como a detecção e quantificação de Xapf nas sementes produzidas. O estudo foi estruturado em atividades de laboratório, de casa-de-vegetação e de campo. Em laboratório, avaliou-se quatro métodos de detecção, técnicas de extração e a performance de quatro meios de cultura, empregando-se três amostras de semente de feijoeiro. A extração foi constituída por dois tempos de incubação, com e sem centrifugação e associados aos meios de cultura 523 de kado e MXP. Para o estudo de performance de meios de cultura avaliou-se os meios de cultura 523 de Kado, GYCA, NSA e PTSA. Para

20 determinar o potencial biocontrolador do actinomiceto foram conduzidos ensaios constituídos de quatro tratamentos: sementes infectadas naturalmente com Xapf; sementes naturalmente infectadas com Xapf e microbiolizadas com biocontrolador; sementes naturalmente infectadas e inoculadas com Xapf; e sementes naturalmente infectadas e inoculadas com Xapf e microbilizadas com biocontrolador. Avaliou-se emergência, incidência e severidade do CBCF, nos ensaios em casa-de-vegetação e a campo, e rendimento de grãos, peso de mil sementes e detecção de Xapf nas sementes produzidas no ensaio a campo. O melhor método de extração de Xapf foi incubação por uma noite, seguida de centrifugação, empregando o meio de cultura 523 de Kado. As avaliações mostraram que o melhor método de extração de Xapf foi incubação por uma noite, seguida de centrifugação, empregando o meio de cultura 523 de Kado. Quanto a performance dos meios de cultura, nos processos de detecção e de quantificação de Xapf o melhor meio foi PTSA, facilitando a identificação e a enumeração de colônias típicas, permitindo determinar níveis de infecção do patógeno nas amostras de sementes. No ensaio com substrato esterilizado, a emergência foi de apenas 57% para sementes inoculadas artificialmente com Xapf, diferindo-se, das inoculadas com Xapf e microbilizadas com biocontrolador, com 80% de emergência e para o tratamento com infecção natural e desinfestação superficial das sementes, de 91%. Pelas análises realizadas, no ensaio de casa-de-vegetação, tanto de regressão linear do progresso da doença, como para, a área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) verificou-se o potencial de biocontrole sobre a Xapf, sendo significativamente efetivo o controle do CBCF, no inicio e ao longo do ciclo da cultura pela menor incidência e severidade, tanto em casa-de-vegetação como no campo. Houve o aumento no rendimento de grãos e menores níveis do patógeno nas sementes produzidas à campo.

21 Palavras chave: Phaseolus vulgaris, patologia de sementes, meios de cultura, antagonismo, controle biológico. DETECTION AND BIOCONTROL OF Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Smith) Dye IN COMMON BEAN SEEDS (Phaseolus vulgaris L.) Author: VANESSA ANDRÉIA AGOSTINI Adviser: NORIMAR D AVILA DENARDIN Co-Adviser: CARLOS ALBERTO FORCELINI SUMMARY - The common bacterial blight of common beans (CBCF), a disease caused by Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Xapf), reduces grain yield and quality significantly. Because this bacterium is mainly disseminated through infected seeds, efficient detection of Xapf is important to assure productivity and quality for the crop. In this study, various techniques that included different extraction protocols (two times of incubation, with or without centrifugation) and four culture media (Kado 523, GYCA, NSA, and PTSA) were tested for the detection of the seed-borne inoculum, using three seed samples. Overnight incubation of the seeds, followed by centrifugation and incubation in Kado 523 provided the highest extraction of Xapf. Among the culture media, PTSA allowed better identification and counting of the bacterial colonies. Additional studies were performed to evaluate the biocontrol of CBCF by microbiolization of the seeds with an isolate of Actinomycete, named "Formulation". These studies included greenhouse and field trials, with Xapf naturally infected or artificially inoculated seeds, with or without microbiolization. The percent of plant emergence, CBCF incidence, and CBCF severity were assessed in the greenhouse, while grain yield, thousand kernel weight, and the percent of seed

22 infection were evaluated in the field. Plant emergence was 57% for seeds inoculated with Xapf, 80% for seeds inoculated and microbiolized, and 91% for those only microbiolized. The microbiolization also resulted in higher grain yield e lower seed infection in the field. Lower disease incidence and severity were observed on plants from microbiolized seeds, in both greenhouse and field trials. Such results indicate the potential of this technique for controlling Xapf and reducing CBCF. Key words: Phaseolus vulgaris, biological control, seed pathology, culture media, biological control, antagonism.

