Espectrometria de massas Princípios básicos Teoria DESENVOLVENDO UMA CIÊNCIA MELHOR AGILENT E VOCÊ 1
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Introdução Espectrometria de massas (MS) é uma técnica química analítica que ajuda a identificar a quantidade e o tipo de substâncias químicas presentes em uma amostra ao medir a razão massa/carga e a abundância de íons de fase gasosa. Um espectro de massa é um gráfico do sinal do íon em função da razão massa/carga. A partir dos espectros, a massa do íon molecular e dos fragmentos são usados para determinar a composição elementar ou a assinatura isotópica de um composto. Estas informações são usadas para elucidar as estruturas químicas de moléculas, como pesticidas ou peptídeos. A espectrometria de massas funciona ionizando compostos químicos para gerar moléculas ou fragmentos de moléculas carregadas e medir suas razões massa/carga. Fonte: Wikipedia 3
Introdução Tecnologia vencedora do Prêmio Nobel John Fenn e Koichi Tanaka receberam o Prêmio Nobel de Química em 2002 pelo desenvolvimento de duas tecnologias de ionização suave: Tecnologia eletrospray, Dr. Fenn Dessorção por laser suave, Dr. Tanaka Concert Hall, Estocolmo, Suécia, dezembro de 2002 Dr. Fenn recebendo o Prêmio Nobel do Rei da Suécia 4
Índice () Introdução Considerações básicas Massas em espectrometria de massas Etapas fundamentais Como funciona Ionização Impacto de elétron Ionização química Considerações sobre amostra (LC-MS) Eletrospray Ionização química à pressão atmosférica Fotoionização à pressão atmosférica Ionização multimodo MALDI ICP Como funciona Analisador de massa Quadrupolo simples Triplo quadrupolo Ion Trap Tempo de voo Resultados Espectro de massas Quad. simples vs. TOF Íons de cargas múltiplas e deconvolução Informações adicionais Webpage da Agilent para o Meio Acadêmico Publicações 5
Introdução Considerações básicas Os elementos podem ser identificados exclusivamente pela massa. A espectrometria de massas é um método analítico para medir o peso molecular ou atômico. Compostos, com elementos diferentes, podem ser diferenciados por suas massas: Glicose C 6 H 12 O 6 MW: 180.1559 g/mol Penicilina C 16 H 18 N 2 O 4 S MW: 334.39 g/mol Fonte: Tabela periódica, pôster SI-0186 6
Introdução Massas em espectrometria de massas A média de massa de uma molécula é obtida pela soma das médias de massas atômicas dos elementos. Média de massa da água (H 2 O): 1.00794 + 1.00794 + 15.9994 = 18.01528 Da A massa monoisotópica é a soma das massas dos átomos em uma molécula no estado fundamental, usando a massa exata do isótopo de ocorrência natural mais abundante de cada elemento. A massa monoisotópica geralmente é expressa em unidades de massa atômica. A massa exata (mais adequadamente, a massa exata medida) é estabelecida experimentalmente e permite que a composição elementar seja determinada. Para moléculas com massa abaixo de 200 uma (unidades de massa atômica), a precisão de 5 ppm geralmente é suficiente para determinar de forma exclusiva a composição elementar. Fonte: Wikipedia 7
Introdução Etapas fundamentais Procedimento de MS característico: A amostra (sólida, líquida, gasosa) é ionizada As moléculas da amostra podem quebrar em fragmentos carregados durante a ionização Os íons são separados de acordo com a razão massa/carga (m/z) Os íons são detectados por um mecanismo capaz de detectar partículas carregadas (ex: multiplicador de elétrons) Os resultados são exibidos como espectros da abundância relativa como uma função de razão massa/carga A identificação é feita ao correlacionar massas conhecidas com as massas identificadas ou por meio de um padrão de fragmentação característico 8
Ionização Antes de ser analisada por espectrometria de massas a amostra deve ser ionizada na fonte de íons. Introdução de amostra gasosa: Ionização de elétrons (EI) Ionização química (CI) Introdução de amostra líquida: Ionização eletrospray (ESI) Ionização química à pressão atmosférica (APCI) Fotoionização à pressão atmosférica (APPI) Ionização multimodo (MMI) Ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) Plasma induzido acoplado (ICP) 9
