NAIARA CRISTINA BIANCHINI NATHALIA LARISSA ANELLO CITTA

1 PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO FUNDAP NAIARA CRISTINA BIANCHINI NATHALIA LARISSA ANELLO CITTA Estudo de Comparação entre Métodos diferentes para Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes realizado no Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, SP. RIBEIRÃO PRETO FEVEREIRO 2015

2 SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE- SES -SP COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS-CRH GRUPO DE DESENVOLVIMENTO DE RECURSOS HUMANOS-GDRH CENTRO DE FORMAÇÃO DE RECURSOS HUMANOS PARA O SUS Dr. Antonio Guilherme de Souza SECRETARIA DE ESTADO DA GESTÃO PÚBLICA FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO FUNDAP PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL ANÁLISES CLÍNICAS Naiara Cristina Bianchini Nathalia Larissa Anello Citta Estudo de Comparação entre Métodos diferentes para Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes realizado no Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, SP. Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional - SES- SP, elaborada no Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP, Departamento de Apoio Médico. Área: Análises Clínicas Orientadora: Tânia Maria Beltramini Trevilato Ribeirão Preto 2015

3 AGRADECIMENTOS Agradecemos primeiramente a Deus por ter nos acompanhado e iluminado os caminhos permitindo a realização dos nossos objetivos. A nossos pais por todo apoio e incentivo. Ao Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto pela oportunidade oferecida de realizar o Programa de Aprimoramento Profissional.

4 RESUMO A Pesquisa de Sangue Oculto (PSO) nas fezes surgiu como alternativa para o rastreamento do câncer colorretal em pacientes sem fatores de risco, sendo mulheres e homens igualmente afetados. É um exame recomendado especialmente para indivíduos com faixa etária igual ou superior a 50 anos. Este teste se sustenta no princípio de que os carcinomas do cólon sangram e que esta hemorragia oculta pode ser identificada pela PSO, que é um exame facilmente disponível. Os testes de PSO nas fezes são amplamente aceitos como métodos não invasivos e de baixo custo no rastreamento CCR. Apesar do discernimento de que afecções benignas possam ocasionar sangramento, os estudos que avaliam e comparam os testes disponíveis calculam seu desempenho através da detecção de adenomas avançados e neoplasias malignas. A Pesquisa de Sangue Oculto consiste na identificação de hemoglobina nas fezes, podendo ser realizado pelos métodos: Teste da O-Tolidina ou Guaiaco e o Teste Imunocromatográfico. Nosso objetivo foi realizar um estudo retrospectivo entre os métodos Meyer-Johannessen (uma variação do O-Tolidina) e Imunocromatográfico (Imunológico) na detecção de sangue oculto nas fezes através do levantamento de dados estatísticos de resultados positivos e negativos. Para isso utilizou-se o sistema informatizado do Laboratório de Fluidos Orgânicos do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP no período de agosto de 2008 a agosto de 2014. Nos três primeiros anos houveram 3.726 exames realizados pelo método de Meyer- Johannessen com 15% resultados positivos para PSO e 85% negativos e nos últimos três anos houveram 2.987 exames realizados pelo método Imunocromatográfico com 34% de positividade e 66% negatividade. Foi possível observar a semelhança na quantidade numérica de exames solicitados em igual período para os dois diferentes métodos. Durante a realização deste estudo esperava-se encontrar maior número de resultados positivos para o teste de Meyer- Johannesen devido à interferência da dieta, porém, o estudo demonstrou o contrario, foi pouco sensível, já que houve uma maior quantidade de resultados negativos. Foi possível observar, também, que o método Imunocromatográfico é considerado mais específico e mais sensível em relação ao outro método. Palavras Chaves: Pesquisa de Sangue Oculto, Método de Meyer-Johannessen, Método Imunocromatográfico.