23 1. INTRODUÇÃO O feijoeiro comum, Phaseolus vulgaris L., é cultivado em cerca de 100 países (IBGE, 1996) e produz grãos de alto valor nutritivo como fonte de proteína vegetal (20 a 22%), energia (341 cal/100g), fibras, vitaminas, ferro e baixo teor de gordura para a alimentação humana e, ainda, efeito medicinal protetor e terapêutico a doenças coronarianas e oncológicas (Cnpaf, 2002). O Brasil é o maior consumidor mundial de feijão. Contudo, nos últimos 40 anos, houve queda no consumo per capita em, aproximadamente, 1% ao ano. Atualmente, o consumo é de 16 kg per capita/ano. A importação do produto e a preferência do consumidor por produtos semi-prontos têm contribuído para a elevação do preço do produto (Famato, 2003). A produtividade no país é baixa e a média situa-se em torno de 776 kg ha -1. Cerca de 90% da produção nacional é oriunda de pequenas e médias propriedades rurais, resultantes da aplicação de baixo nível tecnológico. Os 10% restantes da produção provém da safra de inverno, sob irrigação, nos cerrados brasileiros, conduzida em grandes propriedades rurais que empregam elevado nível tecnológico, que atingem produtividade média superior a 1.584 kg ha -1 (Cnpaf, 2002). A instabilidade produtiva e os baixos rendimentos da cultura são decorrentes, principalmente, da incidência de doenças com potencial de danos de até 100% ( Neto & Fancelli, 2000). O Crestamento Bacteriano Comum do Feijoeiro (CBCF), incitado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Xapf) (Smith, 1901; Vauterin et al., 1995; 1996) é uma das principais doenças da cultura, ocorrendo, em todas as regiões do mundo, principalmente devido à temperatura e à umidade elevadas (Mohan & Mohan, 1983;

24 Saettler, 1991; Gilbertson & Maxwell, 1992; Kersters & Swings, 1995;), sendo responsável pela redução de qualidade dos grãos (Valarini et al., 1996). A semente constitui-se na principal forma de disseminação do patógeno (Balardin, 1992; Zapata et al., 1985; Weller & Saettler, 1980;), sendo facilmente transportada pelo homem, além de aumentar o potencial de inóculo a cada ciclo da cultura (Halfeld-Vieira, et al, 2000). Portanto, o controle da doença baseia-se, fundamentalmente, na produção de sementes sadias. Tendo em vista o impacto do CBCF no rendimento e na qualidade dos grãos de feijoeiro e o potencial de disseminação de Xapf nas sementes, o presente trabalho teve como objetivos: a) comparar técnicas de extração de Xapf de sementes de feijoeiro; b) comparar meios de cultura, para os processos de detecção e de quantificação de Xapf, em sementes de feijoeiro; c) determinar o potencial de biocontrole do CBCF, pela microbiolização de sementes com actinomicetos, na "Formulação", na emergência das plântulas, a incidência e severidade do CBCF no inicio do ciclo d) determinar o potencial de biocontrole do CBCF, pela microbiolização de sementes com actinomicetos, na "Formulação" na evolução dessa doença ao longo do ciclo da cultura de feijoeiro; e e) determinar o potencial de biocontrole do CBCF, pela microbiolização de sementes com actinomicetos, na "Formulação", na detecção e quantificação de Xapf nas sementes produzidas.

25 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Crestamento Bacteriano Comum do Feijoeiro (CBCF) De acordo com Bianchini et al., apud Kimati (1997), o Crestamento Bacteriano Comum do Feijoeiro (CBCF) é considerado uma das doenças de maior importância entre as de etiologia bacteriana da cultura do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). A ocorrência é generalizada nas regiões de clima quente e úmido (Sartorato & Rava, 1994). Foi reconhecida pela primeira vez em 1892, nos Estados Unidos, por Beach (1892), e descrita, em 1897, por Smith (1901). No Brasil, foi relatada pela primeira vez por Robbs (1954), em materiais provenientes do estado do Rio de Janeiro. Encontra-se disseminada em todas as regiões brasileiras onde o feijoeiro é cultivado, sendo mais problemática na região norte do estado do Paraná, no estado do Rio de Janeiro e na região do Brasil Central, bem como no estado de Minas Gerais no plantio das águas (Vieira, 1983). 2.1.1. Etiologia O agente causal do CBCF é a fitobactéria Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap), (Smith, 1901; Vauterin et al., 1995; 1996) e a variante fuscans (Dye et al., 1980), conforme a nova nomenclatura proposta por Vauterin et al. (1995; 1996). 2.1.1.1. Taxonomia Segundo Agrios (1997), Xapf incitadora do CBCF é uma bactéria pertencente ao Reino Procariótico, Divisão Gracilicutes, Classe Proteobacteria, Família Pseudomonadaceae e Gênero Xanthomonas.