Peso molecular Como funciona Ionização A polaridade dos analitos determina a fonte de ionização. 100.000 ESI ESI APPI Ionização eletrospray Fotoionização à pressão atmosférica APPI GCMS APCI APCI Ionização química à pressão atmosférica GC/MS Cromatografia gasosa/ Espectrometria de massas 10 não polar Polaridade do analito muito polar 10
Ionização Impacto de elétrons (EI) O Impacto de elétrons (EI) é bem conhecido e é o método de ionização mais comum na Cromatografia Gasosa (GC). As moléculas existentes no cromatógrafo gasoso são bombardeadas por um feixe de elétrons (70 ev) que remove um elétron da molécula, resultando em um íon carregado. CH 3 OH + 1 elétron CH 3 OH + + 2e - Íon molecular O EI geralmente produz íons e fragmentos de íons moleculares carregados (partes menores das moléculas originais) que são usados para elucidar a estrutura. CH 3 OH + CH 2 OH + + H ou CH 3 OH + CH 3+ + OH Íon fragmento Um elétron ou fotomultiplicador detecta os íons separados. O espectro de massa gerado representa a intensidade do sinal em uma determinada razão massa/carga. 11
Ionização Impacto de elétrons (EI) A interface de GC/MS opera em altas temperaturas. Interface EI para GC/MS. Fonte: Manual de operação do GC/MS Agilent 7000 Series triplo quadrupolo (p 46) 12
Ionização Ionização química (CI) O EI é um processo de transferência de energia direta com energia cinética do elétron depositada diretamente em uma molécula de analito. A CI é um processo indireto envolvendo um agente químico intermediário. Isso é realmente verdadeiro na ionização química positiva (PCI). Na PCI, a fonte de íons é preenchida com um gás reagente ionizado para criar íons que reajam com o analito. Gases reagentes usados com mais frequência: metano, iso-butano e amônia. O gás reagente aplicado determina o comportamento de ionização e fragmentação do analito. As principais reações do metano são: CH 4 + e - CH 4+, CH 3+, CH 2 + O gás reagente é ionizado pelos elétrons que entram na fonte de ionização. CH 4 + CH 4 + CH 5+, CH 3 CH + 2 + CH 4 C 2 H + 4 + H 2 CH + 2 + CH 4 C 2 H + 3 + H 2+ H CH 3 + + CH 4 C 2 H 5 + + H 2 C 2 H 3 + + CH 4 C 3 H 5 + + H 2 Consulte as observações para obter mais detalhes 13
Ionização Considerações sobre a amostra (LC/MS) ESI APCI APPI Volatilidade não exigida Técnica preferencial para analitos termicamente instáveis Íons formados em solução Pode formar íons de cargas múltiplas Um pouco de volatilidade necessária O analito deve ser termicamente estável Íons formados na fase gasosa Forma somente íons carregados isoladamente Um pouco de volatilidade necessária O analito deve ser termicamente estável Íons formados na fase gasosa Forma somente íons carregados isoladamente Muitos compostos serão bem ionizados usando as três fontes. APCI/APPI podem ionizar moléculas que sejam muito não polares para ionizar no ESI. 14
Ionização Considerações sobre a amostra (LC/MS) ESI APCI APPI Íons em solução ex: catecolamina, conjugados de sulfato, aminas quaternárias Compostos que contêm heteroátomos ex: carbamatos, benzodiazepinas Compostos que multiplicam a carga na solução ex: proteínas, peptídeos, oligonucleotídeos Compostos de MW e polaridade intermediárias ex: PAHs, PCBs, ácidos graxos, ftalatos, álcoois Compostos que contêm heteroátomos ex: carbamatos, benzodiazepinas Compostos que são muito não polares para resposta de ESI Compostos de MW e polaridade intermediárias ex: PAHs, PCBs, ácidos graxos, ftalatos, álcoois Compostos que contêm heteroátomos ex: carbamatos, benzodiazepinas Compostos que são muito não polares para resposta de ESI 15
