O Controlo da Tuberculose Diagnóstico e Tratamento O papel do laboratório no controlo da tuberculose Anabela Santos Silva Laboratório Nacional de Referência para Micobactérias Departamento de Doenças Infecciosas Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge Porto, 22 e 23 de Novembro 2011
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL (tuberculose doença) Exame directo Exame cultural Identificação TAAN Detecção molecular de resistências Teste sensibilidade aos fármacos
Exame directo
Exame directo Global tuberculosis control: WHO report 2011 (WHO/HTM/TB/2011.16) Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis 2011 update (WHO/HTM/TB/2011.6)
Exame directo Priorities for Tuberculosis Bacteriology Services in Low-Income Countries, second edition 2007, IUATLD
Exame directo fácil execução rápido resposta em 24h técnica pouco dispendiosa detecta casos infecciosos quantificado detecção de novos casos monitorização tratamento Limitações: baixa sensibilidade são necessários ~ 10 4 bacilos por ml de amostra para que sejam detectados não é específico para M. tuberculosis detecta bacilos álcool-ácido resistentes
Testes de Amplificação de Ácidos Núcleicos
Testes de Amplificação de Ácidos Nucleicos
Testes de Amplificação de Ácidos Núcleicos... the panel recommended that NAA testing become a standard practice in the United States to aid in the initial diagnosis of patients suspected to have TB, rather than just being a reasonable approach, as suggested in previously published guidelines...
Testes de Amplificação de Ácidos Núcleicos
Testes de Amplificação de Ácidos Núcleicos
Testes de Amplificação de Ácidos Núcleicos Sensibilidade:
Testes de Amplificação de Ácidos Nucleicos (TAAN) M. tuberculosis complex rápido execução em 48h específico identifica o Mycobacterium tuberculosis complex Limitações: sensibilidade variável não está aprovado para amostras extrapulmonares apenas diagnóstico exige equipamento específico e técnicos experientes teste mais caro Não substitui o exame cultural: execução das provas de sensibilidade identificação de micobactérias oportunistas
Detecção molecular de resistências
Detecção molecular de resistências TB MR
Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing: WHO report 2009 (WHO/HTM/TB/2009.411)
Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis 2011 update (WHO/HTM/TB/2011.6)
Detecção molecular de resistências TB MR Rifampicina: mecanismo de acção: - inibição da síntese proteica - ligação à subunidade β da RNA polimerase inibe a transcrição resistência: mutações no gene rpob (codão 531, 526, 516) Isoniazida: pró-droga: activada pela enzima catalase-peroxidase KatG mecanismo de acção: - inibição da síntese dos ácidos micólicos - ligação à enzima inha resistência: mutação no gene KatG (codão 315) mutação no gene inha (região reguladora) mutação no gene ahpc, oxyr, kasa
Detecção molecular de multirresistência GenoType MTBDRplus amplificação + hibridização reversa Sondas wild type Sondas mutação Sonda wild type Sondas mutação Sondas wild type Sondas mutação rpob katg inha identifica as mutações mais frequentes nos genes que conferem resistência à INH e RAMP pode ser utilizado directamente em amostras biológicas com ex. directo positivo execução 2 dias
Detecção molecular de resistência Sistema GeneXpert MTB/RIF Global tuberculosis control: WHO report 2011 (WHO/HTM/TB/2011.16) Apenas identifica as mutações mais frequentes nos genes que conferem resistência à RAMP pode ser utilizado directamente em amostras biológicas com ex. directo positivo ou negativo execução 1 dia
Detecção molecular de resistências rápido execução em 24 48h permite resultados em culturas contaminadas específico identifica o Mycobacterium tuberculosis complex Limitações: Falsas resistências: proporção de mutantes resistentes mutações silenciosas Falsas sensibilidades: mutações não pesquisadas mutações ainda não descritas Não substitui o exame cultural: confirmação fenotípica das resistências execução das provas de sensibilidade para os outros fármacos
Exame cultural
International Union Against Tuberculosis and Lung Diseases Priorities for Tuberculosis Bacteriology Services in Low-income Countries 2nd edition, Paris, 2007
Exame cultural Meios sólidos sensibilidade superior ao exame directo 10 a 100 bacilos permitem obter uma cultura positiva permitem quantificar cultura positiva 15 a 20 dias cultura negativa 30 dias monitorização tratamento Meios líquidos com indicadores de crescimento sensibilidade superior aos meios sólidos 12% detecção não permite quantificar cultura positiva 5 a 15 dias cultura negativa 42 dias casos novos