26 Desde a primeira descrição de Xap e da variante fuscans (Xapf), ocorreram diversas revisões taxonômicas (Bradbury, 1986). O gênero Xanthomonas foi recentemente reclassificado com base em estudos de hibridação DNA-DNA. O agente causal do CBCF, anteriormente classificado como Xanthomonas campestris pv. phaseoli, foi reposicionado como Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Vauterin et al., 1995; 1996). Em estudos realizados por Schuster & Coyne (1974) e Schuster et al. (1979), foi verificado que isolados de X. campestris pv. phaseoli provenientes da Colômbia e Uganda, apresentaram maior agressividade que o isolado americano Nebraska Xps. Também verificou-se o mesmo para outros isolados da Colômbia e do Brasil (Rava, 1984), demonstrando que os isolados das regiões tropicais são mais agressivo que os isolados das regiões temperadas. 2.1.1.1.1 Variante "fuscans" Uma variante de Xap denominada fuscans, que produz um pigmento marrom em meio de cultura, foi descrita pela primeira vez por Bulkholder, em 1930 (Gilbertson & Maxwell, 1992). A capacidade de produzir pigmento melanóide está relacionada, segundo Basú & Wallen (1966), com a fonte de carbono do meio de cultura. Contudo, conforme Bradbury (1986), a variante fuscans produz esse pigmento, "in vitro", na presença do aminoácido tirosina. Diferenças genéticas entre Xap e Xapf têm sido relatadas por meio de isoenzimas (El-sharkawy & Huisingh, 1971), por polimorfismo de comprimentos de fragmentos de restrição - RFLP (Lazo et al., 1987), por caracterização de plasmídeos (Lazo & Gabriel, 1987), por hibridação DNA-DNA (Hildbrand et al., 1990), por polimorfismo de DNA

27 amplificado-adp (Xue & Goodwin, 1994) e por polimorfismo de DNA amplificado ao acaso-radp (Birch et al., 1997). Xue & Goodwin (1994), estudando a região do genoma de Xapf, relacionaram os genes que controlam um sistema regulatório de resposta a estímulos do ambiente pela bactéria e encontraram fragmentos amplificados no genoma de Xapf, tanto a 470 bp quanto a 610 bp, as quais permitiram diferenciar Xapf de Xap. Birch et al. (1997), utilizando a técnica de RAPD ("Random amplified polimorfic DNA"), obtiveram um oligonucleotídeo (OPG-11) capaz de amplificar uma banda de 820 bp somente em isolados de Xapf, mostrando a existência de diferenças genéticas entre os isolados. Utilizando sondas de DNA de seqüência repetitiva obtidas do genoma de Xap, concluíram que os padrões de bandas formados para Xap e Xapf permitiram separar esses isolados em dois grupos distintos. Todavia, essa variante não foi reconhecida pelo Código Internacional de Nomenclatura de Bactérias e nem pelos padrões internacionais utilizados para nomear patovares de fitobactérias (Young et al., 1996). As diferenças entre Xap e Xapf também foram demonstradas por Maringoni & Bach (1998), quando compararam o perfil eletroforético de proteínas totais de 20 isolados de Xap e Xapf. Por meio de uma análise de grupamento, foi possível separar os isolados em três grupos distintos, sendo o primeiro constituído de isolados de Xapf, o segundo de isolados de Xap e Xapf e o terceiro formado somente por isolados de Xap. Em estudo sobre a variabilidade do patógeno, Watson (1970) não encontrou diferenças consistentes em patogenicidade entre isolados com e sem habilidade para produzir pigmento. Em trabalhos conduzidos por Vieira & Souza (2000), com isolados de Xap e Xapf inoculados em

28 plantas de feijoeiro comum (P. vulgaris L.) cv. Carioca, não observaram relações entre virulência em plantas de feijoeiro e capacidade de produzir pigmento escuro em meio de cultura. 2.1.1.2. Características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas Segundo o Manual de Bergey's (Willians et al., 1994), Xanthomonas axonopodis apresentam como característica fisiológica reação com o oxigênio e nutricional o uso de compostos como o CO 2, aminoácidos, fontes de carbono e fontes de nitrogênio, entre outras. Dentre as características bioquímicas, destacam-se, a liquefação da gelatina, hidrólise da esculina, do amido, da caseína e do H 2 S de peptona, redução de nitratos, fermentação de carboidratos e hidrólise lipídica(schaad & Stall, 2001). Do ponto de vista morfológico, as células possuem um flagelo polar, em nutriente ágar + glicose a 5% apresenta produção de xanthomonadinas, característico dessa bactéria. Possui máximo crescimento em temperatura de 35 a 37 C, tolerância ao NaCl a 1% e produção de ácido trehalose. Não usa asparagina como única fonte de carbono, é oxidase negativa, catalase positiva, aeróbia estrita e a reação de Gram é negativa. Em meio BDA as colônias são amarelo claras, elevadas e brilhantes, com bordos regulares (Romeiro, 1995). 2.1.2. Sintomatologia causada por Xapf no feijoeiro Os sintomas do CBCF incitado por Xapf, nas folhas, iniciamse como manchas encharcadas, que gradualmente aumentam de tamanho, posteriormente secam, formando lesões necróticas, freqüentemente margeadas por uma pequena zona de tecido amarelo-limão (Saettler, 1991). No caule, podem surgir lesões deprimidas iniciando como

