Replicação e Reparo de DNA

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Unidade - Replicação e Reparo de DNA MATERIAL TEÓRICO Responsável pelo Conteúdo: Prof. Dr. Evandro Luís de Oliveira Niero Revisão Textual: Profa. Esp. Márcia Ota. Campus Virtual Universidade Cruzeiro do Sul www.cruzeirodovirtual.com.br 2

A cada instante, novas células são formadas no seu organismo para reporem aquelas que foram perdidas. A taxa de renovação depende de cada órgão ou tecido do corpo. A epiderme da pele, por exemplo, demora cerca de 30 dias para se renovar completamente. Outros tecidos, como o muscular cardíaco, não se renovam e por isso suas células não estão sujeitas à divisão por mitose. Também o processo de gametogênese (formação dos gametas) depende de divisões celulares por mitose e meiose. Quanto maior a taxa de renovação de um tecido, maiores as chances de ocorrerem erros durante as divisões celulares. Por isso, os eventos relacionados ao ciclo celular são muito bem coordenados. O mecanismo de replicação do DNA, por exemplo, é constantemente vigiado por moléculas que avisam a células se o processo ocorreu normalmente ou se é preciso realizar algum reparo. É esse mecanismo que nós começaremos a estudar agora. 1. Replicação Antes de qualquer coisa, vamos conhecer as moléculas que estão diretamente envolvidas com o processo de replicação do material genético. Como vimos na unidade anterior, as pontes de hidrogênio que mantêm as duas fitas do DNA unidas podem ser quebradas em condições experimentais, mas em condições fisiológicas isso acontece naturalmente todo o tempo, antes de cada ciclo de divisão das células, ou durante o processo de expressão gênica. O processo de replicação do DNA é chamado de semiconservativo, pois cada uma das fitas da molécula servirá de molde para a formação de uma nova cadeia originando, assim, duas novas moléculas de DNA sendo que cada uma delas possui uma fita velha (fita molde) e uma fita nova (recém-formada). 3

A principal enzima responsável pela polimerização das novas fitas é a DNA polimerase, descoberta em 1957. Esta enzima adiciona novos nucleotídeos, um a um, respeitando o pareamento de bases nitrogenadas. Os nucleotídeos livres que são adicionados à fita-molde são chamados desoxirribonucleosídeos trifosfatos por possuírem 3 fosfatos na extremidade 5 de estrutura química. Após o pareamento de bases entre as duas fitas a DNA polimerase catalisa a fusão entre o novo nucleotídeo e o nucleotídeo existente na cadeia. A adição dos desoxirribonucleosídeos está representada na figura 01. Para que ocorra o processo de replicação as duas fitas do DNA original são separadas formando regiões em forma de Y chamadas de forquilhas de replicação (figura 02). Nesse momento, a molécula tende a formar super-hélices fora da forquilha, aumentando a tensão na cromatina. Para visualizar como isso acontece enrole dois barbantes de maneira a formar uma estrutura em alfa-hélice. Prenda as duas pontas dos barbantes. Segure cada barbante pelo meio usando as pontas dos dedos de cada mão. Separe os dois barbantes no meio do comprimento e observe o que acontece com as extremidades. Elas ficam mais enroladas e é isso que acontece com o DNA. Mais adiante veremos como essa tensão é aliviada. 4

Extremidade 3 Extremidade 5 fita recémformada Fita-molde pirofosfato Desoxirribonucleosídeo a ser incorporado Extremidade 5 Figura 01 Esquema de adição de nucleotídeos livres à fita de DNA nascente. Modificada de: Albert s, et al., 2008. 5

