Fração mononuclear da medula óssea para reconstrução óssea em levantamento de seio maxilar

caso clínico Fração mononuclear da medula óssea para reconstrução óssea em levantamento de seio maxilar Resumo / Introdução: a demanda por procedimentos de enxertia óssea apresenta um crescimento substancial na área de reabilitação bucal. Entretanto, os pacientes dispostos a se submeter às cirurgias reconstrutivas procuram por procedimentos menos invasivos e com um pós-operatório menos mórbido. Técnicas de reconstrução óssea menos invasivas utilizam, tradicionalmente, substitutos ósseos no sentido de alcançar esses objetivos. No entanto, novos estudos voltados à engenharia tecidual apresentam as células-tronco da medula óssea, em associação a substitutos ósseos, como potencial de melhoramento das características biológicas dos materiais de enxertia. Objetivo: apresentar um caso clínico com a utilização de um concentrado do aspirado da medula óssea autógena (com isolamento da fração mononuclear da medula óssea) associado ao Bio-Oss em um procedimento de levantamento de seio maxilar. Resultados: decorridos cinco meses do procedimento de enxertia composta (Bio-Oss + concentrado de células-tronco medulares), foram removidas biópsias ósseas durante a cirurgia de instalação dos implantes. Após processamento, as imagens histológicas apresentaram grande quantidade de tecido mineralizado vital para um pós-operatório de cinco meses. Conclusão: o uso do concentrado da fração mononuclear da medula óssea associado ao substituto ósseo xenógeno Bio-Oss em levantamento de seio maxilar parece repercutir em adequado reparo ósseo, culminando em um menor tempo de cicatrização óssea. Porém, estudos clínicos prospectivos randomizados devem ser executados. Palavras-chave: Células-tronco. Transplante ósseo. Implantes dentários. Osseointegração. Medula óssea. André Antonio Pelegrine Professor coordenador dos cursos de especialização e mestrado em Implantodontia, Faculdade de Odontologia São Leopoldo Mandic. Rafael de MELLO E Oliveira Aluno do curso de especialização em Implantodontia e Prótese Dentária, Faculdade de Odontologia São Leopoldo Mandic. Thiago Altro de Oliveira Professor assistente no curso de especialização em Implantodontia, Faculdade de Odontologia São Leopoldo Mandic. Carlos Eduardo Sorgi da Costa Professor assistente no curso de especialização em Implantodontia, Faculdade de Odontologia São Leopoldo Mandic. José Eduardo OROSZ Médico Anestesista, Doutor em Anestesiologia, UNESP. Antonio Carlos Aloise Professor assistente no curso de mestrado em Implantodontia, Faculdade de Odontologia São Leopoldo Mandic. Como citar este artigo: Pelegrine AA, Mello e Oliveira R, Oliveira TA, Costa CES, Orosz JE, Aloise AC. Stem cells for bone reconstruction in sinus lifting. Dental Press Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51. Enviado em: 26/04/2013 - Revisado e aceito: 13/05/2013 Os autores declaram não ter interesses associativos, comerciais, de propriedade ou financeiros que representem conflito de interesse nos produtos e companhias descritos nesse artigo. Endereço de correspondência: André Antonio Pelegrine. Rua das Areias, 37 Cambuí CEP: 13024-530 Campinas/SP E-mail: pelegrineandre@gmail.com O(s) paciente(s) que aparece(m) no presente artigo autorizou(aram) previamente a publicação de suas fotografias faciais e intrabucais, e/ou radiografias. 40 Dental Pres Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51

