13 Biofar, Rev. Biol. Farm. Campina Grande/PB, v. 9, n. 1, p. 13-17, março/maio, 2013 ESTUDO COMPARATIVO DE DOIS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DO PEQUI (Caryocar coriaceum Wittm.) Isaac Farias Cansanção 1, Henrique Douglas Melo Coutinho 2 RESUMO - Caryocar coriaceum Wittm. (pequi) é uma espécie abundante Floresta Nacional do Araripe (FLONA). O fruto apresenta altas concentrações de vitaminas A, B1, B2, C e E, óleo e proteínas, além de propriedades amplamente utilizadas na medicina popular. Este trabalho visou comparar dois protocolos de extração de DNA. No primeiro procedimento, o isolamento do DNA foi realizado com a maceração de folhas jovens utilizando o N 2 líquido por meio do CTAB 2%. Para o segundo protocolo, folhas jovens foram submetidas a uma maceração em liquidificador doméstico utilizando tampão de extração com proporções específicas para sua homogeneização. Estas amostras foram quantificadas e analisadas quanto à quantidade do DNA obtido. Uma maior concentração de DNA foi observada nas amostras extraídas por maceração mecânica. A partir destes dados obtidos, o procedimento dois demonstrou ser mais simples e de menor custo, favorecendo assim seu uso laboratorial. Unitermos: genômico, espectrofotometria, lise mecânica, CTAB. COMPARISON BETWEEN TWO METHODS OF GENOMIC DNA EXTRACTION FROM PEQUI (Caryocar coriaceum Wittm.) ABSTRACT - Caryocar coriaceum Wittm. (pequi) is a common plant found on the National Forest of Araripe (FLONA). The fruit presents a high content of vitamins A, B1, B2, C and E; fixed oil and proteins, being also used on the folk medicine due its biological activities. The aim of this work was compare two different protocols of DNA extraction. On the protocol 1, the DNA was isolated from young leaves macerated using liquid nitrogen and CTAB 2%. On the protocol 2, the same kinds of leaves were disrupted using a domestic blender for a mechanical lysis and homogenized with extraction buffer. The two samples were quantified and analyzed to verify the DNA quality. Best quality and higher concentrations of DNA were observed from the protocol 2. Due this results, the protocol 2 shows to combine low costs and simplicity, being a possible method to be used on laboratories and as didactic resource on the schools. Uniterms: genomic, spectrophotometry, mechanical lysis, CTAB. INTRODUÇÃO O gênero Caryocar é autóctone e ocorrente em diversas regiões do Brasil (Macedo, 2005). Algumas espécies são encontradas em savanas, vegetação semelhante ao cerrado Brasileiro, estando presente desde a Costa Rica até o Paraguai (Franco et al., 2004). Caryocar coriaceum Wittm. 1 Biólogo, Mestre em Genética, Universidade Federal do Vale do São Francisco - UNIVASF, Departamento de Ciências da Natureza, São Raimundo Nonato PI, Brasil (isaac.farias@gmail.com); 2 Biólogo, Doutor em Farmacologia, Universidade Regional do Cariri - URCA, Departamento de Química Biológica, Crato CE, Brasil (hdmcoutinho@gmail.com ). * Endereço para correspondência: Henrique D.M. Coutinho: Universidade Regional do Cariri - URCA; Centro de Ciências Biológicas e da Saúde - CCBS; Departamento de Química Biológica; Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular LMBM. 63105-000. Crato, CE Brasil. Fone: +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E Mail: hdmcoutinho@gmail.com Recebido em 20/01/2013 - Aceite para publicação em 27/02/2013 Revista de Biologia e Farmácia. Universidade Estadual da Paraíba. Centro de Ciências Biológicas e da Saúde. Departamento de Biologia. Av. Juvêncio Arruda, s/n, Bodocongó, Campina Grande, PB, BRASIL. Cep: 58.109-753. E- mail: biofar@uepb.edu.br ou biofar.uepb@gmail.com
