Desenvolvimento dos linfócitos T e B Dr. Ronei Luciano Mamoni Abril de 2013 Introdução Reconhecimento de PAMPs, DAMPs e Ags RI inata e adaptativa Receptores da RI inata Reconhecimento de PAMPs e DAMPs Receptores da RI adaptativa Reconhecimento de Antígenos Receptores de complemento Receptores scavenger TLRs Receptores de Fc Receptores de manose Dectina 1 Receptor do linfócito B (BCR) Receptor do linfócito T (TCR) NLRs TLRs RIG Especificidade pré determinada no genoma, por genes únicos Especificidade gerada por recombinação somática de diferentes segmentos gênicos 1
Estrutura dos receptores de Linfócitos B e T BCR = IgM ou IgD TCR Cadeia Pesada Cadeia Leve ( ou ) Ig Região variável (ligação com o antígeno) Ig Região Constante CD4 CD8 Região Constante Região variável (ligação com o antígeno) ITAM ITAM Co receptores ITAM ITAM CD3 Linfócito T Estrutura dos receptores de Linfócitos B Anticorpo Imunoglobulina de superfície (BCR) Imunoglobulina (Secretada) Região transmembrana Membrana plasmática Citoplasma Região intracitoplasmática Citoplasma Estrutura dos receptores de Linfócitos T Região transmembrana Ponte dissulfeto Domínio Ig Carboidrato Adaptado de Abbas et al. 2012, 7ª Ed. 2
Estrutura dos receptores de Linfócitos B Espaço extracelular Membrana plasmática Citoplasma Domínio de ativação do imunoreceptor baseado em tirosina (ITAM) Adaptado de Abbas et al. 2012, 7ª Ed. Variabilidade CDR Cadeias leves Variabili dade Adaptado de Abbas et al. 2012, 7ª Ed. Antígeno Antígeno Antígeno Adaptado de Abbas et al. 2012, 7ª Ed. 3
Reconhecimento de antígenos Linfócitos B e T BCR TCR APC Ig Ig CD4 MHC II Antígeno CD3 Antígenos na forma nativa Natureza: proteínas, carboidratos, lipídios, outras Antígenos processados (APCs)+MHC (I ou II) Natureza: proteínas (peptídeos) Maturação dos linfócitos T e B Geração e diferenciação de linfócitos (B e T) MEDULA ÓSSEA Célula tronco pluripotente Pró B Progenitor linfóide comum Pró T NK TIMO 1 folicular de zona marginal Linfócito T (TCR ) Linfócito T (TCR ) 4
Maturação de linfócitos B HSC Fígado fetal Pró B Pré B B imaturo 1 Medula óssea HSC Pró B Pré B B imaturo transicional folicular zona marginal Adaptado de Abbas et al. 2012, 7ª Ed. Timo estrutura Pulmão Coração Timo Cápsula Célula epitelial cortical Trabécula Córtex Epitélio subcapsular Junção córticomedular Medula Corpúsculo de Hassall Timócito Célula epitelial medular Célula dendrítica Macrófago Medula óssea Timo Fígado (feto) Córtex Morte por negligência (sem ou baixa afinidade) positiva e negativa Medula Periferia Positiva Positiva Positiva Negativa Linfócito citotóxico Linfócito auxiliar (TCR ) Morte por negligência (sem ou baixa afinidade) TCR 5
positiva e negativa DN CD4 CD8 Duplo Positivo CD4 Simples Positivo MHC II positiva (reconhecimento de MHC próprio) negativa (reconhecimento de MHC antígenos próprios com alta afinidade) MHC I CD8 Simples Positivo NÃO SIM NÃO Linfócito T maduro Apoptose Linfócito T maduro Apresentação de antígenos próprios Célula epitelial tímica medular AIRE* Ags. tecido específicos Antígenos próprios Autofagocitose MHC I Processamento Ags. MHC I Processamento Ags. MHC II MHC II * AIRE = Regulador de autoimunidade Geração de células regulatórias naturais de células Número d positiva de célula Treg negativa Avidez relativa para antígenos próprios Adaptado de Hsieh et al. Nat. Rev. Immunol. 12:157 167, 2012. 6
