CITOCINAS E LINFÓCITOS T

AULA DESGRAVADA DE IMUNOLOGIA CITOCINAS E LINFÓCITOS T 23-11-2006 Leccionada por Prof. L. Taborda Barata Esta aula está organizada por slides (convém obviamente que a leiam com os slides ao lado). SLIDE 2 Vamos começar com uma historieta... SLIDE 3 Era uma vez uma criança do sexo masculino que a partir do primeiro mês de idade começou a ter atraso de desenvolvimento estatoponderal, isto é, estava a crescer menos do que aquilo que era esperado. No segundo mês fez uma otite infecciosa com uma resposta muito lenta a amoxicilina e dois dias depois de suspensão da antibioterapia foi internada no serviço de urgência devido a síndrome dispneico muito exuberante. SLIDE 4 De facto, a criança tinha uma pneumonia bilateral por Pneumocystis carinii. Este microorganismo é um bicharoco que não presta para nada, é um agente infeccioso oportunista, ou seja, esta criança de certeza que tinha uma imunodeficiência (primária ou adquirida). SLIDE 5 Depois de ter sido resolvido o problema respiratório teve febre elevada devido a S.aureus e desta vez houve boa resposta à antibioterapia com amoxicilina e ác. clavulânico. Logo a seguir teve uma gastroenterite aguda associada a uma otite media aguda, com boa resposta ao cotrimoxazol. Aos quatro meses teve varicela, sem complicações orgânicas e resposta lenta ao acyclovir. Aos seis meses teve candidíase mucocutânea crónica. Tantos episódios de infecção em tão pouco tempo levaram a pensar que alguma coisa não estava bem. SLIDE 6 Antecedentes pessoais e familiares: Mãe com história de abortos de repetição: as duas primeiras gestações resultaram em aborto espontâneo; o terceiro filho faleceu aos dez meses por infecções múltiplas; este menino (IV gestação) não apresentou complicações neonatais (só a partir do segundo mês começaram a surgir estes problemas). Dois tios faleceram durante a infância também por infecções recorrentes. 1

No que diz respeito aos exames laboratoriais, os hemogramas revelaram franca leucopenia linfopénica (à custa de linfócitos), ausência de anemia ou trombocitopenia. Os poucos monócitos presentes eram vacuolizados e os linfócitos atípicos. As provas bioquímicas não apresentaram alterações e o doseamento de anticorpos anti-hiv, que é mandatório pedir nestes casos, foi negativo. SLIDE 8 As proteínas do complemento estavam normais, a percentagem de células NK no sangue estava diminuída (1%). Os estudos funcionais revelaram citólise anormal (as células para além de diminuídas funcionavam mal). SLIDE 9 No que diz respeito aos linfócitos B, todos os isotipos de imunoglobulinas séricas estavam baixas, particularmente a IgG. Este resultado não deve ser muito valorizado uma vez que nos primeiros meses de vida há uma diminuição das Igs séricas: o recémnascido tem no seu sangue Igs maternas e só começa a produzir as suas próprias Igs alguns meses após o nascimento. Logo, se fizermos análises ao sangue do bebé nesse período de transição é normal observar um défice de Igs. Os linfócitos B no sangue periférico não apresentaram alterações significativas no número ou percentagem. Contudo, após activação, não havia aumento da expressão de moléculas de activação (CD23) e HLA-DR como era de esperar, o que indica um défice funcional. SLIDE 10 Os testes linfocitários T revelaram alterações impressionantes: linfócitos T CD3+ (totais) = 3 % (extremamente baixos), linfócitos T CD4+ = 1,9 % ( ) linfócitos T CD8+ = 0.9 % ( ). O facto de todos os linfócitos T estarem bastante diminuídos é uma situação muito problemática. SLIDE 11 Em resumo: linfopenia T acentuada (T-), marcada diminuição de células NK (NK-) e número de linfócitos B normal (B+). SLIDE 12 Em termos de estudos funcionais dos linfócitos T verificou-se que quando eles eram expostos a mitogénios como a PHA (fitohemoglutinina) havia uma proliferação normal. Quando expostos a anticorpos anti-cd3, a resposta também era normal o que exclui a hipótese de um problema de transdução de sinal via TCR. Mas quando se expunham as células à IL-2 elas não proliferavam!!! SLIDE 13 Diagnóstico: SCID (imunodeficiência severa combinada) T-B+NK-ligada ao cromossoma X. O que acontece nesta doença é uma mutação numa cadeia (gama) do receptor para a IL-2. 2