Estudo comparativo de dois métodos de... (Pequi), uma espécie bem representada do nordeste Brasileiro. Madeira, casca, polpa, folhas e amêndoas são empregados para as mais diversas finalidades pelas comunidades tradicionais (Oliveira, 1988; 2009). A literatura disponível existente retrata que C. coriaceum foi objetivo de trabalhos de análise morfológica, física e química dos seus frutos bem como suas propriedades medicinais, inexistindo pesquisas genéticas até o momento (Saraiva et al., 2008; Oliveira, 2009). O estudo molecular frente a espécies nativas é de grande importância, principalmente em estudos visando o auxílio em programas de melhoramento genético, uma vez que este tipo de planta naturalmente propaga-se por sementes, apresentando grande heterogeneidade em suas características (Silva; Medeiros Filho, 2006; Vera et al., 2007). Entretanto, dependendo da espécie em questão e das condições laboratoriais, são necessárias algumas modificações e adaptações nos protocolos para a obtenção de padrões qualitativos e quantitativos de DNA. Estas adequações acontecem porque algumas plantas apresentam altos níveis de polifenóis e presença de mucilagens foliares que dificultam a extração e amplificação de ácidos nucléicos, necessitando assim de uma otimização que facilite a operacionalização da técnica de extração (Ferreira; Grattapaglia, 1995). Diante deste fato, pretende-se conhecer o nível de Diversidade Genética do pequizeiro (Caryocar coriaceum Wittm.) na Biorregião do Araripe, onde um dos objetivos específicos foi testar e analisar dois protocolos de extração de DNA [método CTAB e SDS via liquidificador] para uma melhor padronização e otimização do DNA dessa espécie na região em destaque. MATERIAIS E MÉTODOS Material vegetal Folhas jovens foram colhidas em áreas preservadas da Reserva Florestal do Araripe. Estas foram estocadas em sacos plásticos, etiquetados e armazenados em recipientes isolantes a 0ºC e posteriormente foram armazenadas em freezer a -20 o C até a extração do DNA. Os protocolos adotados são bastante utilizados e consistentes em estudos genéticos direcionado a plantas, bem como acompanhados com as devidas adaptações necessárias de padronização. Extração de DNA usando o protocolo CTAB O isolamento do DNA genômico foi feito usando 0,5g de folhas jovens para cada amostra de pequi seguindo protocolo descrito por Doyle e Doyle (1990), com modificações. As amostras foram maceradas na presença de N 2 líquido, sendo então transferidas para tubos contendo 6 ml de CATB 2% (brometo de Cetil-Trimetilamônio; Tris-HCl; EDTA) previamente incubados a 65 ºC durante 1h. Em seguida, foi feita uma lavagem com clorofórmio/álcool isoamílico (1 ml) com proporção de 24:1 e centrifugada a 2500 rpm por 15 minutos à temperatura ambiente. Recuperada a fase superior de cada tubo, estes foram conduzidos para tubos autoclavados, adicionando-se dois terços de volume de isopropanol e deixados em temperatura ambiente por 12h. Na sequência, foram centrifugados a 1500 rpm por 3 minutos. Posteriormente, foram adicionados dois volumes de NaCl (1M), mantendo os tubos em solução por 10 minutos e 2,5 volumes de Etanol 100%, seguido de centrifugação a 1500 rpm por 3 minutos para a precipitação do DNA. Após a retirada do sobrenadante, o DNA foi seco e adicionado ao pellet dois volumes de T.E. para ressuspender o DNA. As amostras foram armazenadas a 4ºC, preservando o material até a quantificação. Extração de DNA usando o protocolo SDS via liquidificador Seguindo o protocolo de Milach (1998) com modificações. Foi preparada uma