HIV 1 & 2 TriSpot Ag - Ab

. HIV 1 & 2 TriSpot Ag - Ab B Para iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da placa reveladora. O Pente é então inserido nas cavidades da fileira A. Os anticorpos anti-hiv, se presentes na amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos recombinantes no primeiro e/ou segundo ponto do dente do pente (Figura 1). Simultaneamente, se o antígeno p24 estiver presente na amostra, será capturado pelos anticorpos anti-p24 do terceiro ponto. Componentes não ligados são removidos por lavagem na fileira B. Na fileira C, os analitos capturados no dente irão reagir com os antígenos de superfície HIV-1 e/ou HIV-2, e com os anticorpos anti-hiv-1 p24, respectivamente marcados com biotina. Na fileira D, um segundo conjugado fosfatase alcalina-estreptavidina irá reagir com o resíduo de biotina nos complexos formados e com o controle interno, no ponto superior do dente. Na próxima fileira (E), os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com os componentes cromogênicos. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. Anticorpo do HIV e captura do p24 Ag; 30 min. / Temp. Amb. Anti-HIV-1 p24 HIV Ag HIV-1 p24 Anti-HIV Ab Ligação do biotinilado anti-p24 e do biotinilado HIV Ag; 30 min. / Temp. Amb. Biotinilado anti-p24 Biotinilado HIV Ag Código 60433002 Apenas para diagnóstico In Vitro Formato: 3 x 12 Testes Avidina - AP Ligação da Avidina AP; 10 min. / Temp. Amb. O kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab é um teste (EIA) para detecção qualitativa e diferencial de anticorpos da imunodeficiência humana dos vírus tipos 1 e 2 (HIV-1 e HIV-2) e, simultânea detecção do antígeno do HIV-1 p24 em plasma ou soro humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit. Introdução O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é um retrovírus, identificado em 1983 como o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Foram diferenciados dois sub-tipos, HIV-1 e HIV-2. As principais vias de transmissão do vírus HIV são: contato sexual, contaminação pelo sangue ou produtos do sangue e transmissão da mãe para o recém-nascido. As principais células infectadas pelo HIV são os linfócitos T4, que desempenham um papel chave no sistema imune humano. A diminuição progressiva do nível de T4 durante o desenvolvimento da doença leva a infecções oportunistas, com conseqüências fatais. O vírus HIV é formado por uma molécula de RNA genômica protegida por um capsídeo e um envelope. O envelope do vírus é o alvo principal para a resposta humoral de anticorpos. Os diagnósticos sorológicos de infecção por HIV são baseados na detecção específica de anticorpos para as proteínas do envelope do HIV. Entretanto, recentemente foi introduzida uma quarta geração de testes, onde dois ensaios teste para anticorpos e detecção do antígeno viral GAG p24 foram combinados. A detecção simultânea destes dois marcadores reduz o período da soroconversão para 7 a 10 dias o que permite a detecção antecipada da infecção pelo HIV. Princípio do Teste O teste ImmunoComb II HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab é um ensaio imunoenzimático direto (EIA) em fase sólida. A fase sólida é um pente com doze projeções ( dentes ). Cada dente é sensibilizado em quatro pontos: Primeiro ponto (inferior) antígeno recombinante do envelope HIV-1 Segundo ponto antígeno recombinante do envelope HIV-2 Terceiro ponto Anticorpo monoclonal para o HIV-1 p24 Quarto ponto (superior) Albumina do soro bovino biotinilado (Controle interno) A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) com 12 cavidades, cada fileira contém uma solução de reagente pronta para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o pente de fileira em fileira com incubação em cada etapa. Figura 1. Princípio do Teste O kit inclui um Controle Positivo (contendo anticorpos para HIV-1 e HIV-2, e antígeno HIV-1 p24) e um Controle Negativo, para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado para o Controle Positivo deverá mostrar os três pontos cinza azulados juntamente com o ponto superior. O ponto superior deverá ser o único visível no dente usado para o controle negativo. O ponto superior deverá também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar que o kit está funcionando adequadamente e que o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com quatros áreas reativas: Primeiro ponto (inferior) proteína recombinante HIV-1 (a glicoproteína env gp41) Segundo ponto proteína recombinante HIV-2 (a glicoproteína env gp36) Terceiro ponto Anticorpo monoclonal para a proteína HIV-1 p24 Quarto ponto (superior) Albumina do soro bovino biotinilado (Controle interno) ImmunoComb II 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 Figura 2. Pente Substrato cromogênico Reação de cor enzimática; 10min. / Temp. Amb. Controle interno Ponto do HIV-1 p24 Ag Ponto do HIV-2 Ab Ponto do HIV-1 Ab 60433002/B4/OR 1

Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras cobertas por uma folha de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) com 12 cavidades cada. Cada fileira possui o seguinte conteúdo: Todas as amostras congeladas devem ser centrifugadas a 10.000 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente a amostra do sobrenadante. Se uma camada lipídica é formada na superfície do líquido, garantir que a amostra seja colhida a partir do líquido transparente abaixo da camada. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Os resultados do teste não foram afetados por anticoagulantes como heparina, EDTA e Citrato de sódio. Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Fileira F Diluente de amostra Solução de lavagem Antígenos do envelope HIV-1 e HIV-2 e anticorpos anti-hiv-1 p24, marcados com biotina ALP-marcada com estreptavidina Solução de lavagem Solução de substrato cromogênico contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) Figura 3. Placa Reveladora Procedimento do Teste Material Necessário Pipeta de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 50 μl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Preparando o Teste Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura ambiente (22-26ºC). Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 20 minutos; ou deixar a temperatura ambiente (22-26ºC) por 3 horas. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando indicado, nas instruções do Teste. Controle Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 0,5 ml de plasma humano diluído, positivo para anticorpos anti-hiv-1 e anti-hiv-2, e antígeno p24 recombinante, inativado pela adição de ß -propilactona e pelo calor. Controle Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,5 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para HIV. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. Segurança e Precauções Embora tenha sido inativado, trabalhe com o controle positivo como potencialmente infeccioso. Todos os outros materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B e para os anticorpos dos vírus da hepatite C e do HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos laboratoriais aceitos para trabalhar com soro ou plasma humano. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes*, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. Armazenamento e Estabilidade do Kit Kit é fornecido a temperatura de 2 a 8ºC. Durante o transporte o kit pode suportar temperaturas 30ºC por curtos períodos de tempo não excedendo o total de 48 horas. Os controles internos indicam que o kit não foi danificado durante o transporte. Armazenar o kit na embalagem original de a temperatura de 2 a 8ºC. Não congelar o kit. Após a primeira utilização do kit os componentes devem ser armazenados de 2 a 8ºC. A performance do kit após a primeira utilização é estável até a data de validade do mesmo, quando armazenados de 2 a 8ºC. Após a primeira utilização, o pente e a placa não podem ser usados mais do que três vezes. Manipulação de Amostras Pode ser testado tanto amostras de soro como plasma. As amostras podem ser armazenadas por 72 horas de 2-8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a - 20 ºC ou inferior. * Menos aqueles arquivados para documentação Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Será necessário um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 33 do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clip, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 a 8ºC para uso posterior. Figura 4. Quebrando o Pente ImmunoComb II 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Instruções do Teste Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 1. Pipetar 50 μl de amostra. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira. 2. Repetir o passo 1 para as outras amostras, incluindo um Controle Positivo e um Negativo fornecidos com o kit. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 3. a)inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias vezes. b)deixar o Pente na fileira A por exatamente 30 minutos. Ajustar o cronômetro. Misturar mais duas vezes durante a incubação. Próximo do final dos 30 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. 60433002/B4/OR 2

