ESTUDOS ESTRUTURAIS E FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS

ESTUDOS ESTRUTURAIS E FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS Brasília DF.

Elaboração José Luiz de Souza Lopes Assuero Faria Garcia Julio Cesar Pissuti Damalio Produção Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração Todos os direitos reservados. W Educacional Editora e Cursos Ltda. Av. L2 Sul Quadra 603 Conjunto C CEP 70200-630 Brasília-DF Tel.: (61) 3218-8314 Fax: (61) 3218-8320 www.ceteb.com.br equipe@ceteb.com.br editora@weducacional.com.br

SUMÁRIO APRESENTAÇÃO... 4 ORGANIZAÇÃO DO CADERNO DE ESTUDOS E PESQUISA... 5 Introdução... 7 Unidade I estrutura e funções das proteínas... 9 Capítulo 1 Organização hierárquica da estrutura de proteínas... 11 Capítulo 2 Funções das proteínas... 21 Capítulo 3 Binômio estrutura-função de uma cadeia polipeptídica... 29 Unidade II estudos estruturais... 33 Capítulo 4 A Luz como Fonte de Informação... 35 Capítulo 5 Absorção no UV-Visível... 40 Capítulo 6 Difração de raios-x e cristalografia de proteínas... 44 Capítulo 7 Outras técnicas espectroscópicas... 46 Capitulo 8 O uso de Microscopia... 54 PARA (NÃO) FINALIZAR... 56 REFERÊNCIAS... 57

APRESENTAÇÃO Caro aluno A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da Educação a Distância EaD. Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma competente e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo. Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a como instrumento para seu sucesso na carreira. Conselho Editorial 4

ORGANIZAÇÃO DO CADERNO DE ESTUDOS E PESQUISA Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e pesquisas complementares. A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos e Pesquisa. Provocação Pensamentos inseridos no Caderno, para provocar a reflexão sobre a prática da disciplina. Para refletir Questões inseridas para estimulá-lo a pensar a respeito do assunto proposto. Registre sua visão sem se preocupar com o conteúdo do texto. O importante é verificar seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. É fundamental que você reflita sobre as questões propostas. Elas são o ponto de partida de nosso trabalho. Textos para leitura complementar Novos textos, trechos de textos referenciais, conceitos de dicionários, exemplos e sugestões, para lhe apresentar novas visões sobre o tema abordado no texto básico. Sintetizando e enriquecendo nossas informações abc Espaço para você, aluno, fazer uma síntese dos textos e enriquecê-los com sua contribuição pessoal. 5

Sugestão de leituras, filmes, sites e pesquisas Aprofundamento das discussões. Praticando Atividades sugeridas, no decorrer das leituras, com o objetivo pedagógico de fortalecer o processo de aprendizagem. Para (não) finalizar Texto, ao final do Caderno, com a intenção de instigá-lo a prosseguir com a reflexão. Referências Bibliografia consultada na elaboração do Caderno. 6

Introdução O Caderno de Estudos e Pesquisa Estudos Estruturais e Funcionais de Proteínas foi elaborado com o objetivo de proporcionar a você alguns conhecimentos básicos aplicados na área da Biologia Estrutural de Biomoléculas. Voltaremos o foco do nosso estudo para as proteínas, que são uma das biomoléculas que constituem os organismos vivos. Quando ouvimos falar em proteínas, a primeira ideia que nos vem à cabeça relaciona-se aos nutrientes encontrados em carnes, leites, vegetais, legumes. Costumamos, também, associar proteínas com enzimas. Essas relações apresentam coerência, pois, tanto os alimentos mencionados são fontes ricas dessa molécula quanto as enzimas exercem uma importante função nos organismos. No entanto, essas associações não representam, na sua totalidade, a grande ubiquidade, a importância e a diversidade estrutural e funcional que as proteínas possuem. Mas, então, como podemos descrever as proteínas? O que elas realmente são? Como se organizam e quais as suas funções? E por qual(is) motivo(s) elas merecem ser estudadas em particular? Além disso, como podemos estudá-las? São esses os questionamentos que pretendemos esclarecer ao longo deste caderno. O termo proteína deriva do grego proteíos, que significa o que tem prioridade, o mais importante. De fato, as proteínas são consideradas as macromoléculas mais importantes das células, chegando a representar o principal componente da massa celular em muitos organismos, constituindo quase 50% de suas massas. Às proteínas cabe a parte mais ativa na constituição do corpo do organismo, que tem papel fundamental na formação, no crescimento, na regeneração e substituição de diferentes tecidos, principalmente dos músculos. Os nossos genes conseguem regular diferentes processos celulares por meio da ação de diferentes proteínas, processos, por exemplo, como o de diferenciação celular. É por meio das proteínas que o código contido no DNA do organismo se manifesta. Dessa forma, a síntese de proteínas num organismo vivo representa muito mais do que um simples processo de fabricação de macromoléculas. Este Caderno visa proporcionar a você um estudo mais detalhado da estrutura e função dessas macromoléculas de essencial importância: as proteínas. 7

Objetivos»» Compreender a organização das proteínas nos seus diferentes níveis estruturais.»» Compreender as proteínas como moléculas tridimensionais.»» Identificar diferentes funções que uma proteína pode exercer.»» Discutir a estreita relação entre a estrutura e a função de uma proteína.»» Associar a função específica de uma proteína com sua estrutura 3D.»» Compreender como as proteínas são estudadas, utilizando a radiação eletromagnética.»» Fornecer princípios básicos de algumas técnicas físicas aplicadas no estudo de proteínas. 8

