Larvae Exsheathment Inhibition Assay

INCT: Informação Genético-Sanitária da Pecuária Brasileira SÉRIE TÉCNICA: DOENÇAS Disponível em www.animal.unb.br em 14/03/2011 Larvae Exsheathment Inhibition Assay Edgard Franco Gomes 1,2, Helder Louvandini 2, Cristiano Barros de Melo 2, Hervé Hoste 3, Concepta McManus 4 1 Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, Brasília, DF, 70910-900 2 CENA, Universiade de São Paulo, Av. Centenário, 303 CEP: 13400-970, Piracicaba, São Paulo - Brasil 3 INRA/ENVT, Unite Mixte de Interactions, 23 Chemin de Capelles, 31076, Toulouse, Cedex, France 4 Departmento de Zootecnia, Av. Bento Gonçalves, 7712 - Caixa Postal 15100 - CEP 91540-000 O teste LEIA ( Larvae Exsheathment Inhibition Assay ) (1) visa testar a eficácia de diferentes moléculas (compostos purificados) ou Extratos de Plantas (EP) quanto a sua eficácia em impedir o desembainhamento de larvas infectantes (L3). Para tal, são utilizadas larvas L3 de Haemonchus contortus ou de Trichostrongylus colubriformis. Para a realização do teste, são necessárias larvas L 3 (obtidas através de coprocultura), tubos de ensaio de 15 ml, microtubos de polietileno de 2 ml, solução tampão fosfato-salino (PBS), lâminas de vidro, lamínulas, metanol e solução de hipoclorito de sódio a 2%. Utilizam-se compostos ou EP em que se suspeita de sua ação anti-helmíntica. 1

O teste consiste no preparo de quatro repetições com diferentes concentrações dos compostos ou dos EP. No caso dos compostos, as concentrações são: 0,001 M, 0,0005 M, 0,00025 M e 0,000125 M. No caso de EP, são feitas as seguintes concentrações: 1200 µg/ml, 600 µg/ml, 300 µg/ml e 150 µg/ml. Além destes, é necessário um controle negativo contendo apenas solução de PBS para verificar se as larvas estão desembainhando normalmente. Deve-se conhecer a Massa Molar de cada composto para o preparo de Solução Estoque (SE). A SE tem concentração igual ao dobro da maior concentração desejada, ou seja, 0,002 M (no caso dos compostos) e 2400 µg/ml (no caso de EP). São necessários 2 ml de SE para que o teste seja rodado. Assim, através de diluições posteriores, podem-se obter todas as concentrações desejadas. Em cada repetição e também no controle, a proporção solução testada:solução de larvas foi de 1:1. Os cálculos para o preparo da SE devem seguir os seguintes passos: calcular a massa de molar composto necessária para o preparo de solução com concentração 0,002 M, ou a massa de EP necessária para concentração de 2400 µg/ml, utilizando uma balança de precisão; calcular o volume de PBS que se deve adicionar à quantidade de massa do passo anterior; calcular o valor de metanol que será utilizado, sendo que este será de 2% do volume de PBS calculado anteriormente, ou 200 µl de metanol para cada 10 ml de PBS; calcular o novo valor de volume de PBS a ser adicionado, diminuindo do valor previamente obtido o valor calculado para o metanol. O Exemplo 1 mostra o cálculo para o composto Quercetagetin. Exemplo 1. Cálculos para o preparo de 2 ml de Solução Estoque a 0,002 M do composto Quercetagetin. 2

Massa Molar: 318,24 g/mol 318,24 g ------- 1 M X ----------- 0,002 M X = 0,63648 g (para 1 L de solução); para 1 ml... 0,62648 g ------- 1000 ml X ------------ 1 ml X = 0,00062648 g ou 0,62648 mg; Para 2 ml de solução... 0,62648 mg x 2 = 1,27 mg deve-se adicionar 2 ml de PBS para essa quantidade de composto. Entretanto, mesmo se utilizando balança de precisão, é difícil mensurar exatamente o referido valor. Iremos supor que o valor mensurado foi 1,5 mg de Quercetagetin. Deve-se, portanto, corrigir o valor de PBS que irá se utilizar, visando manter a concentração de 0,002 M. 1,27 mg ------- 2 ml de PBS 1,5 mg --------- X X = 2,36 ml de PBS; Deve-se agora calcular o volume de Metanol que será adicionado... 200 µl de Metanol ------- 10 ml de PBS X --------------------- 2,36 ml de PBS X = 47,2 µl de Metanol; Deve-se nesse momento calcular o Novo Volume de PBS (NVPBS) que deverá ser adicionado, visando manter a solução com concentração igual a 0,002 M. NVPBS = Volume 0 PBS Volume de Metanol NVPBS Quercetagetin = 2,36 ml PBS 0,0472 ml Metanol = 2,3128 ml; 3