c)no final dos 30 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual da ponta dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes. Primeira Lavagem (Fileira B) 4. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades e deixar pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 3c. Ligação do Conjugado marcado com biotina (Fileira C) 5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar o pente diversas vezes. Ajustar o cronômetro para 30 minutos. Misturar como no passo 3b. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 30 minutos, tirar o Pente e absorver o líquido residual. Ligação do conjugado ALP marcado com estreptavidina (Fileira D) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Misturar como no passo 3b; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira E. Após 10 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Terceira Lavagem (Fileira E) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar como em 3a. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Misturar como no passo 3b. Após 10 minutos, retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 9. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto, retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, pode-se guardá-la para uso futuro: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar de 2 a 8ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja Figura 5): 1. O Controle Positivo deve produzir quatro pontos no dente do Pente. 2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle Interno) e mais nenhum outro ponto 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle Interno). Isto também confirmará que o teste foi feito corretamente. Se alguma destas três condições não forem cumpridas, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Controle Positivo Controle Negativo Resultados Inválidos Figura 5. validação do teste Interpretação dos Resultados 1. Apenas o aparecimento do ponto superior (controle interno) indica que a amostra é não-reativa para os anticorpos HIV-1 ou HIV-2 e para o antígeno HIV-1p24 (figura 6a). 2. Uma coloração circular no ponto inferior indica a presença de anticorpos HIV-1 (figura 6b) 3. Uma coloração circular no segundo ponto indica a presença de anticorpos para HIV-2 (figura 6c). Ás vezes, altas concentrações de anticorpos anti-hiv-2 podem produzir um ponto secundário em adição a este ponto principal, obtido com o antígeno homólogo. Neste caso (figura 6d), os resultados devem ser considerados como infecção por HIV-2 ou de co-infecção HIV-1/HIV-2. 4. Uma coloração circular no terceiro ponto indica a presença do antígeno HIV-1 p24 (figura 6e). O ponto do antígeno p24 pode aparecer juntamente com o primeiro ponto, o ponto do anticorpo HIV- 1 (figura 6f), ou juntamente com o segundo ponto, o ponto do anticorpo HIV-2 (figura 6g) ou juntamente com ambos os pontos (figura 6h). a) Nem HIV Ab ou Ag e) Presença de HIV p24 Ag Figure 6. Resultados dos testes Importante: A presença de anticorpos HIV-1 ou HIV-2 e antígeno HIV-1 p24 em uma amostra testada deve ser confirmado por um ensaio confirmatório. Qualquer ponto fracamente colorido no dente deve ser interpretado como reativo e deve ser investigado. Documentação dos Resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação. Limitações O ImmunoComb II HIV 1&2 TriSpot Ag-Ab é um teste de triagem. A reatividade para anticorpos para HIV-1/HIV-2 não deve ser considerada um diagnóstico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) ou da infecção pelo HIV. Um resultado negativo com este teste não deve ser considerado como evidência conclusiva de que o paciente não tenha sido exposto ao ou infectado pelo HIV. Características de Desempenho* As características de Desempenho ImmunoComb II HIV 1&2 TriSpot Ag-Ab foram determinadas através de testes em quatro locais de avaliação, testando amostras de pacientes com infecção por HIV-1 e HIV-2, infecção primária ou aguda por HIV (PHI), painéis de soroconversão, pacientes infectados não-hiv, doadores saudáveis e pacientes com outras doenças. Os resultados estão resumidos nas tabelas 1 e 2 Tabela 1: Sensitividade Locais do Estudo Clínico b) Presença de Anti- HIV-1 Ab f) Presença de Anti- HIV-1 Ab e p24 Ag c) Presença de Anti- HIV-2 Ab g) Presença de Anti- HIV-2 Ab e p24 Ag Amostras HIV-1 HIV-2 HIV p24 Positivas Ab Ab Ag (PHI) Testadas