Fração mononuclear da medula óssea para reconstrução óssea em levantamento de seio maxilar INTRODUÇÃO Tratamentos que visam a reconstrução do sorriso por meio da Implantodontia se tornam cada vez mais procurados pelos pacientes; porém, para o correto posicionamento dos implantes osseointegráveis, em muitas situações são necessárias reconstruções ósseas para uma posterior reabilitação protética de sucesso 1. A quantidade de procedimentos de enxertia óssea vem apresentando um crescimento substancial, com cada vez mais pacientes dispostos a se submeter aos procedimentos reconstrutivos. A técnica de enxertia com osso autógeno, a despeito de ser considerada padrão-ouro, vem sendo cada vez mais evitada. Por outro lado, os pacientes estão procurando procedimentos reconstrutivos menos invasivos e com um pós-operatório menos mórbido 1,2. Essa demanda fez com que aumentassem exponencialmente, nos últimos anos, os estudos com biomateriais substitutos do osso autógeno. Entre os substitutos dos enxertos autógenos, pode-se citar os enxertos aloplásticos (sintéticos), xenógenos e homógenos 3,4,5. Entretanto, esses materiais substitutos ósseos não apresentam qualidades osteogênicas além de pequena ou nenhuma capacidade osseoindutora, fazendo com que o tempo de cicatrização e incorporação do material de enxertia ocorra dentro de um período de seis a oito meses, o que vem sendo considerado elevado. Além disso, as regiões enxertadas com esses biomateriais contam com a presença de remanescentes do material de enxertia em níveis superiores, quando comparados aos resultados obtidos pela enxertia óssea autógena 6,7,8. Nos últimos anos, pesquisas em engenharia tecidual têm avançado no conhecimento das habilidades das células-tronco mesenquimais em se diferenciar em uma variedade de células especializadas (produzindo tecido adiposo, ósseo, cartilaginoso, endotelial). Dessa maneira, estudos estão sendo direcionados à criação de protocolos para terapias celulares passíveis de serem associadas aos materiais substitutos ósseos 4,5,9, no sentido de maximizar os resultados do reparo ósseo 2,10,11,12, com restauração dos tecidos nativos, sem a necessidade da remoção de grandes enxertos ósseos autógenos e, ainda, possibilitar tempos cicatricial e de osseointegração reduzidos 13. A partir do conhecimento de que a medula óssea é fonte para obtenção de células-tronco mesenquimais, com potencial de diferenciação osteogênica, e que essas células estão presentes em maior quantidade quando do isolamento da fração de células mononucleares da medula óssea (FMMO), alguns estudos foram conduzidos na tentativa de se elaborar um método que permitisse a concentração dessas células-tronco medulares. O protocolo de utilização do aspirado da medula óssea concentrado por gradiente de densidade vem sendo associado a materiais substitutos ósseos, que servirão de arcabouço para a utilização em regeneração tecidual guiada (RTG). Em RTG, membranas ou barreiras teciduais são utilizadas com o intuito de impedir a interferência de células indesejáveis, provenientes dos tecidos moles adjacentes, no processo cicatricial 14-18. A RTG vem sendo tradicionalmente utilizada em cirurgias para levantamento de seio maxilar, associadas à enxertia autógena, homóloga, xenógena e/ou de material sintético 16,18. Para a realização da técnica de levantamento do seio maxilar, vários autores preconizam a utilização do osso xenógeno bovino Bio-Oss devido às suas características físico-químicas e mecânicas, similares às do osso humano, o que o torna um substituto ósseo com excelentes características osseocondutoras 19-22. O presente caso clínico objetivou apresentar a utilização de um concentrado do aspirado da medula óssea autógena (com isolamento da fração mononuclear da medula óssea) por gradiente de densidade, associado ao Bio-Oss, Dental Pres Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51 41

Pelegrine AA, Mello e Oliveira R, Oliveira TA, Costa CES, Orosz JE, Aloise AC em um procedimento de levantamento de seio maxilar, para verificar se o uso dessa terapia pode maximizar os resultados regenerativos. RELATO DE CASO CLÍNICO Paciente com 55 anos de idade, leucoderma, sexo masculino, ASA I, boa higiene bucal, apresentou-se na Clínica de Reabilitação Oral da Faculdade de Odontologia São Leopoldo Mandic com os elementos 16 e 17 ausentes, e com a expectativa de reposição desses por meio de próteses fixas implantossuportadas. Após consulta inicial e solicitação de exames complementares, foi observada, na tomografia computadorizada, uma extensa perda de volume ósseo, devido à pneumatização do seio maxilar direito, o que levou ao planejamento de cirurgia de levantamento do seio maxilar por meio de enxertia óssea xenógena, associada à fração mononuclear da medula óssea (Fig. 1). O trabalho proposto foi encaminhado ao comitê de ética em pesquisas da Faculdade de Odontologia São Leopoldo Mandic, sendo aprovado sob protocolo nº 2012/0317. O presente caso clínico representa um entre uma série de Figura 1. Cortes tomográficos parassagitais demonstrando ausência de tecido ósseo (pneumatização do seio maxilar) em maxila, na parte posterior do lado direito. 42 Dental Pres Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51