Figura 02 Representação de uma forquilha de replicação em uma das extremidades do DNA aberto. Fonte: http://www.biomol.org/replicacao/sentido.shtml É importante salientar que toda forquilha de replicação é assimétrica, pois até hoje não se conhece nenhuma DNA polimerase que possa sintetizar DNA na direção 3-5. Portanto, a polimerização só ocorre da extremidade 5 para a 3. Como as duas fitas do DNA seguem orientação antiparalela (ver unidade I), uma das fitas é sintetizada continuamente (fita-líder ou contínua), enquanto a outra é feita aos pedaços (fita retardada ou descontínua) formando pequenos fragmentos de DNA que são posteriormente unidos, os fragmentos de Okasaki. A figura 02 mostra esses fragmentos e a direção de polimerização das novas fitas. Os fragmentos de Okasaki em procariotos podem ter de 1000 a 2000 nucleotídeos de comprimento enquanto em eucariotos possuem apenas 100 a 200 nucleotídeos. Para iniciar a replicação na fita contínua a DNA polimerase necessita apenas de um fator iniciador apenas no início da forquilha de replicação (algo como um adaptador que permita a extensão da cadeia nascente). Uma vez iniciado o processo, a DNA polimerase se encarrega de entender a nova fita. Já na fita descontínua, a cada vez que um fragmento de Okasaki é finalizado um novo precisa ser começado; portanto, são necessários novos fatores de iniciação a cada fragmento de DNA sintetizado. 6

Para iniciar uma nova cadeia de DNA adiante (novo fragmento de Okasaki) é preciso a formação de uma pequena fita iniciadora. Esses pequenos trechos são formados por RNA. A enzima responsável pela construção desses trechos de RNA pela adição de ribonucleosíteos trifosfatos é a DNA primase. Em eucariotos, esses trechos possuem cerca de 10 nucleotídeos de comprimento e se repetem a cada 100 a 200 nucleotídeos (tamanho dos fragmentos de Okasaki) (figura 03). A síntese de DNA pela DNA polimerase inicia-se pela adição de desoxirribunucleosídeos trifosfatados a partir do RNA iniciador e termina quando a DNA polimerase encontra a extremidade 5 do RNA iniciador do fragmento de Okasaki anterior. Um sistema de reparo é ativado para substituir o RNA por DNA, e uma outra enzima, a DNA ligase, catalisa a ligação entre os fragmentos de DNA. Diversos vídeos na Internet ajudam a compreender melhor esse mecanismo tão bem regulado. Conheça alguns links em ampliando os conhecimentos. Voltando à questão da tensão a que o DNA é submetido durante a separação das duas fitas, existem várias proteínas que auxiliam, tanto na manutenção da separação das fitas como na diminuição da tensão causada pela separação. No primeiro caso, a DNA helicase liga-se a uma das cadeias simples do DNA e caminha ao longo desta cadeia enquanto separa as duas fitas à frente. Fazendo-se a analogia dos dois barbantes enrolados e com as extremidades presas, segure em um deles com a ponta dos dedos (separando-o do outro barbante) e deslize seus dedos para abrir caminho entre eles. Esse é o papel da DNA helicase. Nesse caso, existem duas helicases, uma para cada fita-molde, pois cada uma segue uma direção diferente (3-5 ou 5-3 ). 7

Novo iniciador produzido pela DNA primase DNA polimerase estende o RNA começando um novo fragmento de Okasaki Finalização do novo fragmento O RNA anterior é removido e substituído por DNA Ligação dos dois fragmentos feita pela DNA ligase Figura 03 Formação dos fragmentos de Okasaki pelo iniciador de RNA sintetizado pela DNA primase. Modificada de: Albert s, et al., 2008. No entanto, você deve ter observado que o caminho atrás de seus dedos não permanece completamente aberto. Com a dupla-fita também ocorre esse problema. Por isso, existem proteínas chamadas de proteínas ligadoras de fita simples de DNA (SSB). Essas proteínas expõem as fitassimples de maneira a não encobrir as bases nitrogenadas, deixando o ambiente livre para o pareamento. Elas também evitam a formação de pequenos grampos de DNA que impediriam a ação da DNA polimerase. A figura 04 representa um esquema geral da maquinaria responsável pela replicação da molécula de DNA. 8