Unidade I estrutura e funções das proteínas

Capítulo 1 Organização hierárquica da estrutura de proteínas As proteínas são macromoléculas biológicas bastante complexas que podem ser vistas como verdadeiras máquinas moleculares capazes de executar, de forma rápida e programada, inúmeras tarefas essenciais à manutenção da vida. Devido ao grande número de proteínas conhecidas e às grandes diferenças encontradas nas propriedades de todas essas moléculas, existem muitos sistemas de classificação das proteínas. Um deles se baseia na solubilidade que elas apresentam: as albuminas (solúveis em água ou solução salina diluída), as globulinas (solúveis em solução salina diluída), as glutelinas (solúveis em soluções ácidas ou alcalinas diluídas), as prolaminas (solúveis em etanol 70-80%), as protaminas (insolúveis em água) e as escleroproteínas (insolúveis em água, soluções salinas, ácidas ou alcalinas). Também podemos classificar as proteínas, quanto à sua composição, em proteínas simples, que são formadas apenas por resíduos de aminoácidos, e proteínas conjugadas, que apresentam grupos de caráter não proteico (grupo prostético) ligados à cadeia polipeptídica. Existem ainda outras classificações que se baseiam na forma da proteína (fibrosa ou globular), no número de cadeias polipeptídicas (monomérica ou multimérica), ou, ainda, na função biológica que a proteína executa, ou quanto à estrutura tridimensional que possui. Aqui, vamos nos focar especialmente na estrutura e na função das proteínas, assim como na sua classificação. Uma das vantagens da classificação das proteínas com base na sua organização estrutural serve para melhor relacionar a proteína com a função que ela desempenha na célula. Mas, para melhor entendermos esse critério de classificação, precisamos nos remeter à hierarquia da organização estrutural que uma proteína apresenta e conhecê-la muito bem. Vamos considerar a molécula proteica em termos de seus níveis de organização estrutural. Podemos encontrar até 4 (quatro) níveis de estrutura: primária, secundária, terciária e, quando possuem, quaternária. Vejamos cada uma delas. 11

UNIDADE I estrutura e funções das proteínas A estrutura primária das proteínas Do ponto de vista químico, as proteínas são polímeros, ou seja, são longas cadeias moleculares resultantes da união repetida de várias moléculas menores, os resíduos dos L-aminoácidos (Figura 1). O primeiro nível de organização estrutural de uma proteína é dado pela sequência de aminoácidos que vai formar esse polímero, que é chamado de estrutura primária. Esta sequência específica de resíduos de aminoácidos que compõe a cadeia polipeptídica é apresentada iniciando-se pela extremidade N-terminal e finalizando com o resíduo da extremidade C-terminal, pois é nessa ordem que os aminoácidos são adicionados durante a síntese proteica na célula. Figura 1 Representação da estrutura primária de uma proteína. A cadeia polipeptídica é formada pela ligação covalente dos resíduos de aminoácidos, e é descrita da sua extremidade N-terminal (H3N+) para a sua extremidade C-terminal (COO-). Modificado a partir de http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages. Retirado em 11/01/2012. Obteríamos a mesma proteína ao final do processo de síntese, se ela fosse sintetizada na ordem inversa (do C para o N-terminal)? Por quê? Devido ao grande número de sequências de proteínas conhecidas foram criados bancos de dados (GenBank, EMBL, etc.) onde são depositadas tais sequências na memória de computadores que podem ser acessados via internet. Esses bancos de dados são atualizados continuamente devido ao rápido crescimento do número de estruturas conhecidas. Esse primeiro nível estrutural é importante, pois muitas doenças genéticas mostram ser resultado de proteínas que apresentam sequências anormais de aminoácidos, o que pode gerar perda ou prejuízo da sua função normal na célula. 12

estrutura e funções das proteínas UNIDADE I Obtenha a estrutura primária da hemoglobina humana. Uma característica importante a ser ressaltada neste nível de organização estrutural é o caráter da ligação covalente que se estabelece entre os resíduos de aminoácidos adjacentes, ou seja, a ligação peptídica (Figura 2). A ligação peptídica tem um caráter de dupla ligação, e não pode ser rotacionada, de modo a deixar os quatro átomos dos grupamentos dispostos em um plano rígido. Figura 2 - Representação da ligação peptídica entre dois resíduos de aminoácidos, formando um dipeptídeo. Modificado de: http://www.explicatorium.com/quimica/proteinas.php Retirado em: 14/07/2011. Apesar de a ligação peptídica impor essa alta rigidez no grupo peptídico, a junção de vários desses grupos peptídicos confere à cadeia polipeptídica linear uma alta flexibilidade, permitindo que ela gire em torno de diferentes ligações químicas. Esse dobramento específico da cadeia linear de resíduos de aminoácidos já nos remete ao segundo nível de organização estrutural das proteínas, a sua estrutura secundária. A estrutura secundária de proteínas Geralmente, a cadeia polipeptídica não assume uma estrutura tridimensional aleatória, ao contrário, forma arranjos regulares de aminoácidos que estão localizados próximos uns aos outros na sua sequência linear. Pequenas regiões numa proteína podem se organizar em arranjos helicoidais, enquanto outras regiões se organizam em arranjos mais estendidos e ou pregueados devido à movimentação dos átomos da cadeia principal dos resíduos de aminoácidos em torno dos seus ângulos de rotação. Esses ângulos são chamados de fi (ø) e psi (ψ), conforme Figura 3, e podem assumir diferentes valores para cada átomo de carbono da cadeia polipeptídica. 13

UNIDADE I estrutura e funções das proteínas Figura 3 Ângulos torcionais ø e ψ que determinam a estrutura secundária das proteínas. Fonte: F. Wold, em Macromolecule: Structure and Function (1971) Prentice-Hall, New Jersey. Dessa forma, com a variação dos valores de ø e ψ, a cadeia polipeptídica irá formar diferentes estruturas, mas é essencial lembrar que nem todos os valores de ângulos de rotação são permitidos para a rotação de uma unidade peptídica em relação à anterior. Há um grande número de conformações que são estereoquimicamente proibidas devido à presença das cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos que seriam posicionados em distâncias interatômicas entre átomos não ligados, por serem menores do que o raio de van der Waals correspondente. Quando a cadeia polipeptídica se arranja em uma conformação estereoquimicamente permitida para seus ângulos de rotação, dizemos que ela apresenta uma estrutura secundária que descreve a conformação local dos resíduos de aminoácidos na cadeia proteica. A tabela abaixo fornece os valores dos ângulos ø e ψ para as conformações mais frequentemente encontradas nas proteínas conhecidas. Tabela 1 - Valores dos ângulos diedrais fi e psi para as estruturas regulares mais encontradas. Conformação ø ψ α-hélice -57-47 Fita-ß paralela -119 +113 Fita-ß antiparalela -139 +135 Fonte: Campbel & Dwek. Biological Spectroscopy. 1984. 14

