Observação experimental da influência do fotoperíodo na atividade da Glutamina Sintetase em extratos foliares. Grupo: Ana Rita Santos, Marco Amaral, Matilde Costa, Rita Fortuna, Susana Barros (P2) Ano letivo: 2012-2013 Docente: Fernanda Fidalgo Biologia - Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Phaseolus vulgaris L.
Glutamato + NH 4+ + ATP glutamina + ADP + Pi Equação 1 - Equação da reação catalisada pela GS. Esquema 1 Fixação e assimilação do azoto.
Esquema 2 Ciclo da GS/GOGAT. ATP + L-glutamato + NH 2 OH y-glutamil hidroxamato + ADP + Pi Equação 2 Equação da reação que permite determinar a atividade biossintética da GS.
Situação A Fotoperíodo normal Planta exposta a um regime normal de fotoperíodo. Situação B Fotoperíodo invertido Planta submetida a um fotoperíodo invertido, estando na obscuridade no período em que A estaria exposta à luz, e vice-versa. Situação C Reexposição Planta submetida a fotoperíodo invertido e posteriormente reexposta a um fotoperíodo normal.
A Extração de Proteínas Solúveis Homogeneização Amostras foliares Tampão de extração PVPP Areia de quartzo Centrifugação 15000x g 15min 4 C Diluição (1:100)
B Determinação da Atividade Enzimática da GS Preparação da mistura Sobrenadante diluído Arsenato Mistura de reação 20min 30 C Incubação Mistura Inicial + Solução de Paragem Cálculo da atividade da GS Absorvância a 500nm Branco: Mistura de Reação + Arsenato + Água Destilada
C Quantificação Proteica pelo Método de Bradford Preparação da cuvete Sobrenadante diluído Reagente de Bradford Repouso 15min Temperatura ambiente Cálculo da concentração proteica Absorvância 595nm Branco: Tampão de Extração + Reagente de Bradford
Condição A - fotoperíodo normal B - fotoperíodo invertido Quantificação enzimática (Abs 500nm) Quantificação proteica (Abs 595nm) 0,053 0,103 0,180 0,190 C - reexposição 0,007 0,226 Tabela 1 Valores obtidos das absorvâncias a 500nm e a 595nm. Considerações experimentais: Volume de extrato = 100µL (diluído 1:100) Tempo de reação = 20min Temperatura 25 C Atividade da GS: Atividade (μmole/min/ml) = Abs500nm 0,4 volume(ml) tempo(min) Equação da reta padrão de proteínas: Teor proteico(µg/ml) = Abs595nm + 0,0089 0,0022 Unidades finais: µkat/mg proteína
A Fotoperíodo normal Atividade = 0, 079 0, 4 0, 1 20 = 0, 09875 µ mole/min ml de sobrenadante Proteína = 0,164+0,0089 0,0022 = 78, 59 µg/ml de sobrenadante 0,09875 µmole/min ------ 1mL de sobrenadante ----- 78,95 µg proteínas x ------------------------------------------- 1000 µg proteínas x = 1,257 µmole/min/mg proteína 1 μkat ------ 60 μmole/min y ------ 1,257 μmole/min 1 katal (kat) = 60 mole/min 1 μkat = 60 μmole/min Resultado final A: y = 0,021 μkat/mg proteína
B Fotoperíodo invertido Atividade = 0, 061 0, 4 0, 1 20 = 0, 07625 µ mole/min ml de sobrenadante Proteína = 0,166+0,0089 0,0022 = 79, 50 µg/ml de sobrenadante 0,07625 µmole/min ------ 1mL de sobrenadante ----- 79,50 µg proteínas x ------------------------------------------- 1000 µg proteínas x = 0,960 µmole/min/mg proteína 1 μkat ------ 60 μmole/min y ------ 0,960 μmole/min 1 katal (kat) = 60 mole/min 1 μkat = 60 μmole/min Resultado final B: y = 0,016 μkat/mg proteína
C Reexposição Atividade = 0, 068 0, 4 0, 1 20 = 0, 08500 µ mole/min ml de sobrenadante Proteína = 0,158+0,0089 0,0022 = 75, 86 µg/ml de sobrenadante 0,08500 µmole/min ------ 1mL de sobrenadante ----- 75,86 µg proteínas x ------------------------------------------- 1000 µg proteínas x = 1,120 µmole/min/mg proteína 1 μkat ------ 60 μmole/min y ------ 1,120 μmole/min 1 katal (kat) = 60 mole/min 1 μkat = 60 μmole/min Resultado final C: y = 0,019 μkat/mg proteína
Atividade da Glutamina Sintetase A C B C B A 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 µkat/mg proteína Gráfico 1 Relação entre as três situações estudadas no trabalho experimental, sendo que A corresponde ao fotoperíodo normal, B ao fotoperíodo invertido e C à reexposição. A > C > B
A atividade da GS é influenciada pelos níveis de radiação solar a que a planta está sujeita. Alterações no fotoperíodo desregulam o relógio biológico da planta levando a uma redução da atividade enzimática. Maior atividade da enzima é registada na situação A (planta sujeita a fotoperíodo normal). Luz tem uma grande importância na assimilação do azoto, pois é determinante no funcionamento do ciclo GS/GOGAT.
Anatomia e Fisiologia Vegetal: Guia de Trabalhos Práticos. Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, Porto, Portugal, 2012/2013; Buchanan, Bob; Gruissem, Wilhelm; Jones, Russel. 2002. Biochemistry & Molecular Biology of Plants, 1st Ed. Taiz, L. & Zeiger, E. 2010. Plant Physiology, 5th Ed. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, Massachusetts, EUA; Web: http://www.oxfordjournals.org/our_journals/exbotj/texbot/issue_05.html, acedido a 30/11/2012 http://www.plantcell.org/content/17/12/3257.full, acedido a 30/11/2012