1 Aplicações da citometria de fluxo na pesquisa farmacológica de plantas medicinais Me. Ruberlei Godinho de Oliveira Doutorando em Biotecnologia UFMT Bionorte Docente na Universidade de Cuiabá-MT
Cito metria de fluxo 2 Utiliza dos princípios básicos da fluorimetria. Célula Medida Movimento É uma poderosa tecnologia, que possibilita a análise simultânea de múltiplas características de uma célula (análise multiparametrica). Podem ser analisadas: Qualquer partícula ou célula em suspensão, com tamanho entre 0,2 a 50 µm. Células de tecidos sólidos precisam ser desagregadas e colocadas em suspensão antes da análise.
O que o citômetro nos diz sobre as células? 3 Tamanho relativo (SSC) Granulosidade ou complexidade (FSC) Intensidade de fluorescência (marcação)
Como funciona? 4 Combinação de 3 sistemas: Sistema Fluido; Sistema Óptico; Sistema Eletrônico;
Sistema de Fluidos 5 Transporta as partículas em um fluxo de fluido em direção ao feixe de laser para interceptação; Posiciona e alinha o fluxo da amostra no centro do feixe de laser, permitindo que uma única célula ou partícula passe pela luz do laser em um dado momento; Sistema pressurizado.
Sistema de Fluidos 6 Fluxo Laser
Sistema Óptico 7 Componentes de Excitação (Lasers, prismas e lentes) Componentes de Coleta (Lentes, espelhos, filtros e fotodetectores) Excitação Emissão
Sistema Óptico 8 Componentes de Excitação - Lasers e lentes
Sistema Óptico 9
Sistema Óptico 10 Componentes de Coleta - Lentes coletoras: Captam a dispersão e a luz fluorescente emitida pelos fluoróforos que são excitadas pelo feixe de laser (Convergência do sinal, alinha em uma direção inicial). - Espelhos e Filtros Ópticos: Direcionam a luz emitida, selecionando o comprimento de onda determinados - Fotodetectores: Recebem a informação óptica que será digitalizada e armazenada em um computador
Sistema Óptico Filtros Ópticos coletar sinais de luz 11 Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu número é deixado passar e menor que seu número é refletido. Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu número é deixado passar e acima de seu número é refletido. Espelhos BP (bandpass) = deixa passar o comprimento de onda compreendido em um intervalo especificado. Longpass Shortpass Bandpass 460 500 540 460 500 540 460 500 540 LP 500 SP 500 Detector célula fotoelétrica
Sistema Óptico 12
Voltagem Voltagem Voltagem Tempo Sistema Eletrônico 13 Converte os sinais ópticos em sinais eletrônicos proporcionais. Componentes: Fotodetector, amplificador, processador e computador. Pulso de voltagem ; Laser Tempo Laser Tempo Laser
Sistema Eletrônico 14 Dos pulsos de voltagem pode-se medir: Área Altura Height Dispersão ou intensidade do foton capturado Largura Width Tempo de passagem da partícula no feixe de laser
FITC FITC Sistema Eletrônico 15 Armazenamento e visualização dos dados FSC SSC FITC PE Event 1 60 120 840 638 Event 2 Event 3 160 65 650 160 85 156 245 612 1000 1000 800 840 800 600 600 400 400 200 0 0 200 400 600 800 1000 PE 85 200 0 0 200 400 600 800 1000 PE 245 638
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FSC x SSC 20 Detector de dispersão de luz frontal 0.5 a 5º Tamanho celular FSC (Forward Scatter) Fonte de Luz Incidente: Laser de Argônio a 488 nm Detector de dispersão de luz em ângulo reto 15 a 150º Complexidade celular SSC (Side Scatter)
FSC (Forward Scatter): Tamanho 21 celular
Side Scater (SSC):Complexidade: 22 Reflexão a 90
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Fatores que influenciam a 24 dispersão de luz Forma Tamanho Presença de grânulos Complexidade interna dos diversos tipos celulares
Visualização dos dados 25
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Detecção de Fluorescência 27 FSC Fonte de Luz Incidente: Laser de Argônio a 488 nm SSC Detectores de Fluorescência: FL1 FL2 FL3
Compensação overlap 28
FL1-%FL2 FL2-%FL1 Compensação overlap 29 SOBREPOSIÇÃO
SUBCOMPENSADO SUPERCOMPENSADO OTIMIZADO 30
Número de Eventos A Fluorescência é proporcional a quantidade de anticorpo ligada a células 31 PE PE PE PE PE PE PE PE PE PE Intensidade de Fluorescência
Fluoróforos 32 Típicos fluorocromos 488 nm excitation 633 nm Fluorescein (FITC) 512 green Allophycyanin APC 660 Alexa 488 515 green Cy5 670 Phycoerythrin (PE) 565 yellow APC Cy7 770 Cyanine 3 (Cy3) 570 yellow PE-Texas Red (ECD) 620 red PE-Cy5 (PC5) 665 deep red Peridin-chlorophyll (PerCP) 670 deep red PE-Cy5.5 (PC5.5) 695 deep red PE-Cy7 (PC7) 755 far red 405 nm Alexa 405 440 Pacific Blue (PB) 440 Cascade Blue (CB) 440
Intrínsecos Extrínsecos Aplicações Estruturais Morfologia da célula Proteínas fluorescentes Conteúdo de DNA e RNA Taxa de DNA Estrutura cromatínica Proteínas totais ou básicas Grupos químicos Antígenos Açúcares de superfície Estrutura citoesqueleto Funcionais 33 Estado Redox Proliferação celular Ativação celular Apoptose Estudos da membrana celular Atividade enzimática Endocitose Síntese de DNA Receptores Potencial de membrana ph, cálcio, carga de superfície
Anexina V/Iodeto de Propídeo 34 Determinação de apoptose Anexina V V PI Membrana Plasmática Fosfatidilserina Núcleo
Determinação da ativação de caspases 35
Ensaios de proliferação celular 36 Ensaio de proliferação; 5-bromo-deoxyuridina incorporado durante síntese de DNA; Análogo da timina; Detecção: métodos enzimáticos, anticorpos fluorescentes, imuno-histoquímica;
Ensaios de proliferação celular Ciclo celular 37
MAPK Quinases ativadas por 38 mitogenos Basal CN BD CBA Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit Phosphorylated Human NF-κB p65 Peptide Estimulado Marcação Aquisição Analise dos dados
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MAPK Quinases ativadas por mitogenos 40
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Detecção intracelular de 43 citocinas Beads magnéticas
Vantagens 44 Analise simultaneamente múltiplas citocinas ( 30) requisitos de volume reduzido da amostra; Requer menos diluições de amostras - relevância estatística alta; 300 Beads medidos por citocina Æequivalent de 300 poços de ELISA Reduzido hands-on tempo com análise paralela de amostras - ampla faixa dinâmica (fluorescência);
Dosagem de citocinas 45 Brefeldina A Dependendo da célula e o estímulo realizado a retenção de citocinas nas células ocorre com picos de 4h (para TNF-γ), 8h (para INF- γ e IL2) e mais de 12h (para IL-12). Não estimulada Brefeldina A, 100 ng/ml 1,5 horas Brefeldina A, 20 µg/ml
Dosagem de citocinas 46 1 ng/ml LPS 10 µg/ml BFA 0,01 µg/ml LPS
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Vantagens x Desvantagens 51 Vantagens: Mede múltiplos parâmetros individuais; Grande número de células analisadas com rapidez; Avaliação da heterogeneidade de células; Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos; Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares; Desvantagens: Custo do equipamento; Mão de obra especializada;
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