Fração mononuclear da medula óssea para reconstrução óssea em levantamento de seio maxilar casos realizados, todos pertencentes ao grupo experimental de uma pesquisa relativa a uma dissertação de mestrado em fase de conclusão. Inicialmente e imediatamente antes do procedimento operatório, a coleta da medula óssea do paciente foi realizada por médico anestesista. Para esse procedimento, foi realizada antissepsia com digluconato de clorexidina a 2% em região de crista ilíaca direita do paciente e, em seguida, realizada anestesia local com cloridrato de lidocaína a 2%, sem vasoconstritor, para posterior punção no nível da crista ilíaca posterossuperior por meio de uma agulha de 40 x 12mm com mandril (Lee-Lok, Minneapolis, EUA) (Fig. 2). No presente estudo, foi utilizado o protocolo de obtenção da fração celular mononuclear (A) (B) Figura 2. A) Esquema ilustrativo da região de punção em crista ilíaca; B) coleta da medula óssea autógena. Dental Pres Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51 43

Pelegrine AA, Mello e Oliveira R, Oliveira TA, Costa CES, Orosz JE, Aloise AC da medula óssea pela separação por gradiente de densidade, com o Ficoll-Histopaque (Sigma-Aldrich, St Louis, EUA), a partir do seguinte método de separação de camadas celulares: (1) coleta de 4ml de aspirado da medula óssea da crista ilíaca posterossuperior; (2) em ambiente estéril de fluxo laminar, transferência do aspirado de medula óssea para um tubo cônico de 15ml, contendo 4ml de solução salina tampão (PBSx1) e homogeneização com pipeta; (3) transporte do conteúdo para outro tubo cônico de 15ml, contendo 8ml de Ficoll-Histopaque, de forma lenta, para não ocorrer a mistura das fases; (4) centrifugação por 30 minutos, a 400g (observar divisão das fases, onde, na fase superior, se encontra o plasma e seus constituintes solúveis; na interface, as células mononucleares; logo abaixo, a camada contendo Ficoll e, mais abaixo, a camada sob forma de sedimento celular, onde estão os eritrócitos e granulócitos; (5) com auxílio de uma pipeta de precisão, a interface com as células mononucleares é removida e transferida para outro tubo cônico contendo 4ml de PBS e homogeneizada; (6) centrifugação por 10 minutos, a 200g, em temperatura ambiente, para obtenção de um novo pellet no fundo do tubo; (7) descarte do sobrenadante; (8) ressuspensão do pellet em 1ml de PBS, para obtenção da suspensão celular final (Fig. 3 a 6). Junto ao procedimento laboratorial, o paciente recebeu cobertura antibiótica com 1g de amoxicilina e, também, dexametazona 4mg, Figura 3. Tubos cônicos com aspirado de medula óssea autógena com Ficoll-Histopaque. Figura 4. Centrifugação a 400g, por 10 minutos. Figura 5. Pipetagem do sobrenadante. Figura 6. Fração mononuclear da medula óssea. 44 Dental Pres Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51