29 manchas aquosas, que aumentam com o tempo, ocorrendo normalmente em plantas novas, e ao longo do caule aparecem riscos vermelhos, podendo rachá-lo, o que ocasiona um acúmulo de exsudado bacteriano na lesão (Sartorato & Rava, 1994). Nas vagens, os sintomas são lesões circulares, ligeiramente deprimidas e vermelho-escuras (Saettler, 1991). A infecção da vagem freqüentemente ocorre pelo sistema vascular da sutura dorsal, alcançando a semente geralmente através do funículo; quando a infecção é menos severa as sementes apresentam-se enrugadas e manchadas, nos casos de infecção severa, podem ser observadas a seca e a morte das vagens e sementes (Gilbertson & Maxwell, 1992). Wallen & Sutton (1965) verificaram que Xapf pode se localizar tanto externa como internamente à semente. Agarwal & Sinclair (1987) demonstraram que os sintoma da infecção da semente são evidenciados pela presença de uma descoloração amarelada no hilo. Estudo realizado por Gilbertson & Maxwell (1992) indicou a possibilidade da ocorrência de sementes contaminadas assintomáticas. 2.1.3. Aspéctos epidemiológicos 2.1.3.1. Condições de ambiente e doença De acordo com Chupp & Sherf (1960), apud Gilbertson & Maxwell (1992), as temperaturas entre 24 e 32º C são ótimas para o desenvolvimento da doença. Em conformidade, Saettler et al. (1995), relataram também como ótima a faixa de temperatura entre 28 e 32º C. O ótimo de temperatura, aliado à períodos com alta intensidade de chuvas, são necessários para a multiplicação da bactéria incitadora do CBCF. Segundo Webster et al. (1983), Kaiser & Vakili (1978) e Rava (1994),

30 respingos de chuva, através de aerosóis (pequenas gotícolas de água que contém bactérias em suspensão associadas com o vento) favorecem a disseminação. 2.1.3.2. Fontes de inóculo e sobrevivência a. Sementes A semente constitui-se no principal modo de introdução do patógeno em novas áreas até então livres da doença (Watson, 1970), considerada a principal fonte de inóculo primário (Neergard, 1979; Velásquez & Trujillo, 1984). O patógeno pode estar tanto infestando ou infectando as sementes (Webster et al., 1983, Kaiser & Vakili, 1978; Sartorato & Rava, 1994), com capacidade de sobrevivência na parte interna da semente, por um período de até 15 anos (Schuster & Sayre, 1967). Santos et al. (2001), em observações quanto à sobrevivência (longevidade) e a viabilidade (poder infectivo) de Xapf em um lote de sementes de feijoeiro comum contaminado e armazenado por um período de 30 meses, demonstraram que o ótimo para a conservação das sementes é de -18 C a 5 C, sendo esta temperatura também favorável para a manutenção da longevidade de Xapf em sementes de feijão. O êxito da sobrevivência depende, em parte, da quantidade de inóculo produzida e da continuidade de plantas hospedeiras (Schuster & Coyne, 1977). O alto nível de infecção das sementes resultam em taxas reduzidas de germinação, além de produzir plântulas deformadas (Schuster et al., 1979). Esse fato foi confirmado posteriormente por Valarini & Menten (1991) em testes de laboratório o patógeno nas sementes promoveu uma redução significativa na germinação e no peso de 1000 sementes. Esses mesmos autores demonstraram ainda que o

31 armazenamento provocou uma redução na incidência do patógeno nas sementes. Portanto, a infecção das sementes pela fitobactéria como meio mais importante para a sua difusão, justifica a necessidade da utilização de sementes sadias (Neto & Fancelli, 2000). b. Hospedeiros secundários e alternativos. A sobrevivência de Xapf também é garantida por populações residentes em plantas não hospedeiras ou em outras plantas hospedeiras. O patógeno apresenta uma ampla gama de hospedeiros: feijão comum, soja, mucuna, outras espécies de Phaseolus, várias espécies de Vignia (Bradbury, 1986). Dentre os hospedeiros conhecidos de Xap e Xapf citam-se Calopogonium sp., Dolichos lablab L., Macroptilium lathyroides, Phaseolus lunsatus L., Phaseolus vulgaris L., Pisum sativum L., Pueraria sp., Vigna aconitifolia, V. angularis (Willd.), V. mungo, V. radiata (L.) (Wilczek), V. umbellata, Strophostyles helvola, Helianthus annuus, Lupinus polyphyllus, Phaseolus acutifolius var. acutifolius, P. acutifolius var. latifolius e P. coccineus, Mucuna deeringiansa Bort. e V. unguiculata (L.) e Glycine max (Bradbury, 1986; Saettler, 1991; Vidaver, 1993). A bactéria Xapf também apresenta como hospedeiro o caruru (Amaranthus sp) e a língua-de-vaca (Rumex sp), bem como inúmeros outros patógenos são hospedados pelas principais espécies de plantas daninhas presentes em lavouras de feijoeiro (Neto & Fancelli, 2000). c. Restos de cultura Estudos sobre sobrevivência de Xapf em restos culturais, nas condições tropicais são limitados, em comparação com os realizados em zonas temperadas. Wimalajeewa & Nancarrow (1980) apud Saetler et al. (1986), não conseguiram recuperar isolados patogênicos de Xapf, a partir