estrutura e funções das proteínas UNIDADE I A esse nível de organização estrutural que, para além das ligações peptídicas, também envolve as chamadas ligações por pontes de hidrogênio, um tipo de interação eletrostática entre os átomos de hidrogênio e oxigênio, chamamos elementos de estrutura secundária. Ela é estabilizada principalmente por ligações de hidrogênio entre o grupo amina e o grupo carboxila dos resíduos de aminoácidos da cadeia polipeptídica, que carregam cargas parciais positiva e negativa, respectivamente. Apesar de a ligação de hidrogênio ser uma ligação fraca, é a soma das energias de todas as ligações de hidrogênio numa proteína que as torna com uma energia considerável e capaz de estabilizar tal conformação. No gráfico de Ramachandran, esse famoso cientista foi capaz de determinar todos os ângulos de rotação prováveis que um resíduo de aminoácido pode apresentar e construiu um importante diagrama para as conformações de proteínas em função dos ângulos ø e ψ. Neste momento, cabe lembrar a importância da contribuição desse cientista para as possíveis conformações que uma cadeia polipeptídica pode adquirir. Aprofunde seus estudos, faça uma pesquisa sobre o assunto. Será possível que algum(s) resíduo(s) de aminoácido numa proteína real possa(m) ocupar uma posição desfavorável nesse gráfico de Ramachandran? Dessa forma, a estrutura secundária de uma proteína se refere ao dobramento local da cadeia principal da macromolécula, e pode ser especificada pelos ângulos entre os grupos peptídicos adjacentes. A grande maioria das estruturas secundárias encontradas nas proteínas cai em conformações muito bem definidas. Os quatro tipos mais conhecidos são discutidos abaixo: αhélice A estrutura helicoidal mais comum assumida pela cadeia polipeptídica se enrola em torno de um eixo imaginário, em que cada resíduo é rotado cerca de 100º em relação ao anterior, de modo a deixar 3.6 resíduos por volta, num giro de mão direita (Figura 4). Cada volta apresenta aproximadamente 5.4 Å de comprimento; logo, o passo de cada aminoácido é de 1.5 Å. Esse arranjo alinha os grupos carboxila e os grupamentos amina na direção do eixo da hélice. Além disso, as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos são posicionadas para o lado de fora da hélice, que é estabilizada por ligações de hidrogênio entre o oxigênio do grupo carboxila (que apresenta carga parcial negativa) e o hidrogênio do grupo amina (que apresenta carga parcial positiva) de quatro resíduos à frente ao longo da cadeia polipeptídica. A natureza polar dos grupos amina e carboxila dos aminoácidos faz com que haja uma tendência natural de um excesso de cargas positivas em uma das extremidades da hélice e um excesso de cargas negativas na outra extremidade, o que resulta na formação da hélice com um dipolo elétrico que pode participar ativamente nas interações eletrostáticas em proteínas. 15

UNIDADE I estrutura e funções das proteínas Figura 4 Dobramento da cadeia polipeptídica em elementos de estrutura secundária α-hélice. Modificada a partir de http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lecturesf04am/lect02.htm. Retirada em 11/01/2012. Na estrutura secundária de proteínas, é possível encontrar ainda diversos outros segmentos em arranjos helicoidais, mas que não estão em α-hélice. Discuta essas estruturas. Fitas-β O segundo tipo de estrutura secundária é o de β-estrutura (Figura 5), também chamado de fita-β. Nessa conformação, a cadeia polipeptídica está muito mais estendida, com um espaçamento de 3.5 Å entre os grupos peptídicos adjacentes, e com uma rotação por resíduo de 180º. As cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos apontam para baixo e para cima do plano da fita. Desse modo, não há a ocorrência de ligações de hidrogênio entre os carboxi-oxigênios e amino-hidrogênios em aminoácidos da vizinhança. Entretanto, ao posicionar várias fitas, uma ao lado da outra, é possível a formação de ligações de hidrogênio entre essas cadeias. 16

estrutura e funções das proteínas UNIDADE I Tais fitas podem se organizar paralelamente (de modo a deixar todas as extremidades carboxi-terminais voltadas para o mesmo lado) ou, ainda, antiparalelas. Figura 5 Dobramento da cadeia polipeptídica em elementos de estrutura secundária folha-β. (A) Paralelas; (B) Antiparalelas. Modificada a partir de http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lecturesf04am/lect02.htm. Retirada em 11/01/2012. Voltas Também chamadas de voltas-β por fazer a conexão entre duas fitas-β sucessivas. Tal estrutura aparece quase sempre na superfície de proteínas, permitindo que a cadeia polipeptídica se dobre e gire 180 º sobre si (Figura 6). É um exemplo de como é possível organizar diferentes fitas de uma folha-β antiparalela. Elas ocorrem geralmente entre quatro resíduos de aminoácidos, no qual o primeiro aminoácido é ligado, por um hidrogênio, ao quarto. Geralmente, um dos resíduos é uma Glicina ou uma Prolina. Figura 6 Dobra da cadeia polipeptídica em estrutura secundária do tipo volta-β. Fonte: http://www.imtech.res.in/raghava/betaturns/turn.html. Retirada em 11/01/2012. 17