Fração mononuclear da medula óssea para reconstrução óssea em levantamento de seio maxilar antissepsia extrabucal com digluconato de clorexidina a 2% e intrabucal com bochecho de uma solução de digluconato de clorexidina a 0,12% para, então, a cirurgia ser iniciada. O procedimento anestésico foi realizado por anestesia local infiltrativa, em fundo de sulco e região palatina, com cloridrato de mepivacaína a 2%, com epinefrina 1:100.00. Realizou-se incisão sobre a crista, levemente palatinizada, e uma incisão vertical relaxante com lâmina de bisturi nº 15 para posterior deslocamento de retalho total e acesso à região. Com o auxílio de brocas diamantadas e brocas de aço esféricas com largo diâmetro, foi criada uma loja óssea de formato ovoide, com desgaste total para acesso ao assoalho do seio maxilar, que, após deslocamento e levantamento de membrana de Schneider, recebeu o material de enxertia. Após o acesso cirúrgico, iniciou-se o preparo do material de enxertia, o qual foi associado com a fração mononuclear da medula óssea obtida pelo método de separação descrito acima. Foi utilizado como recipiente para homogeneização um pote dappen metálico estéril com tampa, preenchido com conteúdo de um frasco do substituto ósseo xenógeno (Bio-Oss 2g Large Particles 1,0-2,0mm, Geistlich, Suíça), para possibilitar a adição e homogeneização da FMMO. Após o total preenchimento e acomodação do enxerto composto, foi posicionada a membrana colágena reabsorvível Bio-Gide (Geistlich, Suíça) com tamanho adequado para recobrimento total da cavidade cirúrgica enxertada. Para sutura, foi utilizado Mononylon 5.0. Como medicação pós-operatória, foram prescritas: amoxicilina 500mg de 8 em 8 horas, por três dias; e dipirona sódica 500mg/ ml, 35 gotas, de 6 em 6 horas, enquanto houvesse dor. Foi realizado pós-operatório 10 dias após o ato cirúrgico para remoção de sutura, e não foi constatada nenhuma intercorrência (Fig. 7 a 11). Decorridos cinco meses da enxertia, foram solicitados novos exames tomográficos, a região foi reaberta e, com uma broca trefina de 2mm de diâmetro, foram preparados os alvéolos cirúrgicos para instalação de implantes e removidos dois espécimes ósseos, os quais foram fixados em formol a 10%, imediatamente após sua remoção. Na sequência, dois implantes Figura 7. Descolamento de retalho total e exposição óssea. Dental Pres Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51 45

Pelegrine AA, Mello e Oliveira R, Oliveira TA, Costa CES, Orosz JE, Aloise AC (A) (B) Figura 8. A) Abertura da janela de acesso ao assoalho do seio maxilar; B) levantamento da membrana de Schneider e acesso ao assoalho do seio maxilar. Figura 9. Substituto ósseo xenógeno associado a frações de células mononucleares da medula óssea (FMMO). Figura 10. Seio maxilar preenchido com enxerto xenógeno associado à FMMO. Figura 11. Colocação de membrana (Bio-Gide) servindo de barreira sobre a região enxertada. 46 Dental Pres Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51

Fração mononuclear da medula óssea para reconstrução óssea em levantamento de seio maxilar osseointegráveis, conexão Cone Morse, foram instalados (Black Fix Cone Morse, 4,0 x 10mm, Titanium Fix, Brasil) (Fig. 12, 13, 14). Posteriormente, foram confeccionadas lâminas histológicas coradas em hemotoxilina -eosina (HE), as quais foram analisadas em microscópio óptico sob magnificação de 100x. RESULTADOS Foi observada grande quantidade de tecido mineralizado vital para um pós-operatório de cinco meses, o qual é considerado reduzido ao preconizado em casos de enxertia (Bio-Oss), sem a associação de nenhuma fonte celular. Note, para efeito comparativo, a imagem histológica Figura 12. Cortes tomográficos parassagitais demonstrando presença de tecido ósseo em seio maxilar posterior do lado direito, em região de seio previamente pneumatizado. Dental Pres Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51 47