Os eventos da replicação são muito parecidos em procariotos e eucariotos, mas vale ressaltar que a maioria das moléculas mencionadas foram descobertas em bactérias. Normalmente, em eucariotos, as enzimas formam complexos protéicos maiores para realizarem as mesmas funções descritas anteriormente. Além disso, o processo de replicação em bactérias pode ser até 10 vezes mais rápido que em eucariotos. Um dos motivos é a presença do nucleossomos em nosso DNA. Tais estruturas retardam o processo de replicação uma vez que o DNA precisa desenrolar-se das histonas para a formação da forquilha. Molde da fita líder Fita recémsintetizada Cinta deslizante DNA polimerase na fita líder Dupla-hélice original Novo fragmento de Okasaki Iniciador de RNA Molde da fita descontínua DNA primase Proteína ligadora de fita-simples DNA helicase DNA polimerase na fita descontínua Figura 04 resumo da maquinaria responsável pela replicação do DNA. Modificada de: Alberts, et al., 2008. Nosso DNA também é muito maior que o de bactérias. Enquanto o genoma de E. coli não ultrapassa os 5 milhões de pares de nucleotídeos (em um DNA circular) o de seres humanos pode alcançar 3 bilhões de pares (divididos em 46 cromossomos). Uma bactéria pode duplicar seu material genético e dividir-se em pouco tempo. Já imaginou quanto tempo duraria para replicar todo o DNA de seres humanos? 9

Por isso mesmo, os cromossomos eucarióticos apresentam várias regiões onde ocorre síntese simultânea de DNA. Enquanto o DNA circular de procariotos apresenta uma única origem de replicação, nossos cromossomos apresentam várias. Esse pontos de origens de replicação são regiões com sequências específicas de nucleotídeos onde a maquinaria de replicação será montada. As enzimas responsáveis por evitar o emaranhamento da dupla-fita são chamadas de DNA topoisomerases. A DNA topoisomerase I cliva uma das cadeias do DNA para permitir que a molécula gire sobre um eixo enquanto o processo de replicação ocorre, evitando a quebra do DNA (figura 05). Já a DNA topoisomerase II cliva as duas cadeias do DNA para permitir que uma porção da molécula passe por outra. Isso acontece quando é necessário separar dois círculos de DNA entrelaçados evitando a formação de nós ao longo do polímero. Assim, em vários pontos diferentes do DNA de nossos cromossomos existem origens de replicação onde muitas, mas muitas moléculas agem ao mesmo tempo para replicarem todo o nosso material genético. Apenas quando todo o DNA estiver duplicado as fases subsequentes do ciclo celular são liberadas e a célula poderá seguir com o processo de divisão. 10

Figura 05 Esquema de funcionamento da DNA topoisomerase I. Fonte: Alberts, et al., 2004. 11

2. Reparo de DNA Diversos eventos podem desencadear falhas no processo de replicação do DNA, como por exemplo, inserção errada de nucleotídeos ou inserção de formas tautoméricas raras das 4 bases do DNA. Esses erros podem alterar a geometria da dupla-hélice ou não, mas de maneira geral esses erros são reparados ainda durante o processo de replicação pela própria DNA polimerase que detecta o nucleotídeo pareado de maneira errada e o substitui pelo nucleotídeo correto. Isso mostra o quanto é importante a existência de uma dupla-fita na molécula de DNA, pois a maquinaria da célula pode utilizar a fitamolde para reparar uma falha na outra fita. Mesmo com toda atenção dispensada pelas células para o processo de replicação os erros ocorrem a uma taxa de um nucleotídeo para cada 1 bilhão adicionado. Além disso, fatores externos às células também podem induzir erros como quebras ou torções na molécula de DNA. Dentre esses fatores estão radioatividade e exposição a substâncias tóxicas. É importante ressaltar que poucas dessas lesões no DNA podem levar à formação de uma mutação em um gene. Isso acontece primeiro porque muito pouco de nosso DNA (1%) é formado por regiões gênicas que serão expressas. O restante de nosso DNA é formado por regiões chamadas de não-codificantes, pois não são transcritas e, até onde se sabe, não estão envolvidas na síntese de peptídeos. Na verdade, pequenas alterações que ocorreram em nosso DNA ao longo do período evolutivo foram responsáveis pela formação do Homo sapiens. Essas pequenas alterações conferem variabilidade genética para as espécies e é muito importante para o processo evolutivo. O problema surge quando essas alterações ocorrem em regiões importantes de genes causando a produção de uma proteína defeituosa no organismo, por exemplo. Nesse caso, temos uma mutação prejudicial. 12

