Isolamento Viral em Cultivo Celular Adriana Candido Rodrigues
Vírus: Parasitas intracelulares obrigatórios Célula viva para replicação Sistemas Celulares Animais de Laboratório Ovos Embrionados Cultura de Células
Importância Animais Cultura Celular Vantagens: Simples Confiável Desvantagens: Tempo Vantagens: Espaço Custo Desvantagem: Menor sensibilidade Sensível Espaço Ética Custo
A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. Rapidez no Diagnóstico Viável economicamente. É um método sensível, tendo a capacidade de detectar pequenas concentrações do vírus.
Utilidade da cultura celular Diagnóstico e Isolamento Produção de vacinas Biologia molecular do vírus, mecanismo de infecção e patogenia Isolar grande numero de vírus Produção de antígenos virais Realizar testes de neutralização Determinação de concentrações virais
N2A Neuroblastoma Murino Origem: American Type Culture Collection, Rockville Md. (ATCC) BHK-21 Rim de Camundongo Recém Nascido Origem: American Type Culture Collection, Rockville Md. (ATCC) Fonte :Instituto Pasteur
Vantagens da Célula Universalidade Sensibilidade Custo Espaço Físico Caráter Ético Simplicidade Desvantagens da Célula Contaminação Toxidade
1913 Levaditi - primeira descrição. 1956 Vieuchange et al. Relatou a sensibilidade de culturas celulares primárias de células de rim de camundongo à infecção pelo vírus da raiva. Dois anos mais tarde, Kissling descreveu a passagem seriada de vírus de campo e de cultivo em células primarias de rim de hamster
Por volta de 1963, Kissling e Reese demonstraram o potencial da utilização do crescimento viral desta maneira para preparação de uma vacina. 1975 Larghi et al. - BHK-21 desenvolveram o primeiro isolamento do vírus rábico de rua em células BHK-21 (baby hamster kidney) tendo em vista o seu uso na rotina diagnóstica (CAMPBELL; CHARLTON, 1988).Segundo este experimento: cultura celular apresentou > sensibilidade. 1977 Smith et al. CER (embrião de galinha). Um ano depois utiliza N2A (neuroblastoma de camundongo)
Congelamento Descongelamento Manutenção Fonte: Instituto Pasteur
Fonte: Instituto Pasteur A manutenção das células é realizada em dois repiques por semana, efetuados durante sua viabilidade e crescimento.
Fonte: Instituto Pasteur Estas células, após crescimento, serão utilizadas na técnica do isolamento viral.
Contagem Celular Fonte: Google Obtenção do número de células desejável: 5 x 10 5 células/ml
N de células /ml = n total de células X 10.000 X fator de diluição n de quadrantes N de células encontrado = Volume Final N de células /ml da suspensão original
Total de células dos 4 quadrantes x 10.000* x 10** 4 * Fator de conversão da câmara de Neubauer **Volume total de meio usadas na suspensão de células. Ex.: 196 x 10 4 x 10 = 490 x 10 4 = 49 x 10 5 4 Células/mL 49 x 10 5 Volume final 5 x 10 5 1 ml Volume final= 9,8 ml
Inóculo: Fonte: Instituto Pasteur Uma suspensão a 20% (peso/volume) foi preparada a partir de fragmentos do Sistema Nervoso Central
Armazenamento das amostras em freezer Fonte: Instituto Pasteur
Após preparar Cabine de Segurança Biológica, homogeneizar a amostra. Manipular no gelo. Fonte: Instituto Pasteur
Meio de cultura: para 10 ml de meio acrescentar 30 μl de antibiótico e 30 μl de aminoácidos essenciais Fonte :Instituto Pasteur
Adicionar 40μL da amostra em cada orifício da placa, em triplicata. Fonte :Instituto Pasteur
Adicionar 160 μl de meio de cultura, homogeneizar. Fonte:Instituto Pasteur
Fonte: Instituto Pasteur Adicionar 100 μl de suspensão de células, (contendo 5 x 10 5 células/ml ).
Incubar a 37 C em Câmara Úmida de CO2 a 5% de 72 a 96 horas Fonte :Instituto Pasteur
Como as células não sofrem efeito citopático, será preciso evidenciar o vírus através da Imunofluorescência Direta (IFD). Remover o sobrenadante com uma bomba de sucção. Fonte :Instituto Pasteur
Adicionar 200 μl de Acetona a 80% e incubar por 15 minutos em banho de gelo. Fonte: Instituto Pasteur
Após, desprezar Acetona e secar a placa. Fonte: Instituto Pasteur
Fonte: Instituto Pasteur Acrescentar 40 μl do conjugado antirrábico, previamente titulado, por orifício, e incubar a 37º C por 60 minutos.
Enxaguar a placa por imersão, 3 vezes em solução salina tamponada, ph 7,4, e 3 vezes em água destilada. Secar a placa. Fonte: Instituto Pasteur
Fonte: Instituto Pasteur Adicionar 50μL de glicerina tamponada (ph 8.5) em cada orifício
Fonte: Instituto Pasteur A leitura será realizada em cada orifício e, sendo observada pelo menos uma célula infectada, será considerada positiva. Orifícios sem células infectadas serão considerados negativos.
Positivo Negativo
Obrigada! Instituto Pasteur 551131453145 e-mail: anasraui@hotmail.com Fonte:Google