UNIDADE I estrutura e funções das proteínas Estrutura desordenada Pode ser descrita como qualquer estrutura não regular numa cadeia polipeptídica. Tais regiões também são conhecidas como estrutura não ordenada, irregular, coils, ou randômica. O termo estrutura randômica está saindo de uso, pois os aminoácidos em coil apenas não apresentam uma posição espacial fixa na estrutura da proteína, mas têm uma localização espacial correta para a atividade da proteína. Essas estruturas possuem alta flexibilidade estrutural e, por tal motivo, podem exercer funções importantes na proteína, permitindo a ocorrência de diferentes mudanças conformacionais, como, por exemplo, no centro catalítico de muitas enzimas quando um ligante é introduzido. Outros exemplos incluem as cadeias laterais longas dos resíduos de Lisina e porções N ou C-terminais de muitos polipeptídios. A estrutura terciária das proteínas A estrutura terciária de uma cadeia polipeptídica pode ser vista como a junção de todos os elementos de estrutura secundária que uma cadeia polipeptídica apresenta, e principalmente, o modo como esses elementos estão arranjados no espaço, ou seja, ela descreve a conformação global de uma proteína. Diferentes exemplos estão mostrados na Figura 7. É a estrutura primária da proteína que vai determinar a sua correta estrutura terciária. Para que o correto enovelamento da proteína seja adquirido, deve haver um correto empacotamento dos elementos de estrutura secundária naquilo que chamamos de sua estrutura tridimensional. O arranjo tridimensional (ou conformação) dos átomos da proteína na estrutura terciária é de extrema importância porque geralmente coincide com a sua chamada estrutura nativa, a estrutura que confere à proteína uma função biológica específica. A estabilização da estrutura terciária se dá por diferentes tipos de interação. Uma das mais frequentes é a interação iônica entre resíduos de aminoácidos carregados. Esses resíduos podem estar muito distantes na sequência primária, mas conseguem se posicionar próximos ao espaço devido à maneira como a proteína se enovela. A estabilização da estrutura 3-D de uma proteína tem também contribuição de interações hidrofóbicas das cadeias laterais dos aminoácidos apolares que tendem a se esconder no interior da proteína, enquanto que a cadeia lateral dos resíduos hidrofílicos tem predominância na superfície da proteína, onde podem facilmente interagir com moléculas de água. A estrutura terciária ainda pode ser estabilizada pelas pontes de dissulfeto que se formam logo após o enovelamento. Uma ponte de dissulfeto é uma ligação covalente formada pelos grupos sulfidrila (-SH) de dois resíduos de Cisteína para produzir um resíduo de cistina. Tais pontes são mais comumente encontradas em proteínas da superfície celular e proteínas secretadas do que nas proteínas citossólicas. As ligações de hidrogênio e, ainda, as interações do tipo van der Waals também auxiliam na estabilização da estrutura terciária da proteína. 18

estrutura e funções das proteínas UNIDADE I Figura 7 Diferentes tipos de enovelamento ou estruturas terciárias adotadas pelas proteínas, uma vez já adquiridas sua estrutura secundária. Modificado a partir de Felix Frank 1988, Characterization of Proteins. A estrutura quaternária das proteínas A estrutura quaternária descreve como algumas cadeias polipeptídicas se juntam para formar uma proteína funcional; em outras palavras, podemos dizer que ela é o arranjo de múltiplas subunidades polipeptídicas em uma mesma proteína. Essas subunidades também são estabilizadas essencialmente por ligações fracas, tais como interações hidrofóbicas, interações eletrostáticas e ligações de hidrogênio. De acordo com o número de subunidades também é possível classificar uma proteína. Quando a proteína tiver uma cadeia polipeptídica é chamada de proteína monomérica, quando duas cadeias, é dita dimérica, 3 cadeias é trimérica e 4 cadeias é tetramérica, e assim sucessivamente. A estrutura quaternária ocorre quando cadeias polipeptídicas se associam por meio de ligações de hidrogênio, como ocorre, por exemplo, na formação da molécula da hemoglobina (tetrâmero). E ainda, essas subunidades podem atuar de forma independente ou cooperativamente no desempenho da função bioquímica da proteína. A Figura 8 mostra a estrutura quaternária da proteína Aquaporina, molécula envolvida no transporte de moléculas de água via membrana celular em diferentes organismos. 19

UNIDADE I estrutura e funções das proteínas Figura 8 Estrutura quaternária da proteína Aquaporina A. Aquaporina está inserida na membrana celular da planta de espinafre, responsável pela facilitação do transporte de moléculas de água via membrana, mostrando a interação entre suas quatro subunidades idênticas para compor a estrutura funcional tetramérica. Modificado a partir de http://www.rcsb.org/pdb/explore/images.do?structureid=1z98. Retirado em 11/01/2012. Vídeos a respeito do enovelamento de proteínas: http://www.youtube.com/watch?v=swec_suvz5i http://www.wiley.com/college/boyer/0470003790/animations/protein_folding/ protein_folding.htm Observe a estrutura tridimensional da hemoglobina humana, de uma ligante de ácidos graxos do fígado (LB FABP) e do inibidor de tripsina de soja (STI) e relacione suas similaridades e diferenças mais marcantes. 20

Capítulo 2 Funções das proteínas No nosso dia a dia ouvimos falar com frequência em algumas das funções de proteínas. Talvez uma das mais conhecidas seja a das enzimas, que aceleram determinadas reações químicas, ou, ainda, a dos anticorpos, que são capazes de identificar e eliminar os agentes invasores, tais como vírus e bactérias. Mas, como bem sabemos, existem ainda muitas outras proteínas que não pertencem a esses dois grupos, mas que apresentam essencial importância para o bom funcionamento do organismo. Numa célula humana, por exemplo, podemos encontrar em média 3000 proteínas diferentes, que executam os mais diferentes papéis. Neste capítulo, vamos relembrar algumas das funções mais importantes que são desempenhadas pelas proteínas nos organismos. Amplie seus conhecimentos com uma leitura mais abrangente em cada uma das funções destacadas para as proteínas. Proteínas que se ligam a outras moléculas As proteínas apresentam a capacidade de se ligar a uma grande diversidade de parceiros. A molécula que é ligada a uma proteína pode ser tão pequena como uma molécula de oxigênio, ou então tão grande como uma sequência de DNA. O reconhecimento específico de outras moléculas é uma das funções centrais das proteínas. A ligação é governada pela forma complementar da molécula que se liga à proteína, bem como regida por interações polares, iônicas e ligações de hidrogênio que se estabelecem entre a proteína e o parceiro. Como algumas proteínas são moléculas estruturalmente flexíveis, suas conformações podem mudar em resposta a variações no ph ou ligação de algum substrato. Além disso, a alta flexibilidade da estrutura terciária é de essencial importância para permitir que as proteínas se adaptem facilmente aos seus ligantes e executem suas funções. Como exemplo desse grupo, podemos citar as proteínas que se ligam aos íons de cálcio na célula (Figura 9), tal como a calmodulina, que participa das vias de sinalização de cálcio e pode interferir na ligação a outras moléculas uma vez ligada ao íon. 21