solução com 250 ml de Tampão de Extração (NaCl 5M: 25 ml, Tris-HCl 1M: 25 ml, EDTA 0,25 M: 50 ml, SDS 20%: 15,62 ml, água destilada e estéril: 134,38 ml). Com isso, 10 g de folhas jovens foram adicionadas em um liquidificador doméstico junto com o tampão de extração, a fim de ocorra a marceração. Após 10 minutos, a solução foi depositada em um Becker de 500 ml e incubada a 65 C durante 30 minutos. A solução foi distribuída em 10 microtubos de 2 ml, colocando-os no banho-maria para manter o extrato ressuspendido. Em torno de 10 minutos, os tubos foram retirados 14
Isaac Farias Cansanção et al. e adicionado um volume (650 µl) de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) em cada tubo, e misturados cuidadosamente por inversão por 10 minutos, centrifugando-os a 5000 rpm por 15 minutos. Os sobrenadantes foram removidos e repassados para tubos estéreis, repetindo-se este procedimento por duas vezes. Na sequência, estas amostras foram colocadas no refrigerador a 4ºC e logo após 2 horas foram centrifugadas a 10000 rpm por 15 minutos. Novamente os sobrenadantes foram removidos, e distribuídos em novos microtubos, ressuspendendo com água ultrapura, sendo então armazenados e acondicionados em refrigerador a -20ºC até o momento da análise de quantificação destes materiais. Análise do DNA extraído por eletroforese em gel de agarose A observação do DNA no primeiro protocolo foi realizada em gel de agarose a 1,5%, utilizando um mix de 5 l de DNA e 5 l de corante de corrida (xileno cianol, azul de bromofenol e sacarose), a 80 V/cm durante 1h e analisado em transiluminador. O segundo protocolo foi feito por análise em gel de agarose a 1,5%, numa reação de 4µL de DNA (amostra) e 15µL de corante de corrida (glicerol, T.E. e azul de bromofenol), a 80 v por 1h e analisado em transiluminador. O DNA de seis amostras foi quantificado por espectrofotometria a 260nm e sua pureza analisada pela relação 260/280nm para os dois protocolos citados. RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram detectadas diferenças nos dois protocolos utilizados. O protocolo 1 (Doyle; Doyle, 1990 com modificações) não foi tão eficiente para a extração de DNA de Caryocar coriaceum Wittm. Não foi encontrado material genético nas amostras 05 e 06 utilizadas neste procedimento (Tabela 1). A partir do protocolo 2 (Milach, 1998 com modificações) foi possível extrair uma quantidade maior de DNA. Este protocolo decorreu de modificações nas etapas de extração e centrifugação, facilitando a obtenção de materiais com melhor qualidade e quantidade do que foi encontrado no protocolo anterior e com pequenas parcelas de contaminantes. Os testes qualitativos e quantitativos de DNA foram realizados pelo espectrofotômetro (FEMTO 800 XI) nas seis amostras. A concentração de DNA foi também estimada em relação à sua pureza, de acordo com Sambrook et al. (2001). As amostras do procedimento 1 perfizeram valores de 260 nm entre 0,033 e 0,085, e de 280 nm entre 0,037 e 0,078. Nas amostras do protocolo 2, os valores encontrados de 260 nm foram entre 0,242 e 0,306, e de 280 nm entre 0,197 e 0,263. A relação A260/280 perfez valores entre 0,89 e 1,35 bem como entre 1,12 e 1,40, respectivamente. Tabela 1 - Quantificação e análise de pureza de seis amostras de DNA extraído de Caryocar coriaceum Wittm. a partir de tecido foliar, obtidas pelo método CTAB e SDS, utilizando leituras de absorbância de 260 nm e 280 nm. Amostras CTAB SDS A260 A280 A260/280 [DNA]ng/µ A260 A280 A260/280 [DNA]ng/µL L 01 0,085 0,063 1,35 425,00 0,295 0,262 1,12 1475,00 02 0,075 0,078 0,96 325,00 0,242 0,197 1,23 1210,00 03 0,033 0,037 0,89 95,00 0,299 0,252 1,19 1495,00 04 0,058 0,047 1,23 290,00 0,272 0,216 1,26 1360,00 05 - - - - 0,306 0,263 1,16 1530,00 06 - - - - 0,291 0,207 1,40 1455,00 Segundo Weising et al. (2004) e Kotchoni e Gachomo (2009), o método CTAB tem sido muito utilizado para extração em tecidos frescos e diversos protocolos têm sido desenvolvidos para este fim em todo o mundo. Entretanto, para extração de DNA de C. coriaceum Wittm., alguns procedimentos podem ter favorecido a presença de compostos que ajudam a degradar o DNA no 15
