Morte Celular Programada Morte Celular Programada I Prof a. Luciana B. Chiarini Sala: G2-04, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho Centro de Ciências de Saúde Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ. Ocorrência Funções Apoptose: características morfológicas e bioquímicas. - Mecanismos: 1) Caspases: - Via extrínseca - Via intrínseca (mitocondrial) 2) Família Bcl-2: - proteínas pró e anti-apoptóticas - controle da expressão de genes da família Bcl-2 - controle de proteínas da família Bcl-2 por fosforilação Em 1966... 1951 First recognition that cell death is a normal component of animal development. Glücksmann, A. Cell death in normal vertebrate ontogeny. Biol. Rev. 29, 59-86 (1951). ANI CHX 1965 Programmed cell death as a series of events that culminate in the death of the cell. (1965, Lockshin R.A) Morte Celular Programada A morte celular programada é necessária para a formação de estruturas. Programmed cell death as a sequence of events based on cellular metabolism that lead to cell destruction. Morte celular programada Invaginação do epitélio ex: formação do tubo neural. Evaginação do epitélio. Ex: formação da vesícula óptica. Fusão do epitélio: ex: formação de estruturas como o palato 1
A Morte Celular Programada é necessária na destruição de estruturas. Alzheimer Parkinson Controlar o número de células Doenças de Prion Células em excesso são geradas durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Estas células morrem por morte celular programada Huntington Ex: humanos e camundongos: tecido mamário em machos. Excesso de morte celular: doenças neurodegenerativas Morte celular Programada: para eliminação de células com lesão no DNA, células infectadas por vírus,... Ocorrência de MCP durante o desenvolvimento e no adulto - na formação de estruturas (dedos, coração, palato, retina,...) - no controle do número de Células (sistema nervoso, Céls.. pigmentadas da retina,...) Inibição da morte celular programada e tumorigênese. Morte Celular Programada - na destruição de estruturas ( cauda do girino, Tecido mamário em machos,...) - na eliminação de célula Anormais (lesão no DNA, Infectadas,...) Kerr et al 1972. necrose Necrose x Apoptose apoptose necrose Kerr et al 1972. Necrose x Apoptose apoptose Características da necrose: - aumento do volume do citoplasma; - destruição de organelas; - rompimento da memb. Plasmática com extravasamento do conteúdo intracelular; - reação inflamatória. 2
Características da apoptose: Moléculas envolvidas no reconhecimento e fagocitose de células apoptóticas Condensação do núcleo e do citoplasma; Formação de circunvoluções na membrana; As organelas intracelulares permanecem intactas até quase o final do processo. A célula é fragmentada em corpos apoptóticos, não ocorrendo extravasamento do material citoplasmático; A célula morta, normalmente, é encontrada entre células vivas e é removida do tecido por células vizinhas ou por fagócitos especializados, pela exposição de sinais de reconhecimento em sua superfície. Somersan e Bhardwaj, 2001 Fragmentação Internucleossomal do DNA e condensação da cromatina A capacidade de detectar células apoptóticas impulsionou os estudos sobre este tipo de morte celular programada. TUNEL Clivagem internucleossomal do DNA em fragmentos múltiplos de 180-200 pares de bases. Morte Celular Programada não é sinônimo de apoptose. Apoptose é um tipo de morte celular programada. Mecanismos moleculares que controlam a APOPTOSE 3
Programa genético para indução de Apoptose ANI CHX ANI CHX APOPTOSE Act D Act D Genes Pró-apoptóticos Genes Anti-apoptóticos CASPASES: Alvos de Caspases: - cisteína proteases que clivam substratos específicos após resíduos de aspartato. - a especificidade é determinada por uma sequência de 4aa e pela estrutura tridimensional da proteína alvo. -Procaspases são divididas em duas classes: Caspases iniciadoras e efetoras Alvos de Caspases: Inibidor de (Caspase-Activated DNAse degradado DNAse) por caspases Ativação de Caspases Efetoras 4
Ativação de Caspases Efetoras Caspases iniciadoras (caspase( caspase-9, caspase-8): Ativação por dimerização Vias Extrínseca de ativação da Caspases 1 RECEPTOR DE MORTE Death Inducing Signalling Complex Ligante extracelular (FasL,, TRAIL, TNF-alfa alfa). Receptor de Morte caspase-3 caspase-8 Proteína adaptadora Dímero de Caspase-8 APOPTOSIS Formação do complexo DISC com recrutamento e ativação de caspases iniciadoras. Via Intrínseca, mitocondrial, de ativação da Caspases CITOCROMO C ENDONUCLEASE G SMAC/DIABLO caspase-3 caspase-9 CITOCROMO C AIF OMI/HTRA2 APOPTOSIS MOMP (mitochondrial( outer membrane permeabilization) 5