UNIDADE I estrutura e funções das proteínas Figura 9 Estrutura tridimensional da Calmodulina, uma proteína ligante de íon de Cálcio. Esta estrutura mostra a proteína ligada a quatro íons de Cálcio. Modificado a partir de http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureid=3cln. Retirado em: 11/-1/2012 É importante lembrar que o grau de flexibilidade varia em proteínas que apresentam funções diferentes dentro de um organismo; uma rigidez mais elevada é encontrada em proteínas que fazem parte do citoesqueleto. Você poderia dizer por quê? Proteínas catalíticas Cada reação química nos organismos vivos é catalisada e, na maioria das vezes, a catálise é promovida por enzimas. As enzimas agem perturbando a estabilidade da molécula de substrato, enfraquecendo as suas ligações covalentes. A eficiência catalítica de enzimas é considerável, de forma que as reações podem ser aceleradas por até 17 ordens de grandeza. Muitas características estruturais contribuem para o poder catalítico das enzimas: a manutenção dos grupos reativos juntos em uma orientação favorável para a reação, ligação do estado de transição da reação mais fortemente que o estado inicial do complexo e catálise ácido-base. 22 As enzimas podem ser moléculas simples, como, por exemplo, as hidrolases, que contêm apenas uma cadeia polipeptídica de baixa massa molecular, como a lisozima e a ribonuclease. Mas também podem ser mais complexas, geralmente oligômeros compostos de diferentes subunidades como as enzimas requeridas para catalisar reações químicas mais complexas, especialmente aquelas envolvendo transferência de grupamentos químicos.

estrutura e funções das proteínas UNIDADE I A atuação de uma proteína no reconhecimento molecular e na catálise de diferentes macromoléculas depende fortemente da complementaridade morfológica que se estabelece entre as duas moléculas. Como sabemos, para que uma proteína adquira a sua forma correta, ela deve ser enovelada. Assim, a formação de ambientes propícios (microambientes especializados) se à interação proteína-ligante também dependem do dobramento (estrutura terciária) proteico. Esses ambientes são chamados de sítio de ligação e podem assumir uma forma côncava, convexa ou mesmo planar. Para a ligação de pequenas moléculas, em geral o sítio de ligação é côncavo e se apresenta como pequenas cavidades ou bolsões na superfície da proteína. Em geral, os sítios de ligação apresentam um caráter parcialmente hidrofóbico, pois apresentam uma quantidade mais elevada de superfícies hidrofóbicas expostas. Essa propriedade faz com que o número de interações fracas entre a proteína e o ligante aumente, resultando numa alta afinidade entre essas moléculas. Além disso, a movimentação de moléculas de água, tanto do sítio de ligação como da superfície do ligante, também auxilia a interação proteína-ligante. Nas enzimas, a ligação ocorre no sítio ativo, que é o local onde ocorre a catálise (Figura 10). Os sítios catalíticos geralmente ocorrem nas interfaces dos domínios e das subunidades de uma proteína. Figura 10 Estrutura tridimensional da enzima pepsina e detalhe do seu sítio catalítico. Modificado a partir de Rev. Virtual Quim., 2009, 1 (2), 128-137 Proteínas estruturais As proteínas podem também atuar como um dos elementos estruturais mais importantes de um organismo. Essa função depende da associação específica de subunidades da proteína com ela mesma, e também com outras proteínas, carboidratos e outros parceiros. Proteínas que desempenham essa função são ditas proteínas estruturais, que atuam como um sistema de suporte de carga, e são geralmente caracterizadas por apresentarem uma elevada resistência à tração. As proteínas desse grupo são encontradas no exoesqueleto de insetos, em tecidos de sustentação, nos músculos, no capsídeo viral e, também, no citoesqueleto. O formato de uma célula é estabilizado por uma grande rede de proteínas, em forma de microfilamentos e microtúbulos que formam uma espécie de andaime, conhecido como citoesqueleto. Os microfilamentos são formados por moléculas de actina, e os microtúbulos são feitos pela polimerização ordenada de tubulina. 23

UNIDADE I estrutura e funções das proteínas Outra proteína estrutural muito bem estudada é o colágeno (Figura 11), que forma o tecido conjuntivo da maior parte dos animais, e também ocorre em imunoglobulinas, ossos, pele e córnea dos olhos dos vertebrados. Figura 11 Estrutura tridimensional do colágeno. O colágeno é uma importante proteína estrutural do tecido conjuntivo, composto por três feixes de proteína que são mantidas unidas numa hélice tripla. Modificado a partir de http://www.rcsb.org/pdb/explore/images.do?structureid=1wzb. Retirado em 11/01/2012. Proteínas de defesa O corpo humano é um ambiente rico em nutrientes. Dessa forma, seria rapidamente colonizado por vírus, bactérias e outros parasitas se não fosse a ação protetora de um sistema imunitário muito eficaz. Esse sistema conta com a ação de proteínas de defesa (anticorpos), que são capazes de reconhecer e inativar microrganismos invasores e outros materiais (antígenos), tornando-os inofensivos. Umas dessas moléculas são as imunoglobulinas (Figura 12), que são proteínas em forma de Y, altamente solúveis, encontradas no sangue, linfa e fluido intersticial. Elas são moléculas responsáveis pelo fornecimento da imunidade adaptativa nos vertebrados. 24 Figura 12 Representação e estrutura refinada de uma Imunoglobulina (IgG) intacta. As imunoglobulinas são um dos importantes representantes do grupo das proteínas de defesa capazes de reconhecer moléculas estranhas na corrente sanguínea e proteger contra infecções. Modificado a partir de http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureid=1igt. Retirado em 11/01/2012.

