NANCÁPSULAS BICMPATÍVEIS VIA PLIMERIZAÇÃ EM MINIEMULSÃ USAND SURFACTANTE E HIDRÓFB BIDEGRADAVEIS Ana P. Romio 1, Claudia Sayer 1, Sandro R. P. da Rocha 2, Pedro H. H. Araújo 1* 1 Depto. de Engenharia Química e Alimentos da UFSC, Caixa Postal 476, 88040-970 Florianópolis/SC - a.romio@terra.com.br, csayer@enq.ufsc.br, * pedro@enq.ufscr.br, 2 sdr@eng.wayne.edu - Depto. Engenharia Química e Ciência de Materiais da Universidade Wayne, Caixa Postal 5050, 48202 Detroit/ MI EUA Biocompatible Nanocapsules by Miniemulsion Polymerization using Biodegradable Surfactant and Hydrophobe In this work we report the formation of biocompatible nanocapsules by miniemulsion polymerization with the renewable, biodegradable and biocompatible lecithin and triglycerides from fatty acid (Neobee M-5 ) as the surfactant and hydrophobe, respectively. Poly(methyl methacrylate) is used as a model polymer system. Very stable nanocapsules with high yields were obtained. Nanocapsules approximately 550 nm in diameter and containing 50% of hydrophobe showed an engulfed morphology. Biocompatible nanocapsules with high encapsulation efficiency are promising candidates for the delivery of hydrophobic drugs in a variety of biomedical applications. Introdução Nanocápsulas poliméricas consistem de partículas submicrométricas com morfologia cascanúcleo formadas por uma casca de polímero e o núcleo contendo um não solvente ao polímero que pode ser água ou um composto orgânico que se deseje encapsular e que em algumas aplicações pode conter um composto ativo dissolvido. Estas partículas são potencialmente úteis para microencapsulação e liberação controlada de medicamentos. Diversas técnicas podem ser utilizadas para produção de nanocápsulas tais como inchamento osmótico [1], encapsulamento de um não solvente [2,3], emulsão de água-em-óleo-em-água [4], inchamento com um solvente [5], nanocápsulas por polimerização em miniemulsão [6] e incorporação de um agente expansor [7]. A obtenção de nanocápsulas via polimerização em miniemulsão apresenta como vantagem em relação aos demais métodos a possibilidade de se obter as nanocápsulas em apenas uma única etapa de reação. Em comparação com a polimerização convencional em emulsão, a polimerização em miniemulsão [8] oferece diversas vantagens quando usada como uma técnica de nanoencapsulamento. Na polimerização em miniemulsão, o monômero se encontra pré-disperso em gotas de 50-500 nm, estabilizado pela combinação de um surfactante e de um co-estabilizador seletivamente solúvel na fase orgânica. surfactante tem a função de estabilizar as gotas de monômero, diminuindo a pressão de Laplace e evitando a coalescência das gotas de monômero. Já o co-estabilizador retarda a degradação de stwald (degradação difusional). A escolha do co-
estabilizador apropriado é um fator muito importante para a formulação de miniemulsões estáveis: sendo que muitos trabalhos descrevem o uso de álcool cetílico e hexadecano. Como as gotas de monômero são suficientemente pequenas e numerosas as micelas tipicamente não existem em um sistema bem preparado em miniemulsão e a nucleação das gotas de monômero se torna predominante na polimerização em miniemulsão. Acredita-se que a maioria das gotas de monômero são diretamente convertidas em partículas não requerendo o transporte do monômero ou de outros compostos hidrofóbicos de um reservatório (gotas de monômero da polimerização em emulsão convencional) para o lócus da polimerização (partículas de polímero). Esta característica torna a polimerização em miniemulsão atrativa para o nanoencapsulamento, pois o composto a ser encapsulado já se encontra no interior do lócus de polimerização. Entretanto, os efeitos dos fatores termodinâmicos e cinéticos na separação de fases e na morfologia das partículas são de suma importância para a eficácia do método. Poucos trabalhos foram publicados empregando a polimerização em miniemulsão para obtenção de nanocápsulas poliméricas. Landfester et al. [9] obtiveram nanocápsulas de PMMA usando hexadecano como hidrófobo, no entanto, este composto não é biocompatível. Para aplicações biomédicas, os materiais que formam as cápsulas devem ser ao menos biocompatíveis. Bathafield et al. [10] encapsularam um hidrófobo biocompatível, Miglyol, em partículas de PVAc e utilizaram como surfactantes não-iônicos biocompatíveis, o Pluronic F68 e o macromonômero caprolactona. A aplicabilidade das nanocápsulas para fins biomédicos pode ser aumentada se forem usados materiais biodegradáveis e biocompatíveis. A lecitina natural é formada por fosfolipídeos não tóxicos, como mostra a estrutura geral na Figura 1(b), sendo biocompatível, biodegradável e proveniente de fontes renováveis