Estudo comparativo de dois métodos de... momento da extração, como polissacarídeos e compostos fenólicos, detentores de grande presença nos vegetais e que possuem um amplo efeito oxidativo nos constituintes celulares. Entretanto, no outro protocolo utilizando SDS, diversos autores evidenciaram uma boa eficiência no isolamento do DNA para estudos de variabilidade genética, sendo também bastante significativo na utilização deste material genético em programas de melhoramento genético de espécies agroindustriais (Figueira et al., 1992; Ahmed et al., 2009). Embora o método utilizado com êxito tenha sido realizado de forma rudimentar, este procedimento garantiu o isolamento do DNA em maior quantidade, com melhor pureza e com menor custo, ainda que seja preciso alguns ajustes a fim de que resulte em um material genético sem contaminantes. Diferentes métodos de extração de DNA surgiram nas últimas décadas, na sua maioria utilizando o nitrogênio líquido (Kotchoni; Gachomo, 2009), ou em menores proporções, fazendo uso da liofilização (Sperisen et al., 2000) ou até raspa de vidro (Huang et al., 2002). O intuito de macerar o tecido foliar é facilitar a separação e o isolamento do material genético, servindo como de ponto de partida para diversos estudos genéticos, como seleção assistida por marcadores moleculares ou mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Loci) (Ferreira; Grattapaglia, 1995). De acordo com Faleiro et al. (1996), a integridade do DNA é de fundamental importância para uma boa reprodutibilidade de produtos amplificadores assistidos por marcadores moleculares. Entretanto, dependendo da quantidade presente de contaminantes no material, o uso destes ácidos nucléicos não inviabiliza a obtenção de padrões nítidos e reprodutíveis por meio da PCR. O procedimento utilizado via liquidificador é pioneiro em técnicas de isolamento de materiais genéticos, podendo então ser empregado, mesmo de forma tão simples, em diversas finalidades científicas como, por exemplo, em estudos de diversidade genética intra e interespecífica, embora os resultados de outros autores tenham sido relatados até o momento utilizando outros meios de maceração mecânica (Faleiro et al., 2008). Este método pode também ser favorável em centros universitários ou instituições de ensino de regiões longínquas, onde possuem dificuldades de obter nitrogênio líquido, e com isso a técnica de extração de ácidos nucléicos possa está mais presente em aulas práticas de biologia ou projetos de pesquisa e extensão, auxiliando assim o entendimento da parte teórica disciplinar. Entre os protocolos testados neste trabalho, o que apresentou melhor resultado foi o de Milach (1998) via liquidificador/sds, modificado para se adaptar à Caryocar coriaceum Wittm., obtendo uma qualidade e quantidade superior em relação ao outro procedimento. Este trabalho pode representar um importante passo para o estudo da espécie vegetal nativa, uma vez que é pioneiro na área da genética de plantas na região, o que auxiliará na execução de um protocolo com menor custo, ampliando a aplicabilidade deste