Esta cadeia é comum para outros receptores de interleucinas (IL4, IL7, IL9, IL15, IL21) e é crucial para a transdução de sinal quando há activação destes receptores. Há vários tipos de mutações diferentes desta cadeia: umas aceleram o seu turn-over, o que se traduz numa disfunção do receptor; outras não permitem a inserção da cadeia no complexo receptor, sendo o resultado o mesmo. O facto das mutações da cadeia gama originarem um quadro tão severo pode indicar que as interleucinas que se ligam a esses receptores são importantíssimas para a diferenciação e proliferação das células T. Vamos ver até que ponto isso é verdade ou não: vamos falar um bocadinho de ontogenia T. ONTOGENIA T SLIDE 16 As células T são cruciais dentro do sistema imunitário. É muito raro termos uma imunodeficiência que envolva células T sem que haja também envolvimento de outras células, nomeadamente células B. Sabemos que a diferenciação de células T ocorre no timo (pode ocorrer na periferia mas é essencialmente no timo) onde os precursores interagem com diversas citocinas. Uma delas é a IL-7, cujo receptor é um daqueles que tem a cadeia gama comum. SLIDE 17 Experiência: isolaram-se timócitos fetais que foram cultivados em meio rico em várias interleucinas: IL7, IL6 ou IL2. Verificou-se que a estimulação com IL7 resultava numa grande proliferação das células (para cerca de 3 vezes mais). A IL2 também tinha esse efeito, mas menos marcado e a IL6 não tinha efeito. Durante a ontogenia T a IL7 é fulcral para que mais tarde possamos ter respostas T competentes e eficazes. SLIDE 18 Outra experiência A IL2 induz a proliferação dos timócitos previamente activados. Se adicionarmos IL4 esta proliferação é muito mais exuberante e quando adicionamos ambas, a proliferação é ainda maior. In vivo o que acontece é que os timócitos são previamente activados pela IL7 e depois proliferam na presença de IL4 e IL2. SLIDE 19 Na realidade, os próprios timócitos podem ser uma fonte de IL2 e IL4. Temos aqui uma história muito bonita em que o timócito imaturo é estimulado pela IL7, fica todo contente e começa por isso a sintetizar IL2. Esta vai actuar autocrinamente, juntamente com IL2 produzida pelas células do parênquima tímico (células estreladas). Ocorre assim estimulação da proliferação e maturação dos timócitos e ainda aumento do número de receptores da IL2 (com consequente aumento da capacidade de resposta a esta citocina estimulatória). 3

CITOCINAS E FISIOLOGIA DAS CÉLULAS T SLIDE 21 Temos agora as células que já maturaram e vão para a periferia (sangue e tecidos periféricos). A noção que vocês já devem ter é que o linfócito T para realmente ser o grande orquestrador e vigilante do sistema imunitário tem de circular. A circulação ocorre através da linfa e do sangue: do sangue vai para os tecidos, daqui vai pela linfa e por fim volta ao sangue. Há perfis de circulação diferentes consoante o grau de maturação da célula (se ela já contactou ou não com o antigénio). Esta circulação depende muito de citocinas, algumas das quais muito importantes na migração selectiva para determinado órgão. E dentro da grande família das citocinas as mais importantes são as de baixo peso molecular e que têm propriedades quimiotácticas as quimiocinas. SLIDE 22 Migração e localização de linfócitos T nos gânglios linfáticos. Uma vez em circulação, para conseguir atravessar as vénulas de endotélio alto dos gânglios linfáticos e atingir o paracórtex, os linfócitos têm de expressar CCR7. Uma vez na zona paracortical do gânglio, os linfócitos vão interagir com células da matriz que lhes vão enviar sinais que lhes permitem migrar até à zona B do gânglio (cortéx). Depois de receberem este sinal vão mudar os seus receptores para quimiocinas e passam a expressar maior quantidade de CXCR5. E a grande importância deste receptor é que permite interagir com uma quimiocina existente em grande quantidade nas zonas B, o CXCL13. Depois de receber o sinal do CXCL13 ele vai-se ligar de uma forma mais eficaz às células B e enviar-lhes sinais de activação. Resumindo: os sinais solúveis (quimiocinas) recebidos pelos linfócitos T, vão definir o seu perfil de migração no gânglio linfático e ainda modular a interacção com células B. ACTIVAÇÃO DAS CÉLULAS T SLIDE 26 Se fizermos um corte na mão e formos infectados por algum microorganismo, as células apresentadoras de antigénio (APCs) da pele, principalmente macrófagos e células dendríticas (DCs), vão processar os antigénios e recircular pela linfa até aos gânglios linfáticos onde vão interagir muito intimamente com as células T (sinapse imunológica). SLIDE 27 Nesta sinapse, para além da correcta apresentação antigénica com o sinal 1 e sinal 2, há também produção de citocinas quer pelo linfócito T quer pela APC. Este é o único contexto em que o linfócito T liberta pequenas quantidades de citocinas (a célula T não costuma acumular citocinas em grânulos). SLIDE 28 Agora a célula T começa a aumentar os receptores para algumas citocinas, p.e. o receptor para a IL1. Por outro lado as APCs, nomeadamente o macrófago, são 4