Pelegrine AA, Mello e Oliveira R, Oliveira TA, Costa CES, Orosz JE, Aloise AC (A) (B) Figura 13. Deslocamento de retalho em espessura total (A); perfuração óssea com broca trefina de 2mm (B). (A) (B) Figura 14. Espécime coletado em broca trefina 2mm para avaliação histológica (A); instalação de implantes osseointegráveis (B). de outro caso enxertado apenas com o BioOss, sem associação com terapia celular, em um pós-operatório de seis meses de outra cirurgia convencional de levantamento de seio maxilar, com loja óssea sinusal enxertada com osso xenógeno (Bio-Oss), usado da forma recomendada pelo fabricante (Fig. 15B). DISCUSSÃO O presente relato de caso clínico apresentou o uso do substituto ósseo xenógeno Bio-Oss, beneficiado pela técnica de concentração da fração mononuclear da medula óssea por gradiente de densidade, em um modelo cirúrgico de levantamento de seio maxilar pela técnica 48 Dental Pres Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51

Fração mononuclear da medula óssea para reconstrução óssea em levantamento de seio maxilar (A) (B) Figura 15. A) Imagem histológica (coloração HE) com magnificação de 100x, de espécime removido do caso clínico apresentado, onde a região de seio maxilar foi enxertada com Bio-Oss (^) associado à fração mononuclear (cinco meses de cicatrização). Note a grande quantidade de tecido mineralizado vital (*) ao redor das partículas de Bio-Oss (^). B) Imagem histológica (coloração HE) com magnificação de 100x, de outro caso clínico em seio maxilar onde foi enxertado Bio-Oss (^), sem associação à fração mononuclear (seis meses de cicatrização). Note a presença de um menor nível de tecido mineralizado vital (*) ao redor das partículas de Bio-Oss (^). de janela lateral. As análises confirmaram adequada qualidade tecidual após um período de tempo reduzido, quando comparado ao necessário pela técnica convencional. Isso também foi relatado em artigos científicos em que foram utilizados métodos para uso da medula óssea fresca (in-natura) ou processada 13,23. A técnica de enxertia óssea autógena é considerada padrão-ouro devido às suas características osseoindutoras, osseocondutoras e osteogênicas. Porém, apresenta fatores negativos relacionados à morbidade operatória, pela necessidade de dois ou mais sítios cirúrgicos em casos de maior quantidade de tecido doador, sendo, algumas vezes, de fontes extrabucais. Isso eleva o risco operatório, o custo cirúrgico e gera desconfortos pós-operatórios, fazendo com que cada vez menos pacientes optem por essa técnica 1,2. Essa problemática levou ao início da procura por substitutos ósseos que pudessem substituir o osso autógeno. No entanto, esses não apresentam as qualidades osteogênicas e osseoindutoras inerentes à enxertia autógena 8. A escolha de biomateriais que se aproximem ao máximo das características físicas, químicas e mecânicas do osso autógeno se tornou cada vez mais necessária, haja vista a necessidade de posterior uso da área enxertada para a instalação de implantes osseointegráveis. A literatura científica internacional relata o substituto ósseo xenógeno bovino Bio-Oss como um material com características muito semelhantes às do osso humano, o que está relacionado com sua boa característica osseocondutora 24-28. O tecido ósseo xenógeno liofilizado, ou qualquer outro material de enxertia substituto ósseo, apresenta como principal desvantagem a falta de fatores que propiciem osteogênese e osseoindução. A deficiência nesses fatores gera, portanto, tempo de cicatrização e de osseointegração elevado em relação ao osso autógeno, que atinge um período variando entre seis e oito meses 6,7,8. Isso é superior ao período necessário ao enxerto autógeno, que apresenta celularidade e fatores de crescimento e, portanto, com potenciais osteogênicos e osseoindutores. Esses potenciais inerentes aos enxertos autógenos repercutem em uma diminuição do período necessário para cicatrização óssea para quatro a seis meses 13,23. Dental Pres Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51 49