como a soja. A lecitina forma microemulsões estáveis na presença de co-estabilizadores e solventes orgânicos [11] atuando como surfactante ao diminuir a tensão interfacial entre as fases orgânica e aquosa. Neobee M-5 e uma mistura de triglicérideos caprílico (50-65%) e cáprico, como mostra a estrutura geral na Figura 1(a). Este composto é biocompatível, biodegradável e proveniente de fonte renovável (óleo de coco), sendo frequentemente utilizado para dissolver drogas hidrofóbicas, obtendo assim uma formulação apropriada para aplicação oral. Por ser altamente hidrofóbico, é adequado para atuar como hidrófobo, reduzindo a degradação difusional das gotas de monômero. PMMA não é solúvel no Neobee M-5, portanto, este composto também é adequado para a obtenção de nanocápsulas já que pode atuar como não solvente ao polímero. objetivo deste trabalho é estudar a obtenção de nanocápsulas estáveis via polimerização em miniemulsão usando hidrófobo e surfactante biocompatível e biodegradável, visando futuras
aplicações biomédicas. Para isto, foi avaliado o efeito de diferentes concentrações de lecitina e energia de dispersão nas características morfológicas do látex final. H 2 C HC H 2 C C C C CH 2 CH 3 n CH 2 CH 3 n CH 2 CH 3 n a) n = 6 (66%) e 18 (34%) Figura 1 Estrutura química do Neobee M-5 (a) e da Lecitina (b). CH 2 H 2 C C R 1 HC C R 2 CH 3 H 2 C P CH 2 + N - CH 3 b) R 1 e R 2 = alquila de cadeia longa CH 3 Experimental Materiais monômero utilizado foi o metacrilato de metila (MMA) e o iniciador adotado foi 2,2 -azobis-isobutironitrila (AIBN) fornecidos pela empresa Sigma-Aldrich. biosurfactante empregado foi a lecitina fornecido pela Alfa Aesar. co-estabilizador utilizado foi o Neobee M-5, composto por triglicérideo caprílico e cáprico fornecido pela Spectrum. As reações de polimerização do metacrilato de metila (MMA) em miniemulsão usando Neobee M-5 como co-estabilizador e não solvente ao polímero, e lecitina como biosurfactante foram realizadas em ampola a temperatura constante. controle de temperatura foi realizado por um banho termostático, modelo MQBTCA- 100, da marca MicroQuímica, onde as ampolas ficaram submersas no decorrer das reações. A Figura 2 apresenta uma reação em ampolas no banho termostático. Para o preparo da miniemulsão foi utilizado o dispersor ultrassonico Mesomix Sonifier 3000, constituído por um bastão de aço inox, o qual emite ondas de ultra-som que produzem turbulência no sistema, ocasionando o rompimento das gotas. Para assegurar a eficiência da homogeneização se fazem necessários alguns cuidados com as dimensões e o volume do recipiente utilizado na dispersão. Pois o volume e as dimensões do recipiente utilizado para o preparo da miniemulsão influenciam diretamente no tamanho inicial das gotículas de monômero da dispersão.
Figura 2 Reação em ampolas. Banho termostático (MQBTCA-100), contendo as ampolas com as amostras de miniemulsão. Procedimento Inicialmente foram preparadas as fases aquosa e orgânica de acordo com as formulações apresentadas na Tabela 1. Para este fim, ambas as fases foram agitadas separadamente por 10 minutos com agitador magnético, sendo que a lecitina, por ser basicamente lipolífilica, foi dispersa na fase orgânica. Em seguida foi realizada a dispersão da fase orgânica na fase aquosa. A dispersão foi realizada com o dispersor ultrassônico variando a amplitude entre 20% e 40% e o tempo foi mantido constante em 2 minutos. Para minimizar o aumento da temperatura durante a dispersão, fato que pode resultar na decomposição do iniciador e, conseqüentemente, iniciar a reação de polimerização durante a dispersão, foi usado um banho de gelo. Tabela 1 Formulações usadas no preparo de nanocápsulas de metacrilato de metila com diferentes concentrações de lecitina e diferentes níveis de energia do ultra-som. LÁTEX REAGENTES Fase Fase orgânica aquosa Água (g) Lecitina (g) Neobee (g) MMA (g) AIBN (g) Amplitude do dispersor ultrassônico (%) BS 1 24,00 0,02 3,00 3,00 0,07 20 BS 2 24,00 0,02 3,00 3,00 0,07 30 BS 3 24,00 0,02 3,00 3,00 0,07 40 BS 4 24,00 0,06 3,00 3,00 0,07 20 BS 5 24,00 0,06 3,00 3,00 0,07 30 BS 6 24,00 0,06 3,00 3,00 0,07 40 procedimento de partida das reações em ampolas foi realizado enchendo as ampolas com a miniemulsão e colocando em banho a temperatura de 70 C, dando início a reação de polimerização. Foram tomadas amostras periodicamente para medidas da cinética de reação, sendo
