INTRODUÇÃO A ESPECTROMETRIA DE MASSAS Pioneiros da espectrometria de massas Espectrometria de massas: técnica analítica que separa e mede a relação massa:carga (m/z) de íons, em fase gasosa, produzidos por algum método de ionização. Qual o princípio da separação de íons de acordo com a relação m/z? Diferença de trajetórias, em alto vácuo, sob a influência de campos elétricos e/ou magnéticos. 2013 celebra o centenário da espectrometria de massas!!! J. J. Thomson Premio Nobel 1906 Física F. A. Aston Premio Nobel 1922 Química H. G. Dehmelt Premio Nobel 1989 Física W. Paul Premio Nobel 1989 Física K. Tanaka Premio Nobel 2002 Química J. Fenn Premio Nobel 2002 Química INTRODUÇÃO A ESPECTROMETRIA DE MASSAS Espectrometria de massas: técnica analítica que separa e mede a relação massa:carga (m/z) de íons, em fase gasosa, produzidos por algum método de ionização. Qual o princípio da separação de íons de acordo com a relação m/z? Diferença de trajetórias, em alto vácuo, sob a influência de campos elétricos e/ou magnéticos. Espectro de massas registram abundancia relativa de íons em função de m/z. Aplicações Determinação de massa molecular com elevada exatidão e distinção entre composição química pela massa molecular. Aplicações: determinação de massa molecular com elevada exatidão de materiais poliméricos e biomoléculas 1
Aplicações e características da EM Algumas aplicações da EM: (a) determinação de massa molecular com elevada exatidão, inclusive de biomoléculas e materiais poliméricos; (b) identificação de substancias, mesmo em misturas complexas; (c) informação estrutural: conectividade dos átomos numa molécula; informações termoquímicas; (d) análise e padrões isotópicos. Algumas características importantes da EM: (i) técnica qualitativa e quantitativa, capaz de analisar misturas complexas; (ii) alta sensibilidade; (iii) universal e específica; (iv) técnica rápida. Thomson: unidade de m/z (Dalton/carga do elétron) Massa média (ou química) = massa calculada usando uma média ponderada sobre a abundancia isotópica. Massa nominal: massa calculada usando como número inteiro a massa do isótopo principal, p.ex. CH 4 = 16 u. Massa exata: massa calculada usando o valor da massa do isótopo principal, p.ex. 12 C 1 H 3 79 Br = 93,941011 u. m/z = grandeza abstrata sem unidades, ou em unidades de Th. Espectro de massas = registro de abundância iônica em função de m/z. Pico base sinal do íon mais abundante. Pico isotópico sinal devido a outros isótopos da mesma composição química. Abundancia relativa = abundancia normalizada com relação ao pico base. Intensidade relativa = razão entre a intensidade do pico e o pico base. Intensidade percentual = (I i /Σ I j ). Introdução de amostra. Ionização da amostra. Separação dos íons de acordo com a relação m/z. Detecção e quantificação dos íons. Unidade de processamento de dados. Componentes de um espectrômetro de massas Energia dos elétrons = energia cinética resultante da aceleração por uma diferença de potencial (V) Ionização por elétrons de um hidrocarboneto: energia do elétron é suficiente para causar ionização da molécula e promover a fragmentação de M + ½ mv 2 = e V Ionização: energia do elétron deve ser superior a energia de ionização da molécula 2
Ionização por elétrons de outro isômero C 7 H 16 : fragmentação extensa de M + auxiliada pela estabilidade dos fragmentos iônicos produzidos Espectros de massas por ionização por elétrons de sistemas inorgânicos com padrões isotópicos característicos: a) caso do S 8 ( 32 S e 34 S) ; b) complexo de Cr ( 50 Cr, 52 Cr, 53 Cr, 54 Cr) Energia eletrônica e espectrometria de massas: Eficiência de ionização a várias energias: máximo ~ 70 ev Espectros de massas de uma β-lactama a duas energias eletrônicas diferentes: maior fragmentação a 70 ev Ionização química Ionização produzida por uma reação química provocada por um gás ionizado. Gás reagente, p.ex. CH 4 CH 4 + + CH 4 CH 5+ + CH 3 CH 5+ é um ácido de Brønsted muito forte em fase gasosa: ionização suave com formação de MH + e fragmentos eventuais M + CH 5+ MH + + CH 4 Outros reagentes: isobutano, C 4 H 10, NH 3 C 4 H 10 + e - C 4 H 9+ + H + 2 e - NH 3 + + NH 3 NH 4+ + NH 2 Transferência de próton depende da afinidade protônica relativa entre o substrato neutro e a base conjugada do ácido M + H + MH + AP (M) = - H o AP (CH 4 ) = 543,5 kj mol -1 AP (C 4 H 8, isobuteno ou Me 2 C=CH 2 ) = 802,1 kj mol -1 AP (NH 3 ) = 853,6 kj mol -1 3
Comparação de espectros de massa obtidos por ionização eletrônica e por ionização química (método suave de ionização) MALDI Analito depositado numa matriz orgânica, que possui absorção intensa no λ do laser (λ = 337 nm para laser de N 2 ); Dessorção por um laser pulsado (ns) de alta intensidade; Matrizes típicas: ácido 2,5-dihidroxibenzóico; ácido 3,5-dimetóxi-4- hidroxicinámico; ácido 5-clorosalicílico; Espectro resultante inclui íons (M+H)+, e outros com prótons adicionais, retirados da matriz. Espectro de massas MALDIde poli-metil metacrilato <M> = 7100 Da 4
Polysulfated-Derived Oligosaccharides Positive-ion (a) and negativeion (b) MALDI mass spectra of CS-D tetra with pmg. Aplicações de MALDI Identificação de proteínas de elevada massa molecular ( > 100.000 Da). Espectros apresentam proteínas grandes com íons [M+H] +, [M+2H] 2+, e [M+3H] 3+. Proteínas pequenas apresentam espectros apenas com [M+H] +. Alta sensibilidade. Espectros de polímeros sintéticos. Imagem por espectrometria de massas!! IMS allows for distinction of different molecular species of β-amyloid plaques in an Alzheimer's disease model. Métodos de ionização a pressão atmosférica APCI: ionização química a pressão atmosférica. APPI: ionização química por fotoionização. ESI: electrospray DESI: electrospray por dessorção DART: (direct analysis in real time). Seeley E H, and Caprioli R M PNAS 2008;105:18126-18131 2008 by National Academy of Sciences 5
APCI (atmospheric pressure chemical ionization) Formação de íons em APCI (atmospheric pressure chemical ionization) Tipo de amostras Aplicações de APCI Substancias de polaridade e massa molecular mediana: PAH, PCB, ácidos graxos, esteroides, ftalatos,... Substancias sem sítios ácidos ou básicos. Substancias contendo heteroátomos: uréias, carbamatos,.. Substancias a serem evitadas: substancias instáveis a temperaturas mais altas, massa molecular elevada,... Exemplos de espectros obtidos por APCI no modo positivo e no modo negativo Positive APCI spectra of n-octane in synthetic air at 30 C, Vcone 1 V and at different n-octane concentrations of (a) 6 ppm, (b) 30 ppm, (c) 65 ppm, (d) 90 ppm, and (e) 150 ppm APPI (atmospheric pressure photoionization) 6
Espectro de massas obtido no modo negativo por APPI Comparação entre métodos de ionização: exemplo da cafeína Espectro de massas de íons positivos obtido por APPI de petróleo venezuelano (cortesia do líder imortal HC) Comparação entre métodos de ionização: exemplo da budesonida (anti-inflamatório) 7