estrutura e funções das proteínas UNIDADE I As bactérias também utilizam moléculas de origem proteica como parte do seu sistema de defesa. No entanto, devido à baixíssima massa molecular que apresentam, essas moléculas são denominadas peptídeos antimicrobianos. Além de estarem presentes nas bactérias, esses peptídios antimicrobianos são largamente distribuídos entre os organismos e podem ser encontrados em toda a escala evolutiva, desde procariontes até animais superiores como mamíferos, onde são produzidos como parte do sistema de defesa, desempenhando um papel fundamental na sobrevivência do organismo. Esses peptídios provavelmente representam uma das primeiras formas de defesa química das células eucarióticas vivas contra invasão por outro organismo vivo. A maioria deles atua alterando a permeabilidade da membrana celular do organismo atacado, o que conduz à perda do controle osmótico ou à lise da membrana celular que resultam na morte do organismo. Ainda dentro desse grupo, destacam-se as proteínas que atuam no sistema de defesa dos organismos, que também são conhecidas por apresentarem propriedades citotóxicas. De um modo geral, citotoxicidade é uma propriedade que significa morte celular induzida por um composto químico. Quando esse composto apresenta caráter proteico, dizemos se tratar de uma proteína citotóxica. As proteínas tóxicas são geralmente moléculas pequenas e altamente móveis. Elas agem por ataque químico que destroem estruturas celulares ou por mecanismos de inibição de processos celulares vitais. O veneno das serpentes, por exemplo, contém diferentes proteínas tóxicas que, uma vez lançadas na circulação de suas presas ou de seus predadores, podem levá-los a morte. Proteínas citotóxicas são também encontradas no reino vegetal, como, por exemplo, a proteína chamada ricina (Figura 13), que é encontrada nas sementes da planta mamona (Ricinus communis). Essa proteína é altamente tóxica e chega a ser considerada uma das substâncias mais tóxicas de ocorrência natural conhecidas atualmente. Ela é uma toxina estável facilmente obtida a partir da mistura (mosto) que permanece após o processamento para o óleo da mamona. A intoxicação pode ocorrer após a inalação, ingestão ou injeção da toxina. A proteína atua impedindo a síntese proteica via inativação dos ribossomos do organismo que teve contato com ela, conduzindo à morte. Figura 13 Estrutura tridimensional da molécula de ricina, mostrando as duas cadeias polipeptídicas que forma a proteína tóxica. As duas cadeias são mantidas unidas por pontes S-S. Retirado em 11/01/2012 de http://www.ehso.com/ricin.php. 25

UNIDADE I estrutura e funções das proteínas Proteínas regulatórias Algumas proteínas atuam no organismo como verdadeiros mensageiros químicos. Esse é o caso dos hormônios de origem proteica que, uma vez sintetizados por glândulas ou células especializadas, são lançados na corrente sanguínea ou em outros fluidos corporais, e vão cumprir seu papel com o estímulo ou a inibição da ação de determinados órgãos em um indivíduo. Pequenas quantidades dessas proteínas são requeridas para alterar o metabolismo celular. A insulina é um exemplo desse grupo (Figura 14). Ela é um dos hormônios mais importantes. É produzida no pâncreas e adicionada à corrente sanguínea após as refeições quando os níveis de açúcar são elevados. Essa proteína leva mensagens que descrevem a taxa de glicose no sangue a cada momento. Esse sinal, então, se espalha por todo o corpo: para o fígado, músculos e células de gordura. A insulina está envolvida com a regulação de glicose, pois ela diz aos órgãos para retirarem a glicose do sangue e armazená-lo na forma de glicogênio ou gordura. Figura 14 Estrutura tridimensional da insulina humana. A insulina é uma proteína pequena que se move rapidamente na corrente sanguínea e é facilmente capturada por receptores celulares específicos, aos quais entrega sua mensagem. Os níveis de glicose no sangue podem subir perigosamente quando a função da insulina estiver prejudicada, como, por exemplo, no caso de houver algum dano às células pancreáticas, ou então pelo processo de envelhecimento que pode em alguns casos levar ao aparecimento da diabetes mellitus. Dessa forma, foi necessário realizar a busca de uma fonte abundante de insulina para ser utilizada nesses tratamentos. 26 Uma das primeiras alternativas deu-se com a utilização da insulina de suínos, uma vez que essa proteína se difere da insulina humana por apenas um resíduo de aminoácido: uma treonina posicionada no final da cadeia polipeptídica da insulina humana é substituída por um resíduo de alanina na insulina suína. Devido à grande semelhança, a insulina suína é também reconhecida pelos receptores das nossas próprias células e pode ser usado nessa terapia. Mas, atualmente, devido ao maior domínio das técnicas de produção de proteínas recombinantes, a insulina humana é também obtida por biotecnologia em cultura de bactérias, produzindo, assim, uma proteína recombinante exatamente idêntica à nossa própria proteína.