Ionização Eletrospray (ESI) A ionização eletrospray (ESI) é uma técnica de ionização suave. O eluente de LC é pulverizado (nebulizado) em uma câmara de nebulização a pressão atmosférica na presença de um campo eletrostático e um gás de secagem aquecido. O campo eletrostático ocorre entre o nebulizador, que está no chão neste design e o capilar, que está em alta tensão. Moléculas adequadas: Pequenas moléculas (glicose) e biomoléculas grandes (proteínas, oligonucleotídeos) A carga múltipla é o fenômeno do ESI que permite a análise de grandes moléculas (-> Deconvolução) Fonte de íons eletrospray Fonte: Guias de conceito de LC/MS (p 22) 16
Ionização Processo de ESI De gotículas carregadas a íons de analito O nebulizador produz um tamanho de gotícula uniforme. As gotículas carregadas são atraídas em direção ao capilar dielétrico. O fluxo de nitrogênio aquecido ao redor do capilar diminui as gotículas. Esse processo é chamado de dessolvatação. As gotículas continuam diminuindo de tamanho até que as forças eletrostáticas repulsivas (Lei de Coulomb) excedam as forças de coesão da gotícula, fazendo com que explodam. Este processo se repete até que os íons do analito são finalmente dessorvidos na fase gasosa, determinados pelos campos elétricos fortes na superfície das microgotículas. Este processo é chamado de evaporação de íons. 17
Ionização Ionização química à pressão atmosférica (APCI) A APCI é um processo de ionização química de fase gasosa. Portanto, o analito deve estar na fase gasosa para a ionização. O eluente de LC passa por uma agulha de nebulização, que cria uma névoa fina. As gotículas são completamente vaporizadas em um tubo de cerâmica aquecido (~ 400 a 500 C). Moléculas adequadas: Moléculas 1.500 u Menos compostos polares e não polares (geralmente analisados por cromatografia de fase normal) Fonte de ionização química à pressão atmosférica Fonte: Guias de conceito de LC/MS (p 27) 18
Ionização Processo de APCI Isto demonstra os processos de evaporação e ionização de APCI. Observe que o analito não é ionizado até depois da evaporação e após o gás reagente ser ionizado. O gás reagente então transfere uma carga para o analito. Geralmente, a APCI gera apenas íons carregados unicamente, no entanto, é possível obter íons carregados duplamente onde os locais da carga são mantidos distantes (geralmente por uma região hidrofóbica). Consulte as observações para obter mais detalhes 19
Ionização Fotoionização à pressão atmosférica (APPI) Com a técnica de APPI, o eluente de LC passa por uma agulha de nebulização para criar uma névoa fina. As gotículas são completamente vaporizadas em um tubo de cerâmica aquecido. A mistura de gás/vapor passa por uma luz ultravioleta de uma lâmpada de criptônio para ionizar as moléculas da amostra. Os íons da amostra são introduzidos no capilar. A APPI é aplicável a muitos compostos semelhantes que são geralmente analisados pela APCI. Foi comprovado que a APPI é principalmente vantajosa para analisar compostos não polares aromáticos. Fonte de fotoionização à pressão atmosférica Fonte: Guias de conceito de LC/MS (p 29) 20
Ionização Processo de APPI Isto demonstra os processos de evaporação e ionização de fotoionização. A APPI e a APCI são semelhantes, com a APPI substituindo uma lâmpada para a agulha corona para ionização. A APPI geralmente usa um outro solvente ou modificador de fase móvel, chamado de "agente dopante" (D), para auxiliar o processo de ionização. APPI direta: M h M M SH e M H S APPI dopante: D h D D D M M M e M H D D Consulte as observações para obter mais detalhes 21
Ionização Ionização multimodo (MMI) A fonte multimodo é uma fonte de íons que pode operar em três modos diferentes: APCI ESI APCI/ESI simultâneo Incorpora duas zonas otimizadas separadas eletricamente uma para ESI e uma para APCI. Durante a APCI/ESI simultânea, os íons de ambos os modos de ionização entram no capilar e são analisados simultaneamente pelo espectrômetro de massas. A MMI é útil para analisar desconhecidos ou sempre que a amostra tiver uma mistura de compostos em que alguns respondem pelo ESI e outros pela APCI. Fonte multimodo Fonte: Guias de conceito de LC/MS (p 30) 22