5 LISTA DE ABREVIATURAS PSO - Pesquisa de Sangue Oculto INCA - Instituto Nacional do Câncer CCR - Câncer Colorretal HNPCC - Câncer Colorretal Hereditário Não Polipose SIM - Sistema de Informações sobre Mortalidade TGI - Trato Gastrointestinal HCFMRP-USP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo LIS Sistema Informatizado Laboratorial

6 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 - Porcentagem de negativos e positivos do Método Meyer- Johannessen...28 Gráfico 2 - Porcentagem de negativos e positivos do Método Imunocromatográfico...28 Gráfico 3 - Comparação entre as quantidades de testes de PSO no período entre Agosto de 2008 a Agosto de 2014...30

7 LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1 - Atividade pseudoperoxidase da hemoglobina...17

8 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Representação quantitativa do total de exames realizados no período de agosto de 2008 a agosto de 2014, e do total de exames positivos e negativo no mesmo período para cada um dos métodos...25 Tabela 2 - Representação quantitativa do total de exames realizados e as porcentagens correspondentes em cada um dos métodos...25 Tabela 3 - Quantidade de exames de PSO realizados no HCFMRP-USP utilizando o método de Meyer-Johannessen...26 Tabela 4 - Quantidade de exames de PSO realizados no HCFMRP-USP utilizando o método Imunocromatográfico...26

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Representação do exame de colonoscopia...14 Figura 2 - Representação do percurso do colonoscópio no intestino grosso...14 Figura 3 - Locais de sangramento do TGI, metabolismo intraluminal da hemoglobina e acurácia dos testes de PSO...16 Figura 4 - Kit do Método Imunocromatográfico...24 Figura 5 - Representação da corrida da solução salina tamponada mais a amostra...24 Figura 6 - Representação de um resultado positivo...24

10 SUMÁRIO 1. Introdução...11 1.1. Câncer Colorretal...12 1.2. Metabolismo da Hemoglobina no Trato Gastrointestinal...15 1.3. Pesquisa de Sangue Oculto (PSO)...16 2. Objetivo...19 3. Materiais e Métodos...20 3.1. Reativo de Meyer-Johannessen...20 3.2. Método Imunocromatográfico...22 4. Dados Estatísticos...25 5. Resultados e Discussões...27 6. Conclusão...31 7. Referências...32

11 1. INTRODUÇÃO A Pesquisa de Sangue Oculto (PSO) nas fezes surgiu como alternativa para o rastreamento do câncer colorretal em pacientes sem fatores de risco, sendo mulheres e homens igualmente afetados. É um exame recomendado especialmente para indivíduos com faixa etária igual ou superior a 50 anos. Este teste se sustenta no princípio de que os carcinomas do cólon sangram e que esta hemorragia oculta pode ser identificada pela PSO, que é um exame facilmente disponível. A Pesquisa de Sangue Oculto consiste na identificação de hemoglobina nas fezes, podendo ser realizado pelos métodos: Teste da O-Tolidina ou Guaiaco e o Teste Imunocromatográfico (Imunológico). (NOVAES et al., 2000 apud ALTENBURG et al., 2007) O teste de O-Tolidina ou Guaiaco baseia-se na atividade pseudoperoxidase que a porção da hemoglobina exerce, causando a oxidação de um composto fenólico (ácido alfa-guaiacônico) pela ação do peróxido de hidrogênio da solução de desenvolvimento, formando uma estrutura quinona. Se o sangue estiver presente nas fezes, esta reação química torna-se visível pelo aparecimento da cor azul ou azul esverdeada, dentro de 30 segundos. Para este teste há a necessidade de uma dieta alimentar antes da coleta, pois podem ocorrer interferências. O teste Imunoquímico (imunológico) ou teste de Imunocromatografia de captura utiliza anticorpos monoclonais e policlonais para possibilitar a detecção de níveis baixos de hemoglobina humana em amostras. Esta reação imunológica elimina a necessidade de dieta alimentar antes da coleta, assim como as interferências de hemoglobinas de outras espécies. (MOAYYEDI et al., 2006 apud ALTENBURG et al., 2007) No Brasil e no mundo a maioria dos laboratórios utilizam o teste da O-Tolidina ou Guáiaco, já o Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HC-FMRP-USP) atualmente utiliza-se o método Imunocromatográfico. O câncer colorretal é o quinto câncer mais diagnosticado no Brasil, e no sudeste do país ocupa o segundo lugar sendo a quarta causa mais importante de mortes por câncer no país. É o quarto mais frequente no mundo e o segundo nos países desenvolvidos. (FANG, 2002 apud ALTENBURG et al., 2007)