Por sorte, nossas células possuem mecanismos de reparo que são acionados independentemente daquele que ocorrem durante a replicação do DNA. Tais mecanismos reconhecem distorções na molécula de DNA (figura 06) e acionam o sistema de reparo que pode ser ocorrer de duas maneiras principais: reparo por excisão de bases e por excisão de nucleotídeos (figura 07). De maneira geral, cada organismo apresenta suas próprias ferramentas para o reparo de DNA, mas após a remoção do erro, em praticamente todos os organismos a DNA polimerase refaz a fita errada utilizando a fita-molde como modela para correção do erro e a DNA ligase faz a ligação entre a cadeia normal e a região reparada. O reparo por excisão de bases envolve a ação de enzimas chamadas de DNA glicosilases capazes de reconhecer alterações de bases no DNA e catalisar sua remoção. Dentre essas alterações podemos citar desaminações, bases oxidadas ou com anéis rompidos. Figura 06 Representações químicas de uma porção de DNA com pareamento errôneo de bases. Fonte: Alberts, et al., 2008. 13

O reparo por excisão de nucleotídeos é capaz de reparar falhas mais volumosas detectadas em grandes distorções na molécula de DNA. Essas falhas podem ocorrer em decorrências de reação covalente entre bases do DNA e grandes hidrocarbonetos (como o carcinógeno benzopireno) ou formação de dímeros de pirimidina causados pela radiação ultravioleta (pareamento T-T, T-C ou C-C). Nesse caso, a região lesada é clivada nos dois lados da distorção e uma enzima DNA helicase retira o oligonucleotídeo (polímero com poucos nucleotídeos). Figura 07 representação do funcionamento dos dois principais mecanismos de reparo do DNA. Fonte: Alberts, et al., 2004. Os radicais livres são conhecidos por atacarem o DNA causando quebras e/ou distorções na molécula. Esses agentes podem ser mutagênicos quando causam mutações na dupla-fita ou carcinogênicos quando as mutações no DNA podem induzir a formação de tumores. Tais 14

mutações são tão problemáticas que as células são capazes de pausarem seu ciclo durante a interfase até que os erros sejam reparados e o DNA seja completamente checado. Na maioria das vezes, as células com danos irreparáveis no DNA acionam o mecanismo de morte celular (suicídio molecular) por meio da ativação de genes específicos para evitarem que tais erros sejam repassados para as células-filhas. No caso dos tumores, algumas mutações fazem com que as células não consigam acionar o mecanismo de morte e dividem-se normalmente, produzindo um número cada vez maior de células defeituosas (com a mutação). Normalmente, as divisões de células com mutações no DNA geram células com uma instabilidade genética cada vez maior formando tumores extremamente agressivos. Essas mutações em células somáticas afetam apenas o indivíduo portador das células defeituosas e normalmente não são transmitidas para as futuras gerações. Mutações chamadas de germinativas ocorrem nas células gaméticas e, por isso, afetam a produção de gametas. Tais mutações podem ser transmitidas para a prole e, dependendo da mutação e da combinação cromossômica, podem causar problemas graves nos indivíduos recém-nascidos; podem, inclusive, levar à morte do embrião. Assim, conseguimos mostrar nesta unidade a importância de um correto processo de replicação do DNA e, mais ainda, mostrar como defeitos no processo de reparo dessa molécula podem levar a mutações em regiões gênicas que podem aumentar a chances de carcinogênese e/ou levar a defeitos embrionários ou ainda à morte do embrião. 15

Anotações 16

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