que para cada amostra era retirado do banho termostático uma ampola distinta previamente identificada, parando instantaneamente a reação da amostra com uma solução de hidroquinona a 1%. Caracterização A conversão do monômero em polímero foi medida por gravimetria. tamanho médio das partículas e a morfologia das partículas foram determinados através das imagens obtidas por Microscópio Eletrônico de Transmissão (TEM, JEL - JEM 2010) e Microscópio Eletrônico de Varredura (SEM, HITACHI S-2400) que estão alocados no Department of Chemistry, College of Engineering, Wayne State University. Através das medidas de gravimetria e dos tamanhos médios das partículas foram calculadas as concentrações de partículas levando em conta a contração volumétrica, devido a diferença de densidade do polímero e do monômero. A tensão interfacial foi determinada através do método da gota pendente, descrito detalhadamente por Pichot et al. [12]. Neste método, a forma da gota pendente de água formada na borda do tubo capilar dentro de uma cubeta de vidro, que contém a solução de surfactante, Neobee- M5 e metacrilato de metila foi registrada em função do tempo, e a tensão interfacial foi calculada pelo ajuste da equação de Laplace pelo perfil inteiro da gota. Foram realizadas no mínimo cinco analises independentes da medida de tensão interfacial. A estabilidade da miniemuslão foi verificada visualmente e através de medidas do tamanho de partícula obtidas pelo equipamento de espalhamento dinâmico de luz (Malvern Zetasizer Nano S). Após a polimerização os látexes foram armazenados a temperatura ambiente, e a estabilidade foi definida pela separação nítida do sistema em duas fases, e em alguns casos sendo acompanhado o tamanho de partícula ao longo do tempo. Resultados e Discussão uso de compostos biocombatíveis e/ou biodegradáveis na produção de nanocápsulas é de suma importância para aplicação biomédica. A relação mássica monômero/neobee foi mantida constante em 1:1. Neste conjunto de experimentos foi avaliado o efeito de concentração de biosurfactante lecitina e da energia do ultra-som utilizado na obtenção das nanocapsulas. Em uma formulação padrão, geralmente o hexadecano é utilizado como co-estabilizador, neste caso foi substituído por um componente biocompatível como o Neobee M-5 (mistura de triglicérides caprílico e cáprico) para poder dar início a formação de nanopartículas, conforme explicado a seguir. PMMA apresenta uma tensão interfacial com a água inferior a tensão interfacial do Neobee M-5 com a água. Desta forma, a morfologia com menor tensão interfacial é aquela onde o
núcleo da gota composta por Neobee M-5 é encapsulado por uma casca de PMMA em contato com a água. monômero e o Neobee M-5 são miscíveis, mas durante o processo de polimerização ocorre separação de fases devido à imiscibilidade do Neobee M-5 e o PMMA. Tendo o MMA uma solubilidade significativa em água (15 g/l), o uso do iniciador hidrofóbico AIBN, com solubilidade em água 0,4g/L, é recomendado para evitar a nucleação secundária de partículas puras de PMMA na fase aquosa (nucleação homogênea). A seguir serão apresentadas as características dos látexes produzidos com a lecetina. Na Tabela 2 é mostrado o tamanho final das partículas e a tensão interfacial entre a fase orgânica e a fase aquosa. Na polimerização em miniemulsão, a tensão interfacial entre as fases dispersa e contínua tem forte efeito na morfologia da partícula, sendo afetada pelo tipo e concentração do surfactante utilizado. Com 0,06g de lecitina, não foi possível formar uma gota pendente na fase aquosa devido a baixa tensão entre as fases orgânica e aquosa. Tabela 2 Analise do tamanho final das nanocápsulas de PMMA com biosurfactante lecitina. Látex Lecitina (g) Lecitina (mm) Amplitude Dp (nm) γ (mn/m) Ultra-som (%) SEM BS 1 0,02 5 20% 841 1,60 BS 2 0,02 5 30% 518 1,60 BS 3 0,02 5 40% 672 1,60 BS 4 0,06 15 20% 820 <1,60 BS 5 0,06 15 30% 609 <1,60 BS 6 0,06 15 40% 567 <1,60 *γ= Tensão interfacial A estabilidade dos látexes foi acompanhada por 100 horas após a polimerização e todos os látex se mantiveram estáveis. Para a formulação definida como padrão BS 3 a estabilidade foi acompanhada por 120 dias sem alteração do tamanho médio das nanocápsulas. Na Figura 3 são apresentadas as morfologias das nanocápsulas de PMMA medidas por TEM. A Figura 3a mostra o encapsulamento do Neobee M-5 com 5mM de lecitina e 20% de amplitude do ultra-som. Com 30% de amplitude do ultra-som ocorreu uma redução do tamanho médio das partículas e as partículas também apresentaram em sua grande maioria uma morfologia totalmente encapsulada. Quando foi utilizado 15 mm de lecitina na amplitude de 40% do ultra-som (Figura 3c) três diferentes morfologias foram encontradas, partículas puras de PMMA, nanocápsulas com Neobee M-5 encapsulado e partículas semi-abertas. Isto provavelmente ocorreu devido a reduzida tensão interfacial entre as fases, o que possibilitou a obtenção de diversas morfologias.