12 Os sintomas do câncer colorretal, na maioria dos pacientes, surgem quando a doença está avançada, demandando maiores custos de tratamento e altas taxas de morbidade e mortalidade. Considerando a crescente incidência desta doença, o diagnóstico precoce dela e mesmo de doenças predisponentes se torna importante. (ALTENBURG et al., 2007) 1.1. CÂNCER COLORRETAL O câncer é um grave problema de saúde pública em países desenvolvidos e em desenvolvimento, sendo responsável por mais de sete milhões de óbitos a cada ano, representando aproximadamente 13% de todas as causas de morto no mundo. (WHO, 2009) Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer INCA (2009), as neoplasias malignas representam a segunda causa de morte no Brasil, sendo o responsável anualmente por cerca de cem mil óbitos. O carcinoma colorretal representa uma das mais significantes e prevalentes causas de morte por neoplasias nos dias atuais, configurando-se como a terceira causa mais comum de câncer no mundo em ambos os sexos e a segunda causa em países desenvolvidos. (INCA, 2009) O INCA (2014) define o câncer colorretal como tumores que acometem um segmento do intestino grosso (o cólon) e o reto. É tratável e, na maioria dos casos, curável, ao ser detectado precocemente, quando ainda não se espalhou para outros órgãos. Grande parte desses tumores se inicia a partir de pólipos, lesões benignas que podem crescer na parede interna do intestino grosso. Uma maneira de prevenir o aparecimento dos tumores seria a detecção e a remoção dos pólipos antes de eles se tornarem malignos. (INCA, 2014) No Brasil, conforme FANG (2002), o carcinoma colorretal apresenta-se como uma das neoplasias do tipo maligna mais diagnosticada por câncer em todo o território. (ALTENBURG et al., 2007) Segundo o Sistema de Informações sobre Mortalidade SIM (2011), houve 14.016 mortes por Neoplasias, sendo 6.818 homens e 7.198 mulheres. Estima-se que no país ocorram, nos próximos anos, cerca de 32.600 novos carros, sendo 15.070 homens (46,3%) e 17.530 mulheres (53,7%). (INCA, 2014)

13 Esse quadro mundial leva à necessidade crescente de programas de rastreamento para detecção precoce, como o objetivo de diminuir a incidência e a mortalidade por esse tipo de câncer, uma vez que a história natural dessa neoplasia propicia condições ideias à sua detecção precoce. (MENEZIS, 2012) A incidência do câncer colorretal apresenta padrões bastante diferenciados entre as distintas regiões mundiais, o que sugere uma forte influência de fatores locais. Essa distinção pode ser observada de forma semelhante no Brasil, onde as regiões Sul e Sudeste apresentam elevada incidência dessa neoplasia em relação às regiões Norte e Nordeste, possivelmente em consequência de diferenças nos padrões dietéticos e no desenvolvimento socioeconômico. (PINHO et al., 2003) Os fatores envolvidos na etiologia do câncer colorretal (CCR) tem origem genética, ambiental, dietética ou por predisposição a certas doenças. Entre os fatores dietéticos, destacam-se principalmente as alimentações ricas em gorduras, devido à alta produção de ácidos biliares, provenientes do seu metabolismo, que são mutagênicos e citotóxicos. Entre os fatores ambientais, destacam-se fatores ocupacionais como inalação de pó, exposição à fumaça, ocupação industrial e radioterapia. A predisposição às doenças genéticas como HNPCC (Câncer Colorretal Hereditário Não Polipose), doença inflamatória intestinal, pólipos adenomatosos e o tabagismo, aumentam as chances de desenvolvimento do CCO. (HONÓRIO et al., 2010) A colonoscopia é o melhor exame preventivo, pois além de diagnosticar o câncer colorretal, permite identificar e tratar pólipos, lesões precursoras da doença (NELSON et al., 1999). Porém, são necessários métodos de triagem para a realização de colonoscopias, pois mesmo em países desenvolvidos, não seria possível sua realização em todos os indivíduos acima de 50 anos. (MENEZIS, 2012)