Cell.. Vol. 90 405-413, 413, August 8, 1997. Apaf-1, a Human Protein Homologous to C. Elegans CED-4, Participates in Cytochrome C-Dependent Activation of Caspase-3 Zou,, H. et al Apoptotic Protease Activating Factor-1 Cell Vol 91, 479-489, 489, November 14, 1997 Cytochrome c and datp-dependent Formation of Apaf-1/ 1/Caspase-9 Complex Initiates na Apoptotic Protease Cascade Peng,, Li Apaf-3 was identified as a member of the caspase Family, caspase-9. Fenótipo semelhante de knockout para caspase-3, caspase-9 9 ou Apaf-1. Brain Hyperplasia E16,5 Caspase 3 ativada: rosa Bisbenzimida (DNA): azul E 15 VIAS DE ATIVAÇÃO DE CASPASES 1 RECEPTOR DE MORTE 2 caspase-8 Liberação Como de citocromo ocorre a C da mitocôndria é controlada liberação de citocromo C por proteínas da Família Bcl-2 da mitocôndria? caspase-9 caspase-3 Filme APOPTOSE 6
Classificação da família Bcl-2: de acordo com domínios conservados Proteínas Pró-apoptóticas e Bak formam oligômeros na membrana mitocondrial externa permitindo a saída de citocromo C da mitocôndria para o citoplasma Bcl-2 Bcl-2 Morte celular sobrevivência Bcl-2 2 bloqueou condensação da cromatina induzida por tunicamicina Bcl-2 2 bloqueou condensação da cromatina induzida por tunicamicina 7
Família Bcl-2 é composta por membros PRO e ANTI-apoptóticos Proteínas BH3 BH3-only são pró-apoptóticas Archives of Biochemistry (anti-apoptóticos) and Biophysics 462 (2007) 150-155. 155. BH3-only proteins trigger cytochrome c release, but how? Georg Häcker, Arnim Weber.? Bad Bad Bcl-2 Bcl-2 sobrevivência Morte celular Interações dos membros da Família Bcl-2 2 regulam a sobrevivência e morte celular 8
Proteínas da Família Bcl-2 moduladas por fosforilação MECANISMOS MOLECULARES DE CONTROLE DA FAMÍLIA Bcl-2 Bad Bad Bcl-XL AKT/PKB PKA Bad Bad 14-3-3 P P Bcl-XL Morte celular sobrevivência Sinais extracelulares regulam a expressão de genes da família Bcl-2 Ex: Bim pode ser fosforilada pela ERK Neurotrofinas, citocinas P Foxo3a Bim Sobrevivência ERK fosforila Bim e Não ocorre apoptose Ausência de suporte trófico Foxo3a Bim Morte celular - Suporte Trófico ativa via da Pi3K-PDK PDK-PKB/AKTPKB/AKT - PKB/AKT fosforila Foxo3a e o mantém inativado. - Na ausência de suporte trófico ocorre desfosforilação do fator de transcrição Foxo3a - Foxo3a ativa a transcrição de Bim (pró-apoptótica). 9
Proteínas da Família Bcl-2 2 Moduladas por Clivagem Cross-talk entre via intrinseca e via extrinseca P53 + P53 + Noxa p53 P53 + Puma Pró-apoptóticos Morte celular IAP Inibidores de apoptose IAP Inibidores de apoptose MORTE CELULAR PROGRAMADA ATIVADA PELA 10
CITOCROMO C CITOCROMO C SMAC/DIABLO SMAC/DIABLO ENDONUCLEASE G ENDONUCLEASE G AIF OMI/HTRA2 AIF OMI/HTRA2 MOMP (mitochondrial( outer membrane permeabilization) MOMP (mitochondrial( outer membrane permeabilization) Morte Celular Programada ativada pela Mitocôndria CITOCROMO C ENDONUCLEASE G SMAC/DIABLO AIF OMI/HTRA2 MOMP (mitochondrial( outer membrane permeabilization) CITOCROMO C ENDONUCLEASE G SMAC/DIABLO O AIF leva à condensação do núcleo e clivagem do DNA em fragmentos de aproximadamente, 50 Kb. No entanto, o AIF não cliva diretamente o DNA. Atividade redox na mitocôndria pode ser anti-apoptótica apoptótica AIF OMI/HTRA2 A endonuclease G degrada o DNA sem ocorrer ativação de CAD (caspaseactivated DNAse). 11
1 RECEPTOR DE MORTE 2 Ausência Tunicamicina, de caspase-12, um indutor bloqueia de estresse degeneração retículo Endoplasmático, induzida morte por tunicamicina celular programada nos rins Caspase 12 +/- Caspase 12 -/- caspase-8 3 caspase-9 RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO caspase-3 APOPTOSE Caspase-12 TUNEL Em humanos: caspase-4 e Bak regulados por proteínas da família Bcl-2 (anti-apoptóticos) Via do RE: - e Bak também podem se localizar no RE. MEF BAX -/- e BAK -/- Não tem clivagem de procaspase-12 Após tratamento com indutores de estresse de RE MEF BAX -/- e BAK -/- + Expressão de BAK Restaura a ocorrência de clivagem de procaspase-12 após tratamento com indutores de estresse de RE 1 RECEPTOR DE MORTE 2 caspase-8 caspase-9 3 RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO caspase-3 APOPTOSE Caspase-12 12