Ionização Ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) A ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) é uma técnica de ionização suave. A amostra é misturada com uma matriz em uma placa de metal. Um laser pulsado irradia a amostra, desencadeando a ablação e a dessorção. As moléculas do analito são ionizadas na coluna de fumaça quente dos gases ablacionados. Os íons são acelerados no espectrômetro de massas. Moléculas adequadas: Biomoléculas (DNA, proteínas, açúcares) Grandes moléculas orgânicas (polímeros) 23
Ionização Plasma induzido acoplado (ICP) Um instrumento de plasma induzido acoplado (ICP) usa uma fonte de plasma na qual a energia é fornecida por correntes elétricas que são produzidas pela indução eletromagnética, ou seja, por campos magnéticos de tempo variável. O plasma é tão energético que reduz as moléculas a elementos ionizados. Há tipos distintos de geometrias de ICP disponíveis que podem ser acopladas a tecnologias diferentes: ICP-AES Espectroscopia de emissão atômica ICP-OES Espectroscopia de emissão óptica ICP-MS Espectrometria de massas ICP-RIE Gravura de íon reativo O diagrama esquemático mostra as inter-relações dos vários componentes em um sistema de ICP-MS hifenado Fonte: Manual de aplicação de ICP-MS hifenado Fonte: Wikipedia 24
Analisador de massa Após a ionização e o transporte de íons, os analitos entram no analisador de massa. O espectrômetro de massas mede os sinais de íon resultantes em um espectro de massas, que pode fornecer informações importantes sobre o peso molecular, estrutura, identidade e quantidade de um composto. Há diversos tipos de analisadores de massas: Quadrupolo simples (SQ) Triplo quadrupolo (QQQ) Tempo de voo (TOF) Ion Trap (IT) 25
Analisador de massa Quadrupolo simples (SQ) Íons carregados gerados na fonte de íons entram no analisador de massa. O analisador de massa quadrupolo faz uma varredura sequencial, de modo que apenas uma única m/z de íon possa passar de uma vez. Todos os outros íons são perdidos. m/z - razão massa/carga: Massa de um íon (Daltons ou u.m.a.) dividida pelo número de cargas no íon Informações recebidas: Apenas MS Modelo conceitual Quadrupolo simples Modelo conceitual Quadrupolo simples 26
Analisador de massa Quadrupolo simples (SQ) Monitoramento de íon simples (SIM) Modo de varredura O analisador de massa está configurado para permitir que apenas íons de m/z única passem para o detector Um íon alvo com m/z específica é monitorado. O SIM em um quadrupolo simples permite a melhor sensibilidade para quantificação, no entanto não oferece especificidade. No modo de MS de varredura, o analisador de massa quadrupolo faz a varredura sequencial, permitindo que apenas 1 m/z de cada vez passe para o detector. 27
Analisador de massa Triplo quadrupolo (QQQ) Íons carregados gerados na fonte de íons entram no analisador de massa. O analisador consiste em três quadrupolos (Q1-Q3) e diversos modos de operação resultam em diferentes informações. A seguir é apresentada uma configuração simples: Q1: usado como um filtro para m/z específica (íon precursor) Q2: usado como cela de colisão para fragmentar o íon precursor e gerar íons de produto Q3: configurado para m/z específica (SRM ou MRM) ou modo de varredura (varredura de íon de produto) Modelo conceitual Triplo quadrupolo O esquema exibe o modo de SRM Informações recebidas: MS e MS/MS 28
Analisador de massa Triplo quadrupolo (QQQ) Monitoramento de reações múltiplas (MRM) Modo de MS/MS de varredura completa Cela de colisão com gás argônio. Íons precursores com m/z única passam pela cela de colisão. Íons fragmento são gerados por colisão com moléculas de argônio. O Q3 está configurado para m/z única de íon fragmento específico. Este método é muito sensível e usado para quantificação. A diferença do modo de varredura completa em relação ao SRM/MRM na função de varredura. O Q3 faz a varredura sequencial, permitindo que apenas 1 m/z de cada vez passe para o detector. Um espectro de íon de produto é gerado. Este modo de operação é menos sensível em relação ao SRM/MRM. 29