32 de tecidos infectados deixados na superfície do solo por onze semanas, ou enterrados por três semanas, em Victoria, Austrália, o trabalho foi realizado em condições de clima que se assemelham às condições do Sul do Brasil, ou seja, clima subtropical. Schuster & Coyne (1977) já apontavam sobre este fato em sua revisão e mais tarde, Gilbertson & Maxwell (1992) também relataram a necessidade de se estudar melhor a sobrevivência deste patógeno em condições tropicais. 2.1.3.3. Transmissão O sucesso ou não de uma fitobactéria causar uma doença pode estar relacionado com a quantidade de inóculo e também com o potencial com que esse inóculo é transmitido ao hospedeiro suscetível (Schuster & Coyne, 1977). Valarini et al. (1996) verificaram que a taxa de transmissão de Xapf via semente é alta, variando de 16 a 50,8 % em função da suscetibilidade da cultivar empregada, e que até o nível de 10% de sementes contaminadas (portadoras) com a referida bactéria não afeta a emergência em campo. Porém, níveis a partir de 10% afetam significativamente a produção de grãos de feijão Romeiro et al.(1993), identificaram nas cultivares de feijoeiro Emgopa 201 Ouro e Emgopa 202 Rubi taxas de transmissão de Xapf para a parte aérea de 13,5% e 24% respectivamente. Valarini et al. (1992), evidenciaram que quanto maior a incidência da bacteriose no campo, maior será a sua incidência na semente produzida, ou seja, maior será a transmissão da planta mãe - sementes. 2.1.3.4. Disseminação

33 A disseminação de Xapf é favorecida pela água da chuva ou pelos respingos da irrigação, eficiente também na disseminação de outros patógenos bacterianos do feijoeiro. (Menzies, 1954; Grogan & Kimble, (1967); Trujillo-Pinto & Verde, (1986); Saettler, (1991). Weller & Saettler (1980) demonstraram que gotas de água de chuva podem remover 10% da população epífita desta bactéria. Segundo Trujillo-Pinto & Verde (1986), a disseminação ocorre a uma distância de até 1,40 m da fonte de inóculo. Insetos como Bemisia tabaci (Sabet & Ishag, 1969; Saettler, 1991), Diabrotica spciosa, Empoasca sp. e Nezara viridula (Kaiser & Vakili, 1978), podem contribuir para a disseminação do agente causal do CBCF. A semente constitui-se no meio mais eficiente de transporte e disseminação Xapf, determinando focos de infecção na mesma área, em áreas vizinhas ou em diferentes áreas e quando em condições climáticas propícias, desencadeia a epidemia do CBCF (Menten & Bueno, 1987). Wallen & Sutton (1965), verificaram, em Otawa, Canadá, que 0,5% de sementes com o patógeno foi suficiente para desencadear uma epidemia da doença. Mais tarde, Waller & Saettler (1980), em ensaio conduzido, demonstraram que a população mínima de 10 3 e 10 4 UFC de Xap por semente foi suficiente para originar plantas doentes em condições de campo. A disseminação primária de Xapf é caracterizada por ocorrer à grandes distâncias, realizada pelo homem através das máquinas agrícolas e pela semente infestada ou infectada com o patógeno, em condições ambientais de chuva intensa, é rapidamente disseminada por respingos de chuva, caracterizando a disseminação secundária (Webster et al., 1983, Kaiser & Vakili, 1978; Sartorato & Rava, 1994). 2.1.4. Danos

34 Os danos observados em condições de epidemia severa do CBCF são referentes a reduções no rendimento e os danos mais importantes são expressos na redução da qualidade, devido à presença de lesões nas vagens afetando o valor comercial das sementes produzidas. Nos EUA, a classificação comercial das sementes é realizada com base nos sintomas; aceita-se apenas 1% de vagens seriamente manchadas para a classificação do Tipo A ; acima desse valor são classificados em sub-classes; quando exceder a 4% esses campos são impedidos de serem colhidos (Webster et al., 1983). No Canadá, os danos observados foram de até 38% (Wallen & Jacson, 1975). Campos de produção bastante comprometidos nos Estados Unidos, foram observados em 1967, onde 75% da área semeada com feijão foi afetada, levando a uma redução de 10 a 20% no rendimento (Oliveira et al., 1993). No Norte da Dakota, EUA em 1998, foi relatado danos na cultura do feijoeiro devido ao CBCF por desfolha, descoloração e enrugamento de sementes, em caracter epidêmico provocando uma redução de 75% no rendimento (Venette & Lamey, 1998). Em todas as regiões produtoras de feijão do mundo, a doença encontrando-se largamente distribuída tendo provocado redução na colheita de, 10 a 30% (Martins et al., 2001). 2.1.5. Controle O CBCF é uma doença de difícil controle, em função do plantio ser efetuado em mais de uma época do ano em mesma área, da dificuldade de obtenção de cultivares comerciais resistentes e da baixa eficiência do controle químico (Valarini & Menten, 1992). O controle do CBCF consiste no uso de sementes livres do patógeno, rotação de culturas com três anos sem o cultivo de feijoeiro na área e pulverizações