Sensitividade (%) d) Anti-HIV-2 ou coinfecção HIV-1/HIV-2 co-infection h) Anti-HIV-2 ou coinfecção HIV-1/HIV-2 e presença de p24 Ag Sensitividade Geral (%) Orgenics, 552 100 100 100 100 Rambam Medical Center, 127 100 ND 100 100 Gonesse Medical Center, 163 100 100 100 100 França Institute of Tropical Medicine, 204 100 100 100 100 Bélgica Total 1.046 100 100 100 100 Grupos HIV-1 e subtipos. Foram testadas 103 amostras HIV-1 de vários sub-tipos (A a J), CRFs (formas recombinantes circulantes) e do grupo O. Todas as amostras foram detectadas no fim do teste. Amostras de infecção primária por HIV e painéis de soroconversão Foram testados 27 painéis comerciais, 25 painéis clínicos de soroconversão e 20 amostras PHI coletadas de indivíduos em estágio inicial da infecção. Na maioria dos painéis, o kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab detectou a infecção antecipadamente, ao menos uma coleta (2 a 16 dias) do que os kits de referência de 3ª geração. 60433002/B4/OR 3

Tabela 2: Especificidade Locais do Estudo Clínico Amostras HIV-1 HIV-2 HIV p24 Ag Negativas Ab Ab (PHI) Testadas Especificidade (%) Orgenics, 1.373 99,8 100 99,8 Rambam Medical Center, 111 100 100 99,1 Gonesse Medical Center, França 298 99,0 100 100 Istitute of Tropical Medicine, Bélgica 200 98,0 100 99,5 Total 1.982 99,5 100 99,8 A especificidade geral é 99,3% Versão: 60433002/B4/OR (04/2010) BIBLIOGRAFIA 1. Constantine NT. 2001. HIV antibody testing,. In P.T. Cohen, M.A. Sande, and P.A. Volberding (ed.), InSite HIV Knowledge Base Chapter, UCSF Center for HIV Information, September 2001. 2. Courouce AM and the Retrovirus Workgroup at the S.F.T.S. 1999. Combined screening tests for anti-hiv antibodies and p24 antigen. La gazetta de la Transfusion, 155:4-18. 3. Grant AD, De Cock KM. 2001. HIV infection and AIDS in the developing world. British Med. Journal, 322: 1475-1478. 4. Janssen RS et al. 1998. New testing strategy to detect early HIV-1 infection for use in incidence estimates and for clinical and prevention purposes. JAMA 280:42-48. 5. Schacer TW, Hugu JP, Shea T, et al. 1998. Biological and virological characteristics of primary HIV infection. Ann. Intern. Med. 128: 613-620. 6. UNAIDS/WHO. 2002. Joint UN programme on HIV/AIDS (UNAIDS) Report on the Global HIV/AIDS epidemic, p. 1-226. Geneva. 7. Weber B, Fall EH, Berger A, Doerr HW. 1998. Reduction of diagnostic window by new fourth-generation human immunodeficiency virus screening assays. J Clin. Microbiol. 36(8)2235-2239 Registro e Distribuição: QUANTUM DIAGNÓSTICOS LTDA Av.José Cândido da Silveira, 2100 - Cidade Nova Belo Horizonte - MG - CEP: 31.170-000 CNPJ: 05.524.816/0001-38 Atendimento ao consumidor (31) 2122-2951 ou (31) 2122-2982 (31) 21222944 astec@prodimol.com.br Registro MS: 80242750039 Resp. Técnico: Humberto Decerega Mendez CRQ-MG 02300433 CONSERVAR ENTRE 2-8ºC Lote Vide Embalagem Data de Validade Vide Embalagem SOMENTE PARA USO DIAGNOSTICO in vitro Versão: 60433002/B4/OR (04/2010) 60433002/B4/OR 4

Resumo dos Principais Procedimentos do Teste 1 2 3 4 Pré-incubação da Placa Reveladora: 3 hrs a temperatura ambiente ou 20 min a 37ºC Aspirar amostras e controles Adicionar amostras e controles na fileira A. Misturar Remover o pente da embalagem Inserir o pente na fileira A e misturar. Incubar 5 Abrir a fileira B 6 7 8 Absorver o líquido Inserir o Pente e agitá-lo na residual do Pente fileira B. Incubar Após misturar/agitare incubar nas fileiras C,D e F 9 10 Reação de cor na fileira F Resultados Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab. (Para instruções detalhadas, por favor, ver o texto completo). 1. Trazer todos os componentes, Placas Reveladoras, Pentes, reagentes e amostras para a temperatura ambiente e realize o teste à temperatura ambiente (22 a 26ºC). 2. Dispense 50 μl de cada amostra e controle em cavidades separadas da fileira A da Placa Reveladora e misture. 3. Insira o Pente na fileira A e continue como descrito na Tabela 1: Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste. Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misture; incube por 30 minutos; absorva 1 Lavagem B Agite; incube por 2 minutos; absorva Ligação dos conjugados de biotina C Misture; incube por 30 minutos; absorva Ligação da ALP-Estreptavidina D Agite; incube por 10 minutos; absorva Lavagem E Agite; incube por 2 minutos; absorva Reação de cor F Misture; incube por 10 minutos Reação de parada E Incube por 1 minuto; seque ao ar livre 2 Dobrando e quebrando o Pente 60433002/B4/OR 5