Analisador de massa Ion trap (IT) Íons carregados gerados na fonte de íons entram no analisador de massa. Todos os íons da polaridade selecionada na faixa de massa podem ser armazenados ao mesmo tempo no trap. Os íons podem ser manipulados no analisador de massa ion trap realizando diversos estágios de isolamento e fragmentação até o momento da detecção. Em vez de quatro hastes paralelas, o ion trap consiste em um eletrodo de anel circular mais dois end caps que formam um "trap". Informações recebidas: MS e MS/MS Modelo conceitual Ion trap 30
Analisador de massa Ion trap (IT) Etapa 1: Isolamento do íon precursor Etapa 2: Fragmentação do íon precursor a a b Assim que a injeção e o acúmulo de íons forem concluídos, a porta de íons se fecha e os íons não são mais injetados no analisador de massa. Formas de onda são aplicadas para expelir massas acima e abaixo do íon precursor. A ressonância de excitação do íon precursor causa a dissociação induzida por colisão (CID) e íons de produto são gerados. Os íons de produto de varredura completa são expelidos para o detector (b). 31
Analisador de massa Tempo de voo (TOF) Íons carregados gerados na fonte de íons entram no analisador de massa. Componentes do analisador: Filtro de massa (Q1), opcional Tubo de voo Cela de colisão (Q-TOF) Depois de passar o quadrupolo ou a cela de colisão os íons chegam no pulsador de íons. Um pulso de alta tensão é aplicado e acelera os íons no tubo de voo. Um espelho de íons no fim do tubo reflete os íons e os envia para o detector, que registra o momento de chegada. Informações recebidas: TOF: Apenas MS Q-TOF: MS e MS/MS Esquema do espectrômetro de massas de tempo de voo Fonte: Espectrometria de massa de TOF O gráfico mostra um Q-TOF 32
Analisador de massa Tempo de voo (TOF) O tempo de voo (t) para cada massa é único e é determinado pela energia (E) à qual um íon é acelerado, a distância (d) que deve ser percorrida e a m/z. E 1/ 2mv 2 a qual é resolvida para m parece: m 2E / v 2 a qual é resolvida para v parece: v ( 2E / m) equação 1 b Cela de colisão com gás argônio. A equação diz que para uma determinada energia cinética, E, massas menores terão velocidades maiores do que massas maiores. Íons com massas menores chegam antes ao detector. A velocidade é determinada (e consequentemente a massa) ao medir o tempo que um íon demora para atingir o detector. 33
Analisador de massa Tempo de voo (TOF) A segunda equação é a velocidade (v) conhecida igual a distância (d) dividida pelo tempo (t): v d / t A combinação das equações 1 e 2 produz: m 2 2 ( 2E / d ) t Para uma determinada energia (E) e distância, a massa é proporcional ao quadrado do tempo de voo do íon. E e d são mantidas constantes e resumidas na variável A 2 que gera uma equação simplificada: m A t Para ser bem preciso, um atraso de tempo para aplicar a alta tensão também deve ser considerado: t t m t 0 Isso resulta na equação final: m A( t t 0 ) m 2 34
281,0 301,0 280,0 279,1 Resultados Exemplo 1 Espectro de massas de sulfametazina analisado com um analisador de massa de quadrupolo simples Fórmula molecular: C 12 H 14 N 4 O 2 S [M+H] + : 279,33 Espectro de massas de sulfametazina. Fonte: G1960-90083 (p. 17) 35
Resultados Exemplo 2 Espectro de massas de cocaetileno com um analisador de massa Q-TOF Fórmula molecular: C 18 H 23 NO 4 [M+H] + : 318,387 Espectro de massas de cocaetileno. Fonte: Uma comparação de diversas técnicas de LC/MS para uso em toxicologia (Fig. 36) 36
Abundância Abundância Resultados Quad simples vs. TOF de alta resolução A análise com um quadrupolo simples (triplo) oferece informações de massa nominal (baixo poder de resolução); instrumentos de tempo de voo podem oferecer informações de massa exata (alto poder de resolução). A calibração contínua de um sistema TOF é necessária para a análise de tempo de voo para garantir a melhor exatidão de massa possível. As medições geralmente desviam apenas algumas partes por milhão (ppm). Massa alvo Poder de resolução baixo Massa alvo Interferência Poder de resolução alvo Com resolução de massa e exatidão de massa suficientes, um espectrômetro de massas TOF pode confirmar positivamente a composição elementar. Interferência Massa Poder de resolução de um quadrupolo simples (a) em relação ao Tempo de voo (b) Fonte: 5989-2549EN (material em inglês) (p. 14) 37