35 com fungicidas (Agrios, 1997); inclui-se às práticas o tratamento de sementes ou aplicação foliar de bactericida e o emprego de cultivares tolerantes ou resistentes (Kimati, 1975; Vieira & Sartorato, 1984; Kulik & Stanwood, 1984; Athayde & Pacova, 1985). Mais recentemente a pesquisa tem dado ênfase ao emprego do controle biológico e produtos naturais (Cnpaf, 2002). 2.1.5.1. Práticas culturais As práticas culturais são medidas integradas como o uso de sementes sadias, cultivares tolerantes ou resistentes em sistema de rotação de culturas, no mínimo com intervalo de 2 anos sem cultivo do feijoeiro, práticas essas empregadas com sucesso no controle de doenças como o CBCF (Saettler, 1971; Neto & Fancelli, 2000). Em áreas com histórico de ocorrência da doença, o sistema de rotação, baseado nas culturas de milho, trigo, arroz, aveia, centeio, pastagens e adubação verde, concomitante com a eliminação de plantas daninhas e hospedeiras alternativos da bactéria, auxiliam na redução das fontes de inóculo para o controle da doença (Saettler, 1991; Sartorato & Rava, 1994). 2.1.5.2. Resistência genética A menor taxa de infecção na parte aérea e nas sementes de cultivares tolerantes, indicam que o melhoramento de cultivares pode constituir-se em uma técnica satisfatória. Porém, o patógeno pode persistir ou multiplicar-se mesmo em hospedeiros resistentes ou imunes (Schuster et al., 1979). Conforme (Van Der Plank (1963; 1984), a resistência genética do feijoeiro à X. campestris pv. phaseoli é do tipo horizontal. Os mecanismos de defesa do hospedeiro estão além da capacidade microevolucionária do patógeno. Este tipo de resistência

36 dificulta o desenvolvimento do patógeno no tecido do hospedeiro, pois quando poligênica, e em alguns casos oligogência, de efeito aditivo quantitativo, é afetada pelo ambiente. Os genótipos considerados resistentes apresentam baixa severidade da doença (Maringoni et al., 1992), e o efeito da resistência é aditivo controlado por poucos genes (Rava, 1985). Pela natureza genética complexa do feijoeiro, verifica-se a dificuldade de obtenção de cultivares resistentes à Xapf (Rava, 1984). Estudos realizados com as cultivares GN Tara e GN Jules, derivados da cultivar GN Nebraska 1 Sel 27, mostram que a natureza desta resistência é do tipo quantitativa, com o envolvimento de vários genes (Gilbertson & Maxwell, 1992). Em conformidade, Zapata et al. (1985) observaram a resistência de linhagens de feijão à Xap e concluíram que, para algumas linhagens, pode haver muitos genes envolvidos na resistência. Porém, em contrapartida, em outras evidenciou-se o caráter oligogênico, em que alguns poucos genes de efeito maior estariam envolvidos na resistência. A diferença de patogenicidade de isolados de Xap e a reação diferencial entre folhas e vagens do feijoeiro contribuem para dificultar o sucesso dos trabalhos que visam a obtenção de cultivares resistentes (Oliveira et al., 1993). Outras espécies de Phaseolus podem apresentar fontes de resistência ao patógeno em questão, tais como P. acutifolius e P. coccineus. Portanto, é dificultada a obtenção de uma cultivar que apresente a resistência genética à doença e ao mesmo tempo as características agronômicas desejáveis como adaptação ao ambiente e a qualidade do grão para o consumo (Sartorato & Rava, 1994). Segundo Bianchini et al., apud Kimati (1997), atualmente estão disponíveis as cultivares IAPAR 14, IAPAR 16, IAPAR 31 e Diamante negro. A base genética empregada pela maioria dos