Exame cultural maior sensibilidade 10 a 100 bacilos para cultura positiva permite identificação da espécie permite avaliação da sensibilidade aos fármacos confirmação resultados moleculares outros fármacos micobactérias não tuberculosas Limitações: método mais lento
Cultura positiva Meios sólidos e/ou meios líquidos Confirmar a presença de BAAR Morfologia das colónias nos meios sólidos Exame microscópico das culturas (ampliação 1000 x) Identificação métodos moleculares ensaio de hibridização protegida - hibridização com sondas de DNA (Sistema AccuProbe) amplificação + hibridização reversa (Sistema Genotype )
Testes de sensibilidade aos antibióticos - Método das proporções - Meios líquidos BACTEC/MGIT 960 Meio sólido (Lowenstein Jensen) Resultado 4 a 12 dias Rifampicina Isoniazida Estreptomicina Etambutol Pirazinamida Amicacina Capreomicina Etionamida Ofloxacina Linezolide 1ª- leitura ao 28º dia 2ª- leitura ao 42º dia Canamicina Ácido para-amino salicílico Cicloserina
Diagnóstico EXAME DIRECTO Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis 2011 update (WHO/HTM/TB/2011.6) TAAN DETECÇÃO MOLECULAR DE RESISTÊNCIAS Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis 2011 update (WHO/HTM/TB/2011.6) EXAME CULTURAL
Monitorização EXAME DIRECTO EXAME CULTURAL Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis 2011 update (WHO/HTM/TB/2011.6)
FLUXO INFORMAÇÃO - DIAGNÓSTICO LABORATÓRIO Boletins de resultados MÉDICOS Correio; Telefone FLUXO INFORMAÇÃO - VIGILÂNCIA LABORATÓRIO Notificação dos perfis de susceptibilidade Notificação dos casos de multiresistência REDES DE VIGILÂNCIA ARS- NORTE DGS Laboratório Médicos PLATAFORMA ELECTRÓNICA Médicos Redes de vigilância Laboratório
Global tuberculosis control: WHO report 2011 (WHO/HTM/TB/2011.16)
1993 OMS considerou TB Emergência global 2010 7-8 milhões casos 1,3 1,6 milhões mortes 8,5 9,2 milhões casos 1,2 1,5 milhões mortes
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL (tuberculose latente)
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL (tuberculose latente) Interferon-γ Release Assays (IGRAs) QuantiFERON-TB gold: Quantifica a produção de IFN- γ pelos linfócitos T circulantes Técnica de ELISA T-SPOT.TB: Quantifica o número de células mononuclerares produtoras de IFN- γ Técnica Elispot
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL TUBERCULOSE LATENTE Menzies D, Pai M, Comstock G Meta-analysis: new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty recommendations for research Ann Intern Med. 2007;146:340-354
T SPOT.TB
Tipagem Molecular
Tipagem Molecular Aplicações estudo de surtos: investigação de contactos cadeias de transmissão noção de transmissão recente estudo das estirpes circulantes: noção de transmissão recente cadeias de transmissão distinção entre reinfecção e reactivação avaliação dos falsos positivos (laboratório) por contaminação cruzada
Caso I Sexo F, 26A Informação: meningite linfocitária com 3 semanas de evolução Amostra: LCR Exame directo: negativo TAAN: positivo Cultura positiva em meio líquido ao 40º dia
Caso II Sexo F, 26 A s/ informação clínica Amostra: Pús de joelho esquerdo Exame directo: positivo TAAN: positivo Cultura positiva em meio líquido e em LJ ao 20º dia
Caso III Sexo F, 11 A s/ informação clínica Amostra: Expectoração Exame directo: positivo TAAN: negativo Cultura positiva em meio líquido ao 7º dia Identificação: Mycobacterium abscessus
Caso IV Sexo M, 30 A s/ informação clínica Amostra (27/05/2011) : cultura positiva de expectoração Detecção molecular de resistências (07/06/2011) : positiva para INH + RAMP TSA 1ª + 2ª linha (06/07/2011): Resistente SM + INH + RAMP + EMB + PZA Sensível todos fármacos de 2ª linha
Caso V Sexo M, 46A Diagnóstico TBMR em 05/2009 (resistente INH+RAMP+SM) 3 amostras expectoração (22/06/09) : directo 3+ ; cultura positiva (tapete) 3 amostras expectoração (06/07/09) : directo 2+ ; cultura positiva (100 colónias) 2 amostras expectoração (27/07/09) : directo 1-9 baar/campo ; cultura positiva (6 colónias) 3 amostras expectoração (08/10/09) : directo 1-9 baar/campo ; cultura negativa amostras expectoração (10,11 e 12/09 e 01/10) : directo negativo; cultura negativa 3 amostras expectoração (06/04/10) : directo 1+; cultura negativa 3 amostras expectoração (04/06/10) : directo 1-9 baar/campo ; cultura negativa amostras expectoração (7,8,9,11/10) : directo negativo; cultura negativa
MUITO OBRIGADA