excelentes produtoras de IL1. A IL1 é crucial para amplificar o sinal resultante deste contacto célula a célula. Agora o linfócito T está nas suas sete quintas: recebeu dois sinais estimulatórios e foi banhado pela IL1. Isso vai permitir a activação da transcrição de outras citocinas como a IL2 (já vimos que ela era muito importante na ontogenia e veremos agora a sua importância para os linfócitos T maduros existentes na periferia). SLIDE 29 Então o que é que acontece? O linfócito T aumenta a produção de IL2 ao mesmo tempo que aumenta o número de receptores para ela. Assim, a IL2 actuando autocrinamente provoca a proliferação clonal do linfócito T e indução de outras citocinas e receptores para as mesmas (modificação fenotípica). SLIDE 30 Em resumo, a IL2: É secretada particularmente por células T activadas É um factor autócrino para células T CD4+ e CD8+ É crucial para o desenvolvimento de células T CD8+ citolíticas Influencia a actividade de células B e de células NK Induz a formação de células LAK lymphokine-activated killer a partir de células NK. SLIDE 31 Vimos (no slide anterior) que a IL2 é importante para o desenvolvimento de células CD8+ citolíticas (CTL). Se elas forem já maduras, ou seja, se já tiverem contactado alguma vez com o antigénio, quando contactam novamente são capazes de produzir IL2 que actua autocrinamente levando à sua expansão clonal. SLIDE 32 No entanto, se for uma CTL naive (ainda com poucas granzimas e perforinas), não é capaz de produzir essa citocina em quantidades suficientes, necessitando que ela seja produzida pelos linfócitos T CD4+ (principalmente Th1) que estejam na vizinhança e que respondam a uma apresentação cruzada. Sob a influência desta citocina, os CTL naive vão amadurecer conseguindo eles próprios produzir IL2. SLIDE 33 A IL15 (reparem que é uma das citocinas cujo receptor tem a cadeia gama): É crucial para a diferenciação intra-tímica de células NK (como vimos naquele caso clínico não havia células NK ) É factor de crescimento para células NK Induz a proliferação de células T (principalmente citolíticas) É produzida por células epiteliais e por monócitos. SLIDE 34 Como vimos anteriormente, as células T após entrarem no gânglio linfático vão ser activados e chegar até à zona B onde interactuam com linfócitos B. Através da secreção 5

de citocinas, eles influenciam a actividade das segundas e provocam a sua activação e diferenciação em linfócitos B memória ou em plasmócitos, grandes produtores de IGs. SLIDE 35 E mais, estas citocinas podem mudar o isotipo das células B. Esta mudança só ocorre se houver interacção com as células T e depende das citocinas produzidas durante essa interacção. A Ig que o linfócito B produz mais facilmente devido à topografia génica é a IgM. A manutenção da programação IgM é feita pela IL2 e no caso de estarmos na presença de antigénios timo-independepentes também é importante a IL4 e a IL5. A IL4 e a IL13 são importantes para a indução da IgE e são ajudadas pela IL9. A IL9 não ajuda a mudar o isotipo mas ajuda as células a proliferar e a aumentar a produção de IgE. A IL5 e o TGF-beta são importantes na mudança de isotipo para IgA. O IFN-gama e a IL2 são factores de mudança para IgG. Em ratinhos a IL6 também contribuiu para a mudança de isotipo para IgG e a IL4 para alguns subtipos de IgG (IgG4 no adulto). SLIDE 36 Há outras situações que dependem das citocinas como por exemplo a activação de macrófagos. O IFN-gama é o grande amigalhaço dos macrófagos porque aumenta a sua actividade fagocítica, microbicida e apresentadora antigénica. O TNF-alfa é importante para a maturação e activação dos neutrófilos. DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS T SLIDE 38 Temos estado sempre a falar de células T maduras do sangue periférico que se vão diferenciar em certos contextos, p.e. nas alergias. Nas pessoas com alergias há uma mudança focada e concentrada para um perfil de citocinas denominado perfil Th2. Isto deve-se a um contacto prolongado com o antigénio e a um desequilíbrio na aprensentação antigénica que vão favorecer a diferenciação Th2. Estas células são produtoras principalmente de IL4 e IL5. A primeira vai induzir a mudança de isotipo para IgE; a IL5 é a grande amigalhaça dos eosinófilos. Atenção que as células Th2 também produzem IL13, IL9, IL21 e IL31. No ratinho também há produção de IL10 mas apenas pelas Th2. Nos humanos, tanto as Th2 como as Th1 produzem IL10 mas as primeiras produzem um bocadinho mais. SLIDE 39 Sob a influência da IL4, se uma célula Th0 for estimulada repetidamente diferencia-se em Th2. Pelo contrário, sob a influência do IFN-gama e alfa, IL12 e IL18 diferencia-se em Th1. Aquilo que marca o perfil Th1 é a produção de IFN-gama e a IL2. A IL21 está presente tanto no perfil Th1 como Th2, no entanto, sobre isto ainda se estão a efectuar investigações. Também as células T CD8+ podem exibir um perfil Tc1 ou Tc2 analogamente ao que acontece com as células T CD4+. 6