37 melhoristas são os genótipos GN Nebrasca 1 sel. 27 e PI 207.262, que apresentam resistência poligênica. Kobayast et al. (1999), em estudos conduzidos na UFLA, avaliaram alguns materiais os quais foram classificados como resistente, em campo, tais como: H 4-22, H 4-9, CI 164-2, CI257-1, IAPAR 14, CI 107-4, CI 140, CI 164-4, RELAV 37.19 e CI 107-6, e como suscetíveis: CARIOCA, ANPAT 8.12, ANLAV 8.28 e OURO NEGRO. Em casa-devegetação, os que se destacaram como resistentes foram: LP 91-22, CI 257-1 e CI 107-4, e como suscetíveis: CI 257, ANPAT 8.12, MILIONÁRIO, CARIOCA MG, CI 128, CI 164-3, CI 257-2 e CARIOCA, H 4-22. Os valores obtidos para a herdabilidade no sentido amplo para reação em folhas, no campo e casa-de-vegetação, foram, respectivamente, 61,7% e 74,4%, já para a reação de vagens, não houve diferenças significativas entre os materiais. Conforme Torres & Maringoni (2002), em estudos sobre a reação foliar das cultivares Aysó, Carioca 80, Catu, G. N. Nebraska 1 sel. 27, IAC Carioca, IAPAR 14, IAPAR 16, IAPAR 31, Jamapa, Moruna 80, Pijao, Rio Negro, Rio Tibagi e Rio Vermelho a esta bactéria, evidenciaram resistência foliar à Xap nas cultivares IAPAR 14, IAPAR 16 e G. N. Nebraska 1 sel. 27. 2.1.5.3. Controle químico O controle químico deve ser usado como uma ferramenta que, somada a outras medidas de controle, como o uso de cultivares resistentes, impeça o desenvolvimento da doença sob condições favoráveis, uma vez que ele não é capaz de um completo controle (Gilberson & Maxwell, 1992). Conforme Velásquez & Trujillo (1984), tanto a contaminação externa como interna da semente é difícil de

38 erradicar, o que é confirmado por Reis et al. (2001) que afirmam que o tratamento de sementes para o controle de bactérias, em geral, apresenta maior dificuldade, embora existam recomendações de antibióticos como Auromicina e Terramicina. Os antibióticos podem erradicar a infestação por Xapf, mas sem sucesso na erradicação da infecção da sementes pelo patógeno (Sartorato & Rava, 1994). Bianchini et al., apud Kimati, (1997), desenvolveram pesquisas no Estado do Paraná e evidenciaram a ineficácia de três pulverizações dos produtos oxicloreto de cobre, sulfato de estreptomicina + oxitetraciclina, oxicloreto de cobre + maneb e oxicloreto de cobre + zineb no controle da doença nas folhas e vagens e na redução da transmissão da bactéria por semente. São recomendadas também pulverizações com óxido cúprico e a estreptomicina (Dickens & Oshima, 1969; Agarwal & Sinclair, 1996); porém, foi verificado a ineficiência no controle do CBCF pela utilização de produtos cúpricos (Maringoni, 1988). Portanto os hidróxidos de cobre e os fungicidas raramente evidenciam controle satisfatório sobre a doença quando as condições ambientais são favoráveis ao desenvolvimento e expansão do patógeno (Agrios, 1997). 2.1.5.4. Controle biológico O controle biológico de doenças, substituindo os agroquímicos, é uma das formas de produção que buscam reduzir ao máximo a dependência de energias não-renováveis (insumos industriais). Questões referentes à contaminação do solo e da água e principalmente dos alimentos, preocupam uma parcela cada vez maior da população, o que favorece ainda a expansão de uma agricultura "limpa" (Meirelles, 2001).

39 Um biocontrolador aplicado em sementes pode eliminar ou impedir o desenvolvimento de patógenos transportados pelas sementes ou presentes no solo, tendo ação de antagonismo, hiperparasitismo e/ou competição contra o mesmo (Menten, 1996). O antagonismo pode ser pela produção de bacteriocinas, metabólitos ácidos ou tóxicos, todos incompatíveis com a vida do patógeno, bem como pela competição trófica de elementos essenciais ao desenvolvimento do patógeno tanto "in vitro" (Konde, 1984) como "in vivo" (Turhan, 1981). O controle poderá ser pelo estímulo do hospedeiro por microrganismos, não necessariamente antagônicos, mas por que ativam mecanismos de indução de resistência (Romeiro, 1995; Wei et al., 1991; Chen et al., 1996). Os procariotos podem provocar o aumento do crescimento e o desenvolvimento de plantas por induzirem o aumento de reguladores de crescimento vegetal. (El-Abyad et al., 1993). A possibilidade de serem endofíticos e produzirem metabólitos, promoverem o aumento da absorção de nutrientes (Saracchi et al., 1992) e, ainda, quando introduzidos previamente, a partir de seu estabelecimento, podem reduzir a microflora deletéria pela produção de compostos inibitórios (El-abyad et al., 1993). O uso de procaritotos no controle de bactérias fitopatogênicas vem sendo estudado e, embora os trabalhos existentes sejam em número infinitamente menor do que aqueles visando controle de fungos, os resultados são promissores. Konde (1984) constatou antibiose em relação a espécies de Xanthomonas, Pseudomonas e Rhizobium. Alguns fungos, bactérias e actinomicetos têm sido envolvido no controle de fitopatógenos. Têm-se descrito como potenciais agentes de biocontrole os seguintes fungos: Tricoderma sp., Gliocladium roseum, Gliocladium virens, Coniothyrium minitrans, Talaromyces flavus, Pythium oligandrum, Sporidesmium sclorotivorum, Peniophora gigantea,