14 Figura 1 - Representação do exame de colonoscopia. Figura 2 - Representação do percurso do colonoscópio no intestino grosso. A Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes (PSO) surge como um método diagnóstico de grande importância para o rastreamento de carcinoma colorretal em pacientes sem fatores de risco. (NOVAES et al., 2000 apud ALTENBURG et al., 2007) A Sociedade Brasileira de Coloproctologia juntamente com o Instituto Nacional de Câncer, o Colégio Brasileiro dos Cirurgiões e outras sociedades médicas recomendaram que indivíduos de baixo risco, a partir dos 50 anos, realizem, anualmente, a pesquisa de sangue oculto nas fezes e a

15 retossigmoidoscopia, repetindo-a a cada cinco anos. A partir dos 60 anos, está indicada a colonoscopia ou o enema opaco a cada 10 anos. A Sociedade Americana de Coloproctologia, no entanto, recomenda iniciar o rastreamento a partir dos 40 anos e colonoscopia a partir dos 50 anos. A pesquisa de sangue oculto positiva implica na realização de colonoscopia. (ALTENBURG et al., 2007) A população de maior risco inclui indivíduos maiores de 50 anos, com histórico pessoal ou familiar de pólipos e/ou câncer de intestino, retocolite ulcerativa, doeça de Crohn e câncer de mama, ovário ou útero. Este grupo deve iniciar rastreamento aos 40 anos, incluindo a colonoscopia. (FANG, 2002) 1.2. METABOLISMO DA HEMOGLOBINA NO TRATO GASTROINTESTINAL Considera-se fisiológica a perda de 0,5 a 1,5 ml de sangue por dia pelo trato gastrointestinal (TGI), o que equivale a até 2 mg de hemoglobina por grama de fezes. A presença de hemoglobina nas fezes acima desse nível passa a não ser normal e a sua detecção indica sangramento oriundo do TGI. (ROCKEY, 1999) O sangramento digestivo com volume maior que 150 ml exterioriza-se através de melena (fezes de cor escura) ou hematoquezia (presença de sangue com cor viva misturado as fezes) e habitualmente é percebido pelo paciente. Sangramento de menor volume, a depender da localização anatômica, do tempo intestinal, do metabolismo intraluminal da hemoglobina e da sua regularidade pode ou não ser identificado nas fezes, portanto, sangramento que não altera a coloração das fezes e passa despercebido, tanto para o paciente quanto para o médico, caracteriza a presença de sangue oculto, que pode ser diagnostica pelas manifestações da anemia por deficiência de ferro, ou pela pesquisa de sangue oculto nas fezes. (ROCKEY, 1999) A compreensão do metabolismo gastrointestinal da hemoglobina auxilia no entendimento das limitações e aplicações práticas dos diferentes métodos de PSO. A hemoglobina é clivada nas frações heme e globina por ação das proteases gástricas e/ou pancreática do TGI superior. Uma pequena quantidade de heme é absorvida no intestino delgado e a fração não absorvida é convertida em porfirina e ferro nesse mesmo segmento do TGI ou por ação das bactérias do cólon. A globina

16 é igualmente digerida no TGI superior pela ação da pepsina gástrica e das proteases, mas também é metabolizada no cólon por intermédio das bactérias. (BORGES, 2013) Figura 3 - Locais de sangramento do TGI, metabolismo intraluminal da hemoglobina e acurácia dos testes de PSO. (ROCKEY, 1999). 1.3. PESQUISA DE SANGUE OCULTO (PSO) Métodos de detecção de sangue oculto nas fezes como prevenção primária a detecção precoce das doenças colorretais. Para realização da PSO, de um modo geral, é empregado o método do guáiaco e suas modificações e/ou método Imunocromatográfico, cujo fundamento baseia-se na detecção de hemoglobina nas fezes, ou seja, através dos efeitos catalíticos dos compostos do heme sobre a oxidação de substâncias orgânicas. (HONÓRIO et al., 2010) a) Reação do Guáiaco (Teste da O-Tolidina) Este teste foi desenvolvido por Van Deen, em 1864, e utilizado por Boas, em 1901, para pesquisa de sangramento gástrico. Passou a ser utilizado, em 1967, para monitoramento doméstico de sangue oculto nas fezes. (ALTENBURG et al., 2007)