Pelegrine AA, Mello e Oliveira R, Oliveira TA, Costa CES, Orosz JE, Aloise AC Devido a esse consenso da literatura, iniciou-se a procura por métodos de enriquecimento desses substitutos ósseos com células provenientes da medula óssea do próprio paciente. Encontram-se descrições de técnicas de coleta e uso da medula óssea fresca (in natura) diretamente nos sítios cirúrgicos 1,2, além do cultivo das células-tronco mesenquimais contidas na medula óssea. Ainda, como foi realizado no presente relato de caso, a técnica de concentração da medula óssea pelo método descrito em outro artigo publicado por esse grupo de pesquisadores onde foi comprovado que o uso do enxerto ósseo xenógeno liofilizado Bio-Oss, associado ao concentrado de fração mononuclear da medula óssea autógena, aumenta a quantidade de tecido ósseo vital e, corroborando esse relato de caso, reduz o tempo cicatricial do enxerto 23. Esse método também foi recentemente publicado em livro 29. Técnicas de cultivo celular para uso em humanos apresentam desvantagens em relação ao uso da medula fresca ou concentrada, incluindo custo do processamento laboratorial, tempo de espera entre a coleta e a cirurgia de enxertia devido ao grande número de células necessárias, e riscos de contaminação 30, além de esbarrar em princípios éticos, por envolver duplicação celular de células ainda sem marcadores. Devido a esse motivo, a utilização do protocolo de aspiração da medula óssea autógena e concentração de sua fração mononuclear por gradiente de densidade pode ser considerada um método viável. Ela possibilita uma melhora nas propriedades do material de enxertia, com redução substancial do tempo de cicatrização do enxerto e aumento da qualidade óssea na região enxertada que, posteriormente, receberá implantes osseointegráveis. Além do mais, pode-se relatar que o procedimento cirúrgico não tem seu tempo aumentado e que a coleta da medula óssea gera desconforto mínimo na região doadora. Entretanto, cabe lembrar que o caso clínico apresentado no presente artigo faz parte de um estudo clínico prospectivo em humanos e que, portanto, possui aval de um comitê de ética para ser executado. Se a técnica avaliada nesse estudo for considerada válida por outros estudos, existe a possibilidade futura de se tornar clinicamente viável. CONCLUSÃO O uso clínico do concentrado da fração mononuclear da medula óssea, associado ao substituto ósseo xenógeno Bio-Oss em levantamento se seio maxilar, parece repercutir em adequado reparo ósseo, culminando em um menor tempo de cicatrização óssea. Porém, mais estudos, com um número maior de indivíduos, precisam ser executados para consubstanciar essa hipótese. ABSTRACT Stem cells for bone reconstruction in sinus lifting. Bone grafting procedures have been substantially employed in oral rehabilitation. However, patients willing to undergo reconstructive surgery tend to seek less invasive procedures with a less morbid post-operative phase. To this end, less invasive bone reconstruction techniques traditionally use bone substitutes. However, new studies on tissue engineering present bone marrow stem cells in association with bone substitutes as an alternative to improve the biological characteristics of grafting material. Objective: To report a case employing autologous bone marrow aspirate concentrate (with isolation of mononuclear bone marrow) associated with Bio-Oss for maxillary sinus lifting. Results: Five months after the composite grafting procedure (Bio-Oss + bone marrow 50 Dental Pres Implantol. 2014 Jan-Mar;8(1):40-51

Fração mononuclear da medula óssea para reconstrução óssea em levantamento de seio maxilar stem cells concentrate), bone biopsies were extracted after implant placement surgery. Histological images revealed a large amount of vital mineralized tissue. Conclusion: The clinical use of concentrated bone marrow mononuclear fraction associated with Bio-Oss xenograft bone substitute for maxillary sinus lifting seems appropriate for bone repair with reduced bone healing time. Keywords: Stem cells. Bone marrow. Graft survival. Dental implants. Osseointegration. Referências: 1. Costa CE, Pelegrine AA, Fagundes DJ, Simões MJ, Taha MO. Use of corticocancellous allogeneic bone blocks impregnated with bone marrow aspirate: a clinical, tomographic, and histomorphometric study. Gen Dent. 2011;59(5):e200-5. 2. Pelegrine AA, Costa CES, Sendyk WR, Gromatzky A. 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