40 Ampelomyces quisqualis, Penicillium spp.; e as bactérias biocontroladoras: Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, P. fluorescens, Agrobacterium radiobacter e Streptomyces spp. (Melo & Azevedo, 1998). Beux & Denardin (2001), em estudo com o uso das bactérias Bacillus subtilis e Actinomcetos, in vitro e "in vivo" obtiveram resultados positivos no controle de Xapf. 2.1.5.4.1 Actinomicetos As bactérias de ordem Actinomicetales, são denominadas genericamente de actinomicetos. Apresentam células procariontes, sensibilidade às lisoenzimas e agentes antibacterianos, crescimento cúbico, formando grúmulos em meio de cultura líquido, filamentos finos semelhante às hifas fúngicas com diâmetro entre 0,5 a 2,0 µm, tipicamente ramificados e denominados micélios, e reprodução por fragmentação das hifas ou por produção de esporos assexuados em áreas especializadas do micélio. Em preparações jovens são gram (+). Constituem entre 10 a 50% da comunidade microbiana do solo. Atuam na decomposição da matéria orgânica, contribuem na estruturação do solo, através de ligações de suas hifas com partículas do solo, produzem antibióticos, cuja ação é evidenciada principalmente em meio de cultura, através das produção de halos de inibição, onde se forma uma zona livre de crescimento microbiano, em torno da colônia do actinomiceto que sintetiza o antibiótico. Os metabólitos dos actinomicetos são empregados na produção de diversas substâncias farmacológica e industrial, incluindo antibióticos, enzimas, inibidores enzimáticos e agentes imunomoduladores (Pereira, 2002).

41 Em estudo conduzido por Romeiro (1995), a partir do isolamento de trezentos e vinte e quatro isolados de actinomicetos do solo, observou "in vitro" a antibiose desse organismo contra Agrobacterium tumefaciens. Esse mesmo pesquisador, verificou que cinco dos isolados de actinomicetos, tiveram ação de biocontole "in vivo" de 81,5 a 91,3 % sobre A. tumefaciens. O potencial dos actinomicetos, através da antibiose à Ralstonia solanacearum foi verificado "in vitro ", e também "in vivo", através da microbiolização de sementes de tomate com actinomicetos, em condições de casa-de-vegetação e de campo Romeiro et al. (1998). Esse mesmo autor testou oito isolados previamente selecionados por Moura (1996), obtendo resultados positivos no biocontrole de R. solancearum em tomate e a indução de resistência da planta contra Pseudomonas syringae pv. tomato. 2.1.5.5. Controle por métodos físicos - termoterapia Métodos físicos podem ser empregados para erradicar bactéria em sementes como a termoterapia, através do uso de calor seco ou úmido; porém, esta técnica pode causar prejuízos como retardamento ou diminuição da germinação e do vigor. As sementes podem ser submetidas à pré-imersão em solução de polietilenoglicol a 30% para amenizar estes efeitos. Existem outras técnicas, tais como, energia solar, e as mais modernas, como micro-ondas e ultra som, sobre as mesmas (Menten, 1996). O uso da radiação, na maioria dos casos, apenas têm sido aplicado em caracter experimental, sem uma direta aplicação prática (Romeiro, 1995). 2.1.5.6. Certificação de sementes

42 Segundo Velásquez & Trujillo (1984), em Michigan, Estados Unidos, o controle do CBCF baseia-se na certificação de sementes para manter lotes dessas livres de infecção. Para isso são seguidas metodologias de laboratório consideradas viáveis e eficientes para a detecção do patógeno, e a produção de sementes livres do patógeno é feita em regiões áridas, onde a doença não existe ou se apresenta em níveis baixos (Gilbertson & Maxwell, 1992). No Brasil a certificação de sementes baseia-se, nas inspeções sanitárias em nível de campo. Vieira et al. (1993), apud por Oliveira & Souza (1997), relatam que em Minas Gerais a tolerância de Xapf em campos de produção de sementes básicas é de 0,5% de plantas com sintomas do CBCF e de 1,0% para sementes certificadas. Em São Paulo e no Paraná, tal tolerância chega a 20% de plantas com sintomas da doença para a produção de sementes certificadas (Valarini et al., 1996). 2.2. Detecção de Xapf em sementes A análise fitopatológica das sementes em laboratório é mais segura para determinar se as sementes estão transportando bactérias (Landaeta, 1968). Os teste de sanidade de semente constituem ferramenta no controle de bactérias, fornecendo informações para a expedição de certificados de sanidade sobre a necessidade de um tratamento para erradicar um patógeno específico, bem como a necessidade de quarentena. Além disso, devem ser reproduzíveis, econômicos, rápidos, específicos (Schaad et al., 2001) e de alta sensibilidade (Valarini & Menten, 1991; Rat, 1988). Muitas técnicas têm sido utilizadas para a detecção de bactérias em sementes na indicação da presença ou ausência do patógeno. Contudo, poucas são quantitativas ao nível de contaminação ou infecção