17 O exame baseia-se na reação do guáiaco, que tem como princípio a atividade pseudoperoxidase da hemoglobina, liberando o oxigênio do peróxido de hidrogênio do heme, que por sua vez catalisa a oxidação dos compostos fenólicos presentes no guáiaco (incolor) resultando na formação de quinona colorida (azul), e devido a isso, também chamado de método colorimétrico. O guáiaco é extraído da planta Guaiacum officinale. (HONÓRIO et al., 2010) Hemoglobina pseudoperoxidase H 2 O 2 O-tolidina Azul Esquema 1 - Atividade pseudoperoxidase da hemoglobina (adaptado de STRASINGER, 2000) Cuidados prévios ao exame: Devido ao fato do teste ser baseado na reação com atividade da heme peroxidase, faz com que o teste possa ter reação positiva com outras peroxidases nas fezes, presentes em certos alimentos ou medicamentos. Portanto, deve-se fazer uma dieta especial e rigorosa com restrições antes da coleta da amostra. (HONÓRIO et al., 2010) O paciente deve fazer uma dieta específica por 3 a 4 dias antes de realizar o exame, não podendo ingerir carne vermelha, certas frutas como banana, melão; hortaliças como rabanete, nabo, brócolis, couve-flor, espinafre, tomate. Restringe-se igualmente o uso de medicamentos como corticosteroides, quimioterápicos, aspirina, anti-inflamatórios não hormonais e suplementos alimentares contendo ferro ou altas doses de vitamina C, por apresentarem o potencial de provocar pequenas perdas sanguíneas do trato gastrointestinal superior, e também não devem ser coletadas amostras durante ou dentro de três dias de um período menstrual. Bebidas alcoólicas devem ser descontinuadas nos sete dias que antecedem a coleta da amostra. Caso os pacientes não sigam as orientações corretamente, ou os procedimentos adequados para o preparo dos pacientes forem incorretamente informados, a probabilidade de resultados falso-positivos aumentam consideravelmente. (HONÓRIO et al., 2010) b) Reação da Benzina A reação da benzidina, também conhecido como Adler-Ascarelli, baseia-se na atividade da peroxidase do sangue que decompõe o peróxido de hidrogênio,

18 liberando oxigênio que por sua vez oxida a benzidina, alterando sua estrutura, fenômeno que é perceptível, sob o ponto de vista experimental, com o aparecimento da coloração azul da solução. (HONÓRIO et al., 2010) c) Reação de Mayer-Johannessen Esse método consiste na redução da fenolftaleína pelo zinco para anidrido fitálico, que é oxidado pelo oxigênio liberado da água oxigenada pelo sangue, transformando-se de novo em fenolftaleína. Tem-se uma coloração vermelha pelo fato do meio ser alcalino. (HONÓRIO et al., 2010) d) Método Imunocromatográfico É um teste imunoensaio cromatográfico que utiliza dois anticorpos monoclonais para a detecção da hemoglobina humana nas fezes. Esse é o único método no qual são dispensados os cuidados e preparativos dos pacientes. Pelo fato de utilizar anticorpos criados contra a molécula de globina da hemoglobina humana, esse teste detecta a presença intacta de hemoglobina humana ou os produtos da sua degradação precoce. Eles evitam a interferência de compostos que são conhecidos por afetar os testes d sangue oculto. (HONÓRIO et al., 2010)

19 2. OBJETIVO Estudar retrospectivamente os Métodos Meyer-Johannessen e Imunocromatográfico na detecção de sangue oculto nas fezes realizados no Setor de Fluídos Orgânicos do Laboratório de Patologia Clínica do HCFMRP-USP nos últimos seis anos.