/41 Nesta imagem temos células Th1 do lado esquerdo e Th2 à direita. Vemos do lado direito que o STAT6 vai activar o gene GATA3 e este vai permitir o desenvolvimento Th2. E através de mediadores chamados SOCS 3 vai inibir a diferenciação de células Th1. Ou seja, a célula que seja estimulada desta maneira (isto é, na presença de IL4) estimula GATA3 e já não tem possibilidade de se diferenciar em Th1. No lado esquerdo vemos que uma célula que seja estimulada via Il12 e IFN estimula STAT1 e STAT4; estes estimulam Tbet que marca as células para se diferenciarem em Th1. Simultaneamente a diferenciação no sentido Th2 é inibida através de SOCS1. SLIDE 42 Portanto, células Th1 vão inibir a diferenciação de células Th2 e vice-versa não só pelos SOCS mas também pela produção de citocinas. A IL4 é crucial para inibir as respostas Th1 e o IFN-gama e IL12 para inibir as repostas Th2. Não se esqueçam que as células Th1 são importantíssimas para as respostas de hipersensibilidade retardada em que há muito IFN-gama, factor importante para os macrófagos. As células Th2 não são úteis nestas situações. Servem é para activar eosinófilos por exemplo. SLIDE 43 A IL23 é crucial para a diferenciação de umas células fascinantes: as células Th produtoras de IL17. SLIDE 44/45 Passando agora ao perfil Th2... Experiência: injectando alergéneos na pele, ocorre um processo de sensibilidade retardada. SLIDE 46 Esta é uma resposta inflamatória alérgica, cheia de células com estes pontos pretos: são células positivas para o RNAm da IL4 e IL5. Se formos ver ao longo da resposta inflamatória da célula, vemos essencialmente produção de IL4, IL5 e muito pouca IL2 e IFN. Nas alergias da pele, da mucosa dos brônquios (asma brônquica), e da mucosa nasal (rinite alérgica) esta resposta com IL4 e IL5, tipicamente Th2, é crucial. Estes linfócitos T atraem mastócitos e eosinófilos. SLIDE 49 A IL4: Pode actuar in vivo como indutora da proliferação de células T Induz a expressão de VCAM-1 (CD106) nas células endoteliais. As células que interagem melhor com a VCAM são linfócitos T memória (principalmente Th2) e eosinófilos. Pode induzir a expressão de CCR3 nas células T que é um receptor importante nas reacções alérgicas (em que está presente a quimiocina correspondente a este receptor) Induz a mudança de isotipo para IgE 7