Casca-Núcleo 500 nm 100 nm (a) BS 1 (b) BS 2 Meia-lua Casca-Núcleo PMMA 500 nm (c) BS 6 Figura 3: Morfologia das nanocápsulas de PMMA produzidas com biosurfactante lecitina, analisada por TEM. A Figura 4 apresenta a morfologia das nanocápsulas de PMMA produzidas com biosurfactante lecitina, analisadas por SEM. Nestas análises pode-se verificar a distribuição de tamanho das partículas. Quando foi usado 5 mm (BS 2 ) de lecitina o menor tamanho obtido foi de 518 nm para 30% de amplitude do ultra-som (Tabela 2). Para 15 mm (BS 6 ) de lecitina o menor tamanho obtido na polimerização em miniemulsão foi 567 nm com 40% de amplitude do ultra-som. Em ambas concentrações de lecitina ocorreu uma redução expressiva no tamanho das partículas ao passar de 20% para 30% de amplitude, atingindo um patamar entre 30 e 40% de amplitude. Isto indica que 20% de amplitude de ultra-som não foi suficiente para promover uma alta taxa de quebramento das gotículas.
Dp= 841nm Dp= 518nm 2 μm 2 μm (a) BS 1 (b) BS 2 Dp= 672nm Dp= 820nm 2 μm 2 μm (c) BS 3 (d) BS 4 Dp= 609nm Dp= 567nm 2 μm 2 μm (e) BS 5 (f) BS 6 Figura 4: Morfologia das nanocápsulas de PMMA produzidas com biosurfactante lecitina, analisada por SEM. Conclusões s resultados obtidos neste trabalho mostram que é possível obter nanocápsulas biocompatíveis tipo casca-núcleo estáveis utilizando o composto biocompatível e biodegradável Neobee M-5 como co-estabilizador e não solvente ao polímero. Além disso, o uso do biosurfactante, lecitina, mostrou-se eficaz para estabilização das nanocapsulas, sendo que a concentração de lecitina tem um efeito marcante na morfologia final das partículas.
Agradecimentos Ao CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, ao Departamento de Engenharia Química e Ciência de Materiais da Universidade Wayne (EUA) e ao NSF (CTS 0553537) pelo suporte financeiro. Referências Bibliográficas 1. C. J. McDonald; M. J. Devon Adv. Coll. Interf. Sci. 2002, 99, 181-213. 2. R. M. Blankenship; A. Kowalski, U.S. Patent 4 594, 363, 1986; Chem. Abstr. 1986, 61130. 3. C. J. McDonald; K. J. Bouck; A. B. Chaput; C. J. Stevens Macromolecules 2000, 33, 1593-1605. 4. J.W Kim; Y. G. Joe; K. D. Suh Coll. Polym. Sci., 1999, 277, 252-256. 5. M. kubo; T. Yoshimura, European Patent, 695769, 1996; Chem. Abstr. 1996, 124, 205084. 6. F. Tiarks; K. Landfester; M. Antonietti Langmuir 2001, 17, 908-918. 7. H. Wu; F. Sun; V. Dimonie; A. Klein, US Patent, 5,834,526, 1998; Chem. Abstr. 1998, 129, 344039. 8. M. Antonietti; K. Landfester Prog Polym Sci. 2002, 27, 689. 9. K. Landfester; Macromolecules 2001, 2, 896 936. 10. M. Bathfield; G.C. Hamaide Macromolecular Chemistry and Physics 2005, 206, 2284-2291. 11. M. Changez Colloids and Surfaces B 2006, 50, 18-25. 12. C. Pichot; T.Delair; A. Elaissari J.M. Academic Publishers, Dordrecht, 1997.