estrutura e funções das proteínas UNIDADE I Quais as características que as proteínas regulatórias compartilham com os hormônios de origem não proteica? Proteínas de transporte Como bem especificado, as proteínas de transporte são especializadas em veicular íons/moléculas de um lugar para outro, seja numa célula ou ao longo do corpo. Elas transportam substâncias no plasma sanguíneo, conduzindo íons ou moléculas específicas de um órgão para outro, como também por meio das membranas celulares. Exemplos de representantes desse grupo incluem o transporte de gases para os tecidos, principalmente do O2, que é carregado por meio do sangue por proteínas como a hemoglobina presente nos glóbulos vermelhos. Outro exemplo é a molécula de citocromo, que opera na cadeia de transporte de elétrons como uma proteína carreadora de elétrons. Mas a grande parte das proteínas de transporte são proteínas integrais de membrana, e podem ser localizadas nas membranas celulares e nas membranas das organelas citoplasmáticas, onde regulam o fluxo de diferentes íons (Na+, K+, etc.) e moléculas (glicose, aminoácidos, etc) essenciais para dentro e para fora dessas estruturas. Essas proteínas possuem em sua estrutura sítios específicos de ligação, conforme o substrato, que facilitam a entrada/saída (por um processo conhecido como difusão facilitada, Figura 15) de substâncias incapazes de entrar em uma célula por si só. Figura 15 Ilustração do processo de difusão facilitada. As proteínas de transporte são as responsáveis pela passagem dos solutos do meio interno para o externo e vice-versa. Modificado a partir de: http://www.mundoeducacao.com.br/biologia/difusao-facilitada.htm. Retirado em 11/01/2012. 27

UNIDADE I estrutura e funções das proteínas Proteínas de reserva As proteínas podem ainda apresentar uma função energética dentro dos organismos vivos, pois é possível a obtenção de energia a partir dos aminoácidos que as compõem. As proteínas de reserva ou proteínas de armazenamento são moléculas quimicamente muito estáveis. Elas são geralmente encontradas em grande concentração em locais do organismo que apresentam baixa umidade. Nas plantas, por exemplo, as sementes são grandes reservatórios desse grupo de proteínas, que podem ser utilizadas para a germinação e crescimento da planta. Essas proteínas servem como fontes de aminoácidos que podem ser oxidados como fonte de energia no mecanismo respiratório, caso haja necessidade energética. Proteínas motoras As proteínas motoras convertem a energia química da hidrólise do ATP em energia mecânica, utilizada, por exemplo, para a movimentação de organelas ao longo das estruturas do citoesqueleto. O músculo esquelético é formado por numerosas fibras, nas quais as proteínas actina e miosina atuam formando um complexo altamente organizado que é responsável pelos processos de contração muscular cuja energia é fornecida pela quebra da molécula de ATP. Muitos protozoários são impulsionados pelo batimento organizado de cílios e/ou pela movimentação de flagelos. Além disso, estruturas ciliares podem ser encontradas nas células epiteliais de vias aéreas numa movimentação muito sincronizada a fim de remover partículas contaminantes. A maioria dos cílios e flagelos apresenta uma estrutura básica formada de microtúbulos. Essas estruturas são formadas de arranjos proteicos. Existem, ainda, outras funções biológicas importantes que as proteínas desempenham em diversos organismos. Pesquise a respeito delas. 28

Capítulo 3 Binômio estrutura-função de uma cadeia polipeptídica Como sabemos, a vida depende amplamente do funcionamento correto de uma enorme quantidade de proteínas, uma vez que muitos processos celulares são controlados e regulados pela ação dessas moléculas, tais como expressão gênica, divisão e sinalização celular, transporte de vitaminas e gases, catálise enzimática, armazenamento, proteção mecânica e química, contração muscular. Dessa forma, muitas patologias podem ocorrer em um organismo que venha a apresentar uma incapacidade de produzir determinada proteína. É o caso, por exemplo, da diabetes de tipo I na qual o indivíduo não é capaz de produzir a proteína insulina. Do mesmo modo, outras patologias também podem ocorrer porque determinadas proteínas são fabricadas com defeito, ou seja, há um erro no processo de síntese proteica. Esse é o caso, por exemplo, das doenças de Parkinson e de Alzheimer resultando em proteínas que apresentam uma alta afinidade entre si e organização em forma de agregados que vão formar fibras que se depositam sobre o tecido neuronal do sistema nervoso central. Cite outras patologias causadas pela incapacidade de produção ou pela síntese defeituosa de alguma proteína? Um dos princípios importantes da Biologia Molecular é a ideia de que a estrutura nativa de uma proteína determine a sua função biológica específica. Como a função de uma proteína depende estritamente da sua estrutura nativa, se alguma pequena falha ocorrer durante o seu processo de enovelamento isso já pode ser suficiente para que a proteína deixe de ser capaz de executar a sua função biológica corretamente. Figura 16 Binômio estrutura-função de uma cadeia polipeptídica. 29

UNIDADE I estrutura e funções das proteínas Dessa forma, conhecer a estrutura nativa (estrutura terciária) correta de uma proteína é um processo de suma importância, que é visto como um pré-requisito para o entendimento de sua função biológica e também para o planejamento e desenho de possíveis fármacos, inibidores, parceiros de interação, etc. relacionados com a ação dessa proteína. A estratégia de predizer a função biológica de uma proteína de olho na sua estrutura tridimensional é uma tarefa de grande interesse em biologia estrutural, uma vez que existe um número considerável de estruturas de proteínas resolvidas e um crescente número continua sendo depositado em bases de dados. No entanto, muitas dessas proteínas apresentam pouquíssimas ou nenhuma caracterização funcional. Existem diferentes métodos computacionais de comparação global de estruturas que utilizam diferentes algoritmos para transferir anotações funcionais para um núcleo estrutural comum, pois a compreensão de como a estrutura tridimensional (3D) molecular de proteínas influencia a sua função pode fornecer grandes esclarecimentos sobre o funcionamento dos sistemas biológicos. Por outro lado, um exame mais minucioso das proteínas ilustra que não somente as estruturas singulares se desenvolveram para preencher funções biológicas específicas, mas, também, há uma íntima relação entre as funções biológicas da proteína e a estrutura que ela apresenta. Por exemplo, a maioria das proteínas fibrosas que desempenham papéis estruturais em tecidos específicos apresenta uma sequência de aminoácidos atípica; tais sequências vão determinar um dobramento específico em estruturas secundárias e terciárias que conferem as propriedades mecânicas dessas proteínas. Essa é uma relação importante que despertou a atenção de muitos cientistas e que pode ser vista como tema central de uma abordagem claramente interdisciplinar, pois requer a utilização de ferramentas desenvolvidas em disciplinas como a química, a biologia celular, a fisiologia e a Física. Desse modo, podemos dizer que, de uma forma geral, se compreendermos como a sequência de aminoácidos determina a estrutura nativa de uma proteína, isto é, se compreendermos a relação sequência-estrutura, poderemos desenhar qualquer proteína. Mas essa tarefa não é tão simples e requer algo mais essencial como, por exemplo, a compreensão da questão mais geral e mais fundamental que é a do próprio mecanismo de enovelamento das proteínas. A hemoglobina é uma proteína responsável pelo transporte de oxigênio dos pulmões para as outras células. Ela é composta por 4 subunidades, cada qual possuindo 147 aminoácidos na estrutura primária; porém, uma mutação pontual na sua estrutura leva ao desenvolvimento da anemia falciforme, uma doença hereditária que leva à modificação do formato das hemácias, dificultando o transporte de oxigênio pelo organismo. Qual dos lados do binômio você acredita ser o mais importante: a estrutura de uma proteína determina a sua função? Ou a função que a proteína exerce dita a sua estrutura? 30 Podemos dizer que as proteínas são as moléculas mais versáteis dentro da célula. O fato de algumas proteínas poderem se ligar a distintas macromoléculas (DNA, carboidratos, lipídeos, e as próprias proteínas) explica a sua habilidade de apresentar motivos estruturais diversos e superfícies químicas com diferentes caracteres numa mesma molécula, que podem interagir com parceiros com uma alta especificidade.