procedimento para outras espécies nativas da Chapada do Araripe. REFERÊNCIAS Ahmed, I.; Islam, M.; Arshad, W.; Mannan, A.; Ahmad, W.; Mirza, B. (2009). High-quality plant DNA extraction for PCR: an easy approach. Journal of Applied Genetics, 50: 105-107. Doyle, J.J.; Doyle, J.L. (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12: 13-15. Faleiro, F.G.; Araújo, I.S.; Bahia, R.C.S.; Santos, R.F.; Yamada, M.M.; Anhert, D. (1996). Otimização da extração e amplificação de DNA de esporos de Uromyces appendiculatus. Fitopatologia Brasileira, 21: 304-307. Faleiro, F.G.; Bellon, G.; Pereira, A.V.; Pereira, E.B.C.; Junqueira, N.T.V.; Vieira, E.A.; Dunboc, E.; Sano, S.M.; Melo, J.T.; Fernandes, F.D. (2008). Variabilidade genética de coleção de trabalho de pequizeiro com base em marcadores moleculares. In: IX Simpósio Nacional do Cerrado e II Simpósio Inernacional de Savanas Tropicais. Brasília, EMBRAPA Cerrados, Brasil. 16
Isaac Farias Cansanção et al. Ferreira, M.E.; Grattapaglia, D. (1995). Introdução ao uso de marcadores. RAPD e RFLP em análise genética. Brasília, EMBRAPA-CENARGEN. Documento 20, Brasil, 220 p. 17 Figueira, A.; Janick, J.; Goldsbrough, P. (1992). Genome size and DNA polymorphism in Theobroma cacao. Journal of American Society of Horticulture Science, 117: 673-677. Franco, L.M.L.; Ummus, M.E.; Luz, R.A. (2004). A distribuição do Pequi (Caryocar brasiliense) na estação ecológica de Itirapina, SP. In: Congresso Brasileiro de Geógrafos. AGB, Goiânia, Brasil. p. 253. Huang, Y.L.; Shi, S.H.; Zhong, Y.; Tan, F.X. (2002). A new method for preparation of template DNA for PCR from special plant materials. Chinese Science Bulletin, 47: 725-727. Kotchoni, S.O.; Gachomo, E.W. (2009). A rapid and hazardous reagent free protocol for genomic DNA extraction suitable for genetic studies in plants. Molecular Biology Reports, 36: 1633 1636. Macedo, J.F. (2005). Pequi: do plantio à mesa. EPAMIG, Belo Horizonte, Brasil. 44p. Milach, S.C.K. (1998). Principais tipos de marcadores moleculares e suas características. In: Milach SCK. Marcadores Moleculares em Plantas. UFRGS, Porto Alegre, Brasil. Oliveira, M.E.B. (2009). Características físicas, químicas e compostos bioativos em pequis (Caryocar coriaceum Wittm.). Tese. Recife: Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil. 146p. Oliveira S. (1988). Pequi. Globo Rural, 4: 80-83. Sambrook, J.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T.; Russell, D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Jersey, USA, 1659p. Saraiva, R.A.; Leite, G.O.; Oliveira, R.C.; Araruna, M.K.A.; Menezes, K.D.P.; Pereira, C.K.B.; Costa, J.G.M.; Campos, A.R.; Menezes, I.R.A. (2008). Topical anti-inflammatory activity of Caryocar coriaceum Wittm. (Caryocaraceae) pulp fruit and seed oils. 4th Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry, Brasil. Silva, M.A.P.; Medeiros Filho, S. (2006). Morfologia de fruto, semente e plântula de piqui (Caryocar coriaceum Wittm.). Revista de Ciência Agrárias, 37: 320-325. Sperisen, C.; Gugerli, F.; Büchler, U.; Mátyás, G. (2000). Comparison of two rapid DNA extraction protocols for gymnosperms for application in population genetic and phylogenetic studies. Genetics, 7: 133 136. Vera, R.; Souza, E.R.B.; Fernandes, E.P.; Naves, R.V.; Soares Júnior, M.S.; Caliari, M.; Ximenes, P.A. (2007). Caracterização física e química de frutos do pequizeiro (Caryocar brasiliense Camb.) oriundos de duas regiões no estado de Goiás, Brasil. Pesquisa Agropecuária Tropical, 37: 93-99. Weising, K.; Nybom, H.; Wolff, K.; Kahl, G. (2004). DNA fingerprinting in plants. CRC Press, Boca Raton, USA, 322p.