A IL5: É moderadamente quimiotáctica para eosinófilos Aumenta a adesão de eosinófilos a células endoteliais Promove a diferenciação terminal de eosinófilos Prepara os eosinófilos para uma actividade funcional aumentada Prolonga a sobrevivência de eosinófilos (factor anti-apoptótico) SLIDE 51 Falo aqui sobre a IL-9 porque esta colabora com a IL-5 na maturação de eosinófilos. A IL9: É um factor de crescimento e activação para mastócitos É um factor de crescimento para linfócitos T, mesmo na ausência de antigénios Aumenta a mudança de isotipo induzida pela IL-4 SLIDE 52 A IL13: Induz proliferação de células B mas não de células T Induz a expressão de VCAM-1 (CD106) nas células endoteliais Induz a mudança de isotipo para IgE Tem actividade inibitória sobre macrófagos (é um antagonista do IFN) SLIDE 55 O perfil Th1 é marcado essencialmente pela produção de IL2 e IFN-gama e também de IL12 e de IL18. SLIDE 56 Certas patologias estão associadas preferencialmente ao perfil Th1 como por exemplo a lepra tuberculóide. (na lepra lepromatosa é mais importante o perfil Th2) SLIDE 57/58 As células Th1 têm potencial citolítico e para além disso são as grandes indutoras de macrófagos porque produzem IFN-gama. Estes, após serem activados vão produzir IL- 12 que num mecanismo de feed-back, vai induzir a diferenciação de novas células T naive no sentido Th1. SLIDE 59 O IFN-gama: Aumenta a quantidade de receptores que facilitam a opsonização de microorganismos Optimiza a função APC de várias células Aumenta a expressão de MHC I e II Aumenta o potencial microbicida de macrófagos (estimula a produção de radicais de oxigénio e oxido nítrico) 8

Aumenta a expressão de moléculas co-acessórias (CD80, CD86). Inibe a diferenciação no sentido Th2 SLIDE 60 A IL12: Induz a produção de IFN-gama em células T e células NK Contribui para o aumento do potencial CTL de células T e NK É importante para a diferenciação Th1 Partilha acções com as citocinas IL23 e IL27 MIGRAÇÃO DE CÉLULAS T SLIDE 62 As células T maduras em alguns casos têm de migrar para os tecidos. Tal como acontece no gânglio linfático, essa migração depende de citocinas e de quimiocinas. SLIDE 63 As células Th1 e Th2 têm diferentes receptores para quimiocinas. As Th2 expressam CCR3, CCR4 e CCR8 (receptores para quimiocinas que estão presentes nas reacções alérgicas). As células Th1 respondem menos bem a estas quimiocinas, pois expressam preferencialmente outros receptores de quimiocinas: CXCR3 e CCR5. SLIDE 64 Estas células marcadas a branco expressam RNAm para RANTES (Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted também chamado CCL5: é uma citocina quimiotáctica para células T memória e monócitos que se liga a CCR5). Vemos que esta expressão coincide com a expressão de CD3 e CD4, ou seja, quando migram para os tecidos as células T CD4+ vão expressar novas quimiocinas (p.e. RANTES). SLIDE 65 Agora vamos falar de celular T reguladoras, CD4+CD25+. Algumas produzem níveis elevados de IL-10 e outras de TGF-beta. SLIDE 66 A IL-10 é o grande XANAX do sistema imune. É produzida por linfócitos T reguladores, células Th0, Th1 e Th2 Também é produzida por outras células (células B, macrófagos, etc) Inibe as funções macrofágicas (incluindo a capacidade de APC), ou seja, tem uma função contrária ao IFN-gama Através dos efeitos directos nos macrófagos, inibe indirectamente funções linfocitárias Também inibe directamente a proliferação de células T (e B) 9

O TGF-beta: Inibe a proliferação de células T (também de células B e células NK) Inibe funções de macrófagos Tem um papel na remodelação da matriz extracelular Induz a mudança de isotipo para IgA SLIDE 68 Em resumo: Citocinas como IL7, IL2 e IL4 são importantes para a ontogenia de células T se não tivermos IL7 não temos células T!!! Na apresentação antigénica, a IL1 activa os linfócitos T. A IL2 é crucial para: o a proliferação de células T CD4+ e CD8+. o a diferenciação de células T CD8+ em CTL. Padrões de síntese de citocinas permitem dividir células T em células Th1 / Tc1 e Th2 / Tc2. Em situações patológicas em que há estimulação antigénica repetida ou uma incorrecta apresentação antigénica, as citocinas influenciam a diferenciação das células Th0 em Th1 ou Th2 e também podem influenciar as células citolíticas no sentido Tc1 ou Tc2. Citocinas produzidas por linfócitos T actuam sobre várias outras células (eósinofilos IL5; linfócitos T - TGF beta e TNF-alfa; APC; células B na mudança de isótipo). Interferir na acção de citocinas sobre e a partir de células T pode ter interesse terapêutico (por exemplo na artrite reumatóide e nas doenças alérgicas). Bom estudo e Feliz Natal!!!! Aula desgravada por Telma Santos, Vânia Teixeira e Yolanda Martins, da fantástica turma 10!!! 10