estrutura e funções das proteínas UNIDADE I Essa extraordinária diversidade funcional e versatilidade de uma proteína provém da grande diversidade química das cadeias laterais dos seus aminoácidos constituintes, da alta flexibilidade da cadeia polipeptídica, e do grande número de maneiras em que uma cadeia polipeptídica com sequência de aminoácidos diferentes pode se enovelar. As forças que governam o enovelamento proteico são geralmente medidas em termos termodinâmicos. Uma diminuição na energia livre da proteína enovelada fornece a força para o dobramento espontâneo da cadeia polipeptídica. Em ambientes aquosos, por exemplo, as proteínas globulares são mais estáveis no estado enovelado do que quando desenoveladas. Visto a complexidade da estrutura proteica e sabendo que alterações na sua estrutura 3D podem ser responsáveis por sérias enfermidades, nos cabe perguntar: como é possível conhecer a estrutura de uma determinada proteína? Também nos cabe questionar quais técnicas são aplicadas no estudo das alterações conformacionais da estrutura proteica? Tais temas serão discutidos na próxima unidade deste Caderno de Estudo. Uma proteína deve ser altamente ordenada estruturalmente para exercer a sua função? Existem algumas proteínas que desafiam o atual paradigma estrutura-função. O paradigma estruturafunção de uma proteína correlaciona a função de uma proteína com uma estrutura tridimensional bem definida, o que assegura uma correta distribuição espacial dos resíduos de aminoácidos que estão envolvidos no reconhecimento molecular, catálise, etc. A relevância e o sucesso dessa visão são demonstrados por inúmeros artigos científicos que elucidam a função de uma grande variedade de enzimas, receptores e proteínas estruturais. Apesar do imenso valor e conhecimento molecular que essa abordagem nos trouxe, uma recente onda de artigos alerta que ela é ainda uma visão muito simplificada, uma vez que muitas proteínas, ou mesmo grandes regiões numa proteína, e ainda, grandes domínios proteicos se encontram num estado funcional intrinsecamente desordenado. Existe uma grande tendência de chamar essas proteínas de proteínas intrinsecamente desordenadas. Em termos estruturais, as proteínas intrinsecamente desordenadas se assemelham muito com o estado desenovelado de uma proteína ordenada. A falta de uma estrutura ordenada já foi descrita em proteínas essenciais, tal como a RNA Polimerase II. A importância funcional dessas proteínas é também ressaltada pelo fato de que elas ocorrem com muita frequência em proteínas associadas com a transdução de sinais e regulação do ciclo celular, expressão gênica, etc. A falta de ordenamento dessas proteínas lhes confere algumas vantagens sobre as demais, tais como um aumento na velocidade de interação, a habilidade de desempenhar mais do que uma função, pois podem facilmente interagir com distintos parceiros simultaneamente. Isso porque o baixo grau de ordenamento lhes dá uma alta flexibilidade estrutural, característica que as capacitam a se moldarem facilmente para a ligação de diferentes alvos. 31

Unidade II estudos estruturais

Capítulo 4 A Luz como Fonte de Informação Esta unidade tem o objetivo de lhe apresentar algumas das principais abordagens que são utilizadas para a realização do estudo estrutural das proteínas. Para isso, vamos iniciar nosso estudo com uma breve apresentação da ferramenta utilizada para essas investigações: a luz. Como é possível examinar a forma de uma molécula tão pequena que não pode ser visualizada nem com o microscópio mais potente? É exatamente esse o cenário que encontramos quando tentamos conhecer a estrutura de uma proteína não conseguimos visualizá-la. A fim de solucionar esse problema, o que se utiliza é uma medida indireta de uma grande quantidade de moléculas idênticas. Essa medida se dá com o emprego da luz (radiação eletromagnética), que se faz incidir sobre a proteína em estudo. Ao longo dos anos, em sua investigação acerca da estrutura da matéria, a comunidade científica faz uso da radiação eletromagnética. Muito do atual conhecimento científico foi adquirido com o uso de diferentes tipos de radiação, conforme mostrado na Figura 17. Edifícios Humanos Borboletas Ponta de Agulha Protozoários Moléculas Átomos Núcleo atômico Frequência (Hz) 10 4 10 8 10 15 10 20 10 12 10 16 10 18 Figura 17 Escala comparativa dos diferentes comprimentos de onda e frequência da radiação eletromagnética (luz). Modificado a partir de http://pt.wikipedia.org/wiki/espectro_eletromagn%c3%a9tico. Retirado em 12/01/2012. 35