281,0 301,0 280,0 279,1 Resultados Quad simples vs. TOF Espectro de massas de quadrupolo simples típico Espectro de massas de TOF típico +TOF MS: Experimento 2, 0,932 para 1,007 min de sulfa 284 a.wiff Agilent 156,0116 Contagens máx. 48e4,0207,0027,0242,0000 Espectro de massas de sulfametazina. Fonte: G1960-90083 (p. 17) Espectro de massas de sulfaclorpiridazina com aduto e íons fragmento. Fonte: 5989-2549EN (material em inglês) (p. 25) 38
Resultados Íons de cargas múltiplas e deconvolução Dependendo da molécula analisada e da técnica de ionização, íons de cargas múltiplas podem ser gerados. Pequenas moléculas e APCI oferecem moléculas carregadas uma única vez: A m/z medida corresponde ao peso molecular após a subtração (íon positivo) ou adição (íon negativo) do transportador de carga. Para moléculas grandes (peptídeos, proteínas) ionizadas com ESI, mais de um possível local de carga (para protonação ou desprotonação) está disponível e pode resultar em íons de cargas múltiplas: Isso torna moléculas grandes, como anticorpos, (> 1 Mio Da) acessíveis para a espectrometria de massas, visto que os íons medidos passam a ter um intervalo de m/z mais facilmente medido. Um algoritmo matemático é necessário para determinar o peso molecular real da m/z medida. Esse processo é conhecido como deconvolução. 39
Abundância Abundância Abundância Resultados Íons de cargas múltiplas e deconvolução Exemplo 1177,68 Massa esperada de sintetase de glutamina não modificada: 51.772,7 u 1102,58 1057,61 1205,06 1117,6 1126,52 1233,73 1263,80 1295,38 1328,53 1363,47 Razão massa/carga (m/z) 51772,87 1016,17 996,67 977,87 1400,31 1439,18 1480,25 922,01 Razão massa/carga (m/z) Massa (u) Espectro de massas de sintetase de glutamina expressa. Espectro de massas deconvoluído de sintetase de glutamina expressa. Fonte: LC/TOF-MS de massa exata para confirmação de peso molecular de proteínas intactas (Fig 1, p 4) 40
Abreviações Abreviação Definição Abreviação Definição APCI Ionização química à pressão atmosférica M Íon molecular APPI Fotoionização à pressão atmosférica MALDI Ionização por dessorção de laser assistida pela matriz CI Ionização química MMI Ionização multimodo D Dopante (APPI) MS Espectrometria de massas Da Dalton m/z Razão massa/carga EI Impacto de elétron QQQ Triplo quadrupolo ESI Ionização eletrospray SIM Monitoramento de íon simples GC Cromatografia gasosa SH Moléculas de solvente GC/MS Espectrometria de massas por cromatografia gasosa SQ Quadrupolo simples ICP Plasma induzido acoplado MRM Monitoramento de reações múltiplas IT Ion Trap SRM Monitoramento de reação selecionada LC/MS Espectrometria de massas por cromatografia líquida (Q) - TOF Tempo de voo 41
Informações adicionais Para obter mais informações sobre os produtos Agilent, acesse www.agilent.com ou www.agilent.com/chem/academia Para dar sugestões ou esclarecer dúvidas sobre a apresentação, entre em contato com academia.team@agilent.com Publicação Título No. da pub. Manual Manual de operação do GC/MS Agilent 7000 Series triplo quadrupolo G7000-90044 Guia Sistema LC/MS quadrupolo Agilent 6100 Series Guia de conceitos G1960-90083 Compêndio de aplicação Descrição técnica Aplicação Aplicação Vídeos Imagens Soluções de tempo de voo no desenvolvimento farmacêutico o potencial da massa exata Tempo de voo Espectrometria de massas LC/TOF-MS de massa exata para confirmação de peso molecular de proteínas intactas Uma comparação de diversas técnicas de LC/MS para uso em toxicologia www.agilent.com/chem/teachingresources www.agilent.com/chem/teachingresources 5989-2549EN (material em inglês) G5990-9207EN (material em inglês) 5989-7406EN (material em inglês) 5990-3450EN (material em inglês) 42
OBRIGADO Número da publicação: 5991-5857PTBR April 5, 2016 43