Para o preparo da SE a 0,002 M ou 2400 µg/ml, deve-se adicionar ao tubo de ensaio o composto a ser analisado, pesado previamente em balança de precisão. Em seguida, adicionar o metanol na proporção de 2 µl de metanol para cada 100 µl de PBS, fazendo as devidas correções matemáticas com relação à massa do composto, visando manter a concentração final da solução em 0,002 M ou 2400 µg/ml. Agitar o tubo, visando diluir o composto no metanol. Em seguida, adicionar o volume de PBS calculado previamente. De posse da SE pronta, deve-se separar cinco tubos de ensaio de 15 ml e devidamente identificado-los (Figura 1). Nos tubos destinados às concentrações de 0,001 M ou 1200 µg/ml e 0,0005 M ou 600 µg/ml devese adicionar 1 ml de SE (Figura 2 - B). O tubo de maior concentração deve ser reservado por um tempo. Ao tubo de concentração de 0,0005 M ou 600 µg/ml deve-se adicionar 1 ml de PBS e agitar o conteúdo (Figura 2 - C). Um mililitro dessa nova solução deve ser adicionado ao tubo destinado à concentração de 0,00025 M ou 300 µg/ml (Figura 2 - D). Nesse tubo, adicionar 1 ml de PBS e agitar o conteúdo (Figura 2 - E). Realizar o mesmo procedimento, retirando 1 ml da nova solução e o adicionar ao tubo destinado à 0,000125 M ou 150 µg/ml (Figura 2 - F). Adicionar 1 ml de PBS ao tubo destinado a concentração de 0,000125 M ou 150µg/mL (Figura 2 - G). Desse último tubo, após agitação, retirar 1 ml de solução e descartar (Figura 2 - H). Ao tubo controle, adicionar apenas 1 ml de PBS (Figura 2 - I). 4

Figura 1 - Tubos de ensaio com diferentes concentrações e grupo controle. Fonte: Arquivo Pessoal. 5

Figura 2 Desenho esquemático para obtenção das diluições. (A) Cinco tubos vazios. (B) Adição de 1 ml de Solução Estoque aos dois primeiros tubos. (C) Adição de 1 ml de PBS ao segundo tubo. (D) Passagem de 1 ml de solução do segundo tubo para o terceiro tubo. (E) Adição de 1 ml de PBS ao terceiro tubo. (F) Passagem de 1 ml de solução do terceiro para o quarto tubo. (G) Adição de 1 ml de PBS ao quarto tubo. (H) Descarte de 1 ml de solução do quarto tubo. (I) Adição de 1 ml de PBS ao quinto tubo. 6

(J) Adição de 1 ml de Solução de Larvas à todos os tubos. Fonte: Arquivo Pessoal. A cada tubo deve ser adicionado 1 ml de solução de L3 com concentração de 1000 larvas/ml (Figura 2 - J). Assim, por conta da adição de 1 ml de solução de larvas, todos os tubos atingem a concentração desejada (0,001 M, 0,0005 M, 0,00025 M e 0,000125 M). Assim, cada tubo de ensaio contém 2 ml de solução. Os tubos devem seguir para estufa a 23 o C por três horas. A cada hora passada, os tubos devem ser agitados. Após três horas passadas, os tubos devem ser submetidos à centrifugação e lavagem. Cada centrifugação é feita a 1000 RPM e 20 o C, com duração de três minutos cada. Nas lavagens, retirar 1 ml do sobrenadante de cada tubo e repor com 1 ml de PBS. Fazer uma centrifugação intercalada por uma lavagem, três vezes. Depois, centrifugar uma quarta e apenas retirar 1 ml do sobrenadante de cada tubo de ensaio, sem adicionar PBS. Assim, cada tubo contém 1 ml de Solução Final (SF). Separar quatro microtubos de polietileno para cada concentração a ser analisada. Em cada um deles, foi adicionar 200 µl de SF de sua respectiva concentração e foram devidamente identificados (Figura 3). Figura 3 Microtubos de polietileno separados para cada concentração de Solução Final. Fonte: Arquivo Pessoal. 7

Após isso, preparar a Solução de Desembainhamento (SD). Esta consiste na adição de 40 µl de hipoclorito de sódio à 2% em 5,96 ml de PBS (1:149). A função da SD é propulsionar o desembainhamento artificial das L3. Para cada repetição de cada concentração realizar quatro leituras ao microscópio óptico, com intervalos de 20 minutos marcados por cronômetro, totalizando assim uma hora de duração do teste. Para se fazer a leitura, as lâminas de vidro devem ser organizadas e devidamente identificadas (Figura 4); para a primeira leitura, colocar 50 µl de SF em lâmina de vidro, colocar a lamínula e, por cerca de dois segundos, submeter a lamina a estresse térmico, com auxílio de palito de fósforo, na parte inferior da mesma. Esse procedimento visa que as larvas fiquem imóveis (Figura 4). Figura 4 Lâminas de vidro preparadas para leitura no microscópio óptico. As lâminas de cor preta passaram por estresse térmico. Fonte: Arquivo Pessoal. Logo após ter retirar a primeira amostra, adicionar 150 µl de SD a cada microtubo, visando assim iniciar o desembainhamento artificial. As três leituras seguintes seguem de modo igual à primeira: colocar 50 µl da 8

nova solução (SF com 150 µl de SD) nas lâminas de vidro, em seguida as lamínulas e o estresse térmico. As leituras são realizadas em microscópio óptico à magnitude 10x. A cada leitura e com auxílio do contador, identificar e diferenciar as larvas L3 (Figura 5) das larvas L4 (Figura 6). Os valores para cada categoria devem ser anotados em tabelas para posterior tabulação e análise. Figura 5 Larva L3 de Haemonchus contortus, com a respectiva bainha revestindo-a. Microscópio óptico à magnitude 10x. Fonte: Arquivo Pessoal. Figura 6 Larva L4 de Haemonchus contortus, se desembainhando, com a bainha na parte direita da figura. Microscópio óptico à magnitude 10x. Fonte: Arquivo Pessoal. 9

Bibliografia: JACKSON, F. and HOSTE, H. In Vitro Methods for the Primary Screening of Plant Products for Direct Activity Against Ruminant Gastrointestinal Nematodes. P. E. VERCOE, et al. in vitro screening of plant resources for extra-nutritional attributes in ruminants. s.l. : Springer, 2010, 3, pp. 25-45. 10