Modelos para a geração de célula T regulatórias Modelo instrutivo Reatividade ao próprio intermediária Célula Treg FOXP3 + Timócito Reatividade ao próprio baixa Célula T naive FOXP3 Modelo estocástico Sinal independente de TCR durante o estágio DN Timócito Timócito FOXP3 + Reatividade ao próprio alta Reatividade ao próprio alta Sobrevivência Morte Célula Treg FOXP3 + negativa Adaptado de Hsieh et al. Nat. Rev. Immunol. 12:157 167, 2012. Timócito FOXP3 Expressão dos receptores deantígenos por linfócitos T e B Maturação de linfócitos T CD4 e CD8 CD4 ou CD8 CD4 ou CD8 Pré T TCR TCR Célula tronco Medula óssea Timo Pró T Início da recombinação da cadeia Pré T Expressão de pré-tcr (cadeia + pré- T Proliferação Recombinação da cadeia Duplo Positivo Expressão de TCR (cadeia + cadeia Expressão dos co-receptores Positiva (reconhecimento de MHC próprio) Simples Positivo (imatura) Definição do coreceptor Negativa (reconhecimento de antígenos próprios deleção) Periferia Linfócito T maduro ( naive ) Migração para órgãos linfóides secundários (recirculação) 7
Maturação de linfócitos B Cadeia Leve provisória ( 5 + V-pré-B) Cadeia Pesada Cadeia Pesada Cadeia Leve ou Cadeia Pesada Cadeia Leve ou Célula tronco Medula óssea Pró B Pré B imaturo Início da recombinação da cadeia pesada Expressão de pré-bcr (cadeia pesada + cadeia leve provisória ( 5 + V- pré-b) Proliferação Recombinação da cadeia leve ( ) Expressão de BCR Negativa (reconhecimento de antígenos próprios) deleção ou Edição do receptor recombinação da cadeia leve ( ) Periferia maduro ( naive ) Migração para órgãos linfóides secundários (recirculação) Pré receptores dos linfócitos T e B Pré B receptor Pré T receptor Inibição da recombinação do gene para cadeia pesada Proliferação de pré B Estimulação da recombinação da cadeia leve Inibição da transcrição da cadeia leve provisória Inibição da recombinação do gene para cadeia Proliferação de pré T Estimulação da recombinação da cadeia Expressão de CD4 e CD8 Inibição da transcrição do pt Resumo da maturação dos linfócitos Proliferação Expressão do pré receptor (B/T) Proliferação Expressão do receptor (B/T) Reconhecimento antigênico fraco positiva (T) e negativa (B/T) Linfócito T/B maduro Pré B/T expressam uma das cadeias do receptor de antígeno B/T expressam receptor de antígeno completo positiva Pró B/T Reconhecimento antigênico forte Falha na expressão do pré receptor Falha na expressão do receptor negativa 8
Organização gênica dos receptores delinfócitos B e T Organização gênica do locus da cadeia pesada Cadeia Pesada Cromossomo 14 (n 100) L V H 1 L V H n (n = 23) D H 1 D H n J H enh 5 P P C C C 3 C 1 C 1 Promotor 3 C 22 C 44 C 44 C 22 Extracelular TM IC Organização gênica dos loci das cadeias leves Cromossomo 2 (n 35) L V 1 L V n J enh 5 P P C 3 Cromossomo 22 (n 30) J L V 1 L V n J 1 J 2 J 3 J 7 enh 5 P P C C C C 3 9
Organização gênica dos loci das cadeias do TCR Cromossomo 7 (n 50) L V 1 L V n D 1 J 1 D 2 J 2 enh 5 P P C C 3 Cadeias e Cromossomo 14 (n 45) L V 1 L V n J (n 55) sil enh 5 P P C 3 L V 2 D 1D 2D 3 J enh L V 3 5 P C P 3 Cromossomo 7 (n 5) L V 1 L V n 5 P P J J sil enh C C 3 Processo de recombinação somática Visão geral Recombinação da cadeia pesada do BCR ( cadeia do TCR) V D J enh 5 C C 3 DJ enh 5 C C 3 VDJ enh 5 P C C 3 Transcrição do RNA primário Processamento do RNAm Tradução NH 2 VH DH JH CH TM IC COOH 10
Recombinação da cadeia leve do BCR ( cadeia do TCR) V J enh 5 C L 3 VJ enh 5 P C L 3 Transcrição do RNA primário Processamento do RNAm Tradução NH 2 VL JL CL COOH Estrutura do BCR Região variável (ligação com o antígeno) Cadeia Pesada VHDH JH VH DH JH Cadeia Leve ( ou ) Região Constante CH CH TM TM IC IC Estrutura TCR Região variável (ligação com o antígeno) NH 2 NH 2 V V J D J Linfócito T Região Constante C TM IC COOH C TM IC COOH 11
Processamento alternativo IgM/ IgD RNAm L V D J C AAAA Cadeia pesada IgM Processamento do RNAm L V D J C Sítios de poliadenilação C Processamento do RNAm RNAm L V D J C AAAA Cadeia pesada IgD Recombinação somática DNA célula antes da recombinação V1 Vn D1 Dn J1 Jn C 5 3 Clone 1 Clone 2 Clone 3 Recombinação somática (VDJ), adição de nucleotídeos N e P, Transcrição e processamento do RNA V1 D2 J1 V3 D1 J4 V2 D1 J3 RNAm C AAAA C AAAA C AAAA Nucleotídeos P e N Nucleotídeos P e N Nucleotídeos P e N Processo de recombinação somática Mecanismos moleculares 12
Sequências Sinalizadoras de Recombinação RSS Segmento gênico do receptor de antígeno Sítio de clivagem do DNA RSS Heptâmero Espaçador Nonâmero Adaptado de Schatz e Ji. Nat. Rev. Immunol. 11:251 263, 2011. Sequências Sinalizadoras de Recombinação (RSSs) Regra 12/23 Cadeia pesada Espaçador Espaçador Espaçador Espaçador VH 23 bp 12 bp DH 12 bp 23 bp JH 5 7 9 9 7 7 9 9 7 3 Cadeia leve Cadeia leve V 23 / 12 12 / 23 23 / 23 5 7 12 9 9 23 7 3 Heptâmero CACAGTG V Nonâmero ACAAAAACC 12 / 23 5 7 23 9 9 12 7 3 J J 23 / 12 Recombinação Somática Fase 1 Segmento gênico Ligação e clivagem RAG1, RAG2 e HMGB1 Complexo sinalizador (12) Sinapse e clivagem Complexo sinalizador (23) Complexo pareado Clivagem (formação de grampo) Adaptado de Schatz e Ji. Nat. Rev. Immunol. 11:251 263, 2011. Fase 2 Abertura do grampo, codificação e processamento Junção codificante + Fatores NHEJ e Tdt Junção sinalizadora 13
Recombinação somática 1 Sinapse *Rag 1 e Rag 2 = Genes associados à recombinação 1 e 2 *DNA PK = Proteína quinase dependente de DNA *TdT = terminal deoxinucleotidil transferase 2 Clivagem Rag 1/ Rag 2* Rag 1/ Rag 2 Alça descartada Rag 1/ Rag 2 3 Abertura dos hairpins e adição de N e P nucleotídeos 4 Ligação da fita dupla hairpins Artemis e DNA PK abertura do hairpin TdT* Adição de nucleotídeos N e P nucleotídeos DNA ligase IV Aumento da diversidade Adição de nucleotídeos Sítio de clivagem do hairpin Sítio de clivagem do hairpin Artemis TdT* Adição de nucleotídeos P Adição de nucleotídeos N Adição de nucleotídeos P Nucleotídeos N Nucleotídeos P Nucleotídeos P *TdT = Terminal deoxinucleotidil transferase Nucleotídeos N Resumo da maturação dos linfócitos T Estágio de maturação Proliferação Expressão de RAG Expressão de TdT DNA, RNA do TCR Expressão do TCR Marcadores de superfície Sítio anatômico Resposta a antígenos Célula tronco Pró T DNA germinativo não recombinado c kit + CD44 + CD25 Nenhum c kit + CD44 + CD25 + Pré T Gene cadeia recombinado [V(D)J C]; RNAm cadeia Duplo positiva Célula T imatura (simples positiva) Célula T naive madura Genes cadeias e recombinados [V(D)J C]; RNAm cadeia e Pré T (cadeia +pré T Receptor de membrana c kit+ CD44 CD4 + CD8 + CD4 + CD8 ou CD4 CD8 + CD25 + TCR/CD3 lo TCR/CD3 hi Medula óssea Timo Periferia Nenhuma Nenhuma Nenhuma positiva e negativa Ativação (proliferação e diferenciação 14
Resumo da maturação dos linfócitos B Estágio de maturação Proliferação Expressão de RAG Expressão de TdT DNA, RNA da Ig Expressão da Ig Marcadores de superfície Sítio anatômico Resposta a antígenos Célula tronco Pró B DNA germinativo não recombinado Nenhum CD43 + CD43 + CD19 + CD10 + Nenhuma Nenhum Pré B Célula B imatura Célula B naive madura Gene cadeia Gene cadeia pesada Processamento pesada recombinado [V(D)J alternativo do RNA recombinado C], genes ou (VJ); VDJ C para formar o [V(D)J C]; RNAm e ou RNAm para C ou C RNAm RNAm Receptor Pré B B220 lo CD43 + Medula óssea Nenhuma Nenhuma IgM de membrana ( + cadeia leve ou ) IgM lo CD43 negativa, edição do receptor Periferia IgM ou IgD de membrana IgM hi Ativação (proliferação e diferenciação Comparação diversidade BCR x TCR Figure 4 13 Elemento Imunoglobulina : TCR Segmentos variáveis (V) Segmentos de diversidade (D) Segmentos de Junção (J) Recombinação com adição de nucleotídeos N P Diversidade combinatorial Diversidade juncional Diversidade total Resumo 15
Resumo Recombinação somática BCR Cadeia pesada Cadeia leve DNA não recombinado Recombinação D J Recombinação V D J Recombinação V J DNA recombinado Transcrito 1 ario RNAm Transcrição Processamento do RNAm Tradução Transcrição Processamento do RNAm Tradução Proteína Proteína madura Processamento e glicosilação da proteína Processamento da proteína Montagem Resumo Recombinação somática TCR DNA não recombinado Recombinação D J Recombinação V J Recombinação V D J DNA recombinado Transcrito 1 ario Transcrição Processamento do RNA Transcrição Processamento do RNA RNAm Proteína Proteína madura Tradução Processamento e glicosilação da proteína Tradução Processamento da proteína Montagem Doenças associadas a falhas no desenvolvimento delinfócitos 16
Doenças associadas a defeitos no desenvolvimento de linfócitos T IMUNODEFICIÊNCIAS: Imunodeficiência severa combinada (SCID) ligada ao X mutação cadeia gama comum dos receptores de citocinas (IL7) Síndrome de DiGeorge Aplasia tímica congênita Síndrome de Omenn defeito em enzimas associadas com a recombinação somática (Rag1 e Rag2) SCID ligada a deficiência de Adenosina Deaminase Deficiência do linfócito nú deficiência de MHC de Classe I e de Classe II AUTOIMUNIDADE: Desregulação Imune, Poliendocrinopatia, Enteropatia ligada ao X (IPEX) Mutação Foxp3 Síndrome Linfoproliferativa Autoimune (ALPS) Mutação mecanismos de apoptose 17