20 3. MATERIAIS E MÉTODOS Neste estudo foram utilizados dados estatísticos coletados do sistema informatizado do Hospital das Clínicas da FMRP USP e consulta dos respectivos procedimentos operacionais relacionados ao tema abordado. 3.1. REATIVO DE MEYER-JOHANNESSEN Princípio: A fenolftaleína é reduzida pelo zinco para anidrido ftálico, o qual, oxidado pelo oxigênio desprendido da água oxigenada pelo sangue, se transforma de novo em fenolftaleína. Como o meio é alcalino, ela assume a coloração vermelha bem conhecida. Amostra: Fezes recém-emitidas ou guardadas em geladeira por até 24 horas, após dieta obrigatoriamente de 03 (três) dias a ser realizadas pelo paciente antes do exame, onde não deve ingerir verduras, legumes vermelhos, carnes vermelhas e também medicamentos à base de ácido acetil salicílico (AAS) e sulfato ferroso. Critérios de rejeição: Amostras obtidas com o uso de laxantes. Amostras colhidas por pacientes em período menstrual ou quando estiver com hemorroidas sangrando. Produto utilizado: Hidróxido de Potássio Anidro...20 g Fenolftaleína...2 g Zinco (pó)...10 g Água destilada...100 ml Água Oxigenada 10 vol. Preparação:

21 Dilui-se em 100 ml de água destilada, 20 g de Hidróxido de Potássio Anidro mexendo-se os componentes; adiciona-se posteriormente 2 g de Fenolftaleína mexendo-se a mistura, que terá uma coloração avermelhada. A mistura adiciona-se 10 g de pó de Zinco levando ao fogo e mantendo-se até perder a coloração avermelhada. Em seguida, coar a mistura, deixando em repouso por 24 horas, com uma pequena fração de pó de Zinco no fundo do frasco onde será armazenado o reativo, mantendo a estabilidade da reação, com validade por um ano. Preparação do material e execução do exame: Com o auxílio de um palito de sorvete é colocada uma pequena quantidade da amostra num cálice de vidro graduado para 30 ml, contendo água de torneira, até 30 ml; A amostra é homogeneizada utilizando o palito de sorvete; A amostra é filtrada em funil de vidro, com gaze dobrada em duas; Transferir 5 ml do filtrado para o tubo de ensaio do Paciente e 5 ml para o tubo de ensaio do controle, acrescentando neste 10ul de sangue total; Adicionar no filtrado 0,5 ml do reativo de Meyer, utilizando uma pipeta de vidro graduada; Utilizando uma pipeta de Pasteur, adicionar 4 gotas de água oxigenada; Ler resultado. Resultados: POSITIVO Vermelho. NEGATIVO - Qualquer outra cor. Limitações do procedimento: A reação de Meyer-Johannessen é extremamente sensível e permite pôr em evidência uma hemorragia de 0,5 ml por 24 horas. Controle de qualidade Controle negativo:

22 Selecionam-se fezes negativas, efetuando o seguinte teste qualitativo para validação do reativo: 1) Diluir as fezes com 30 ml de água de torneira e filtrar; 2) Distribuir o filtrado em 5 tubos, aproximadamente 5 ml; 3) No primeiro tubo acrescentar 100ul de sangue total, homogeneizar e transferir para o segundo tubo 100ul da solução e repetir o mesmo processo para os tubos seguintes; 4) No último tubo, após homogeneização, retirar 100ul e desprezar; 5) Após este procedimento, realizar teste de detecção do reativo novo, realizando a dosagem de sangue oculto. Controle positivo: No procedimento inclui um tubo controle onde é acrescentado sangue total no filtrado para controle do resultado positivo. MÉTODO IMUNOCROMATOGRÁFICO Princípio do Método: a) O Teste Imunocromatográfico é indicado para detectar a hemoglobina humana em amostras de fezes através da interpretação visual do desenvolvimento de cor no dispositivo do teste. b) O dispositivo contém uma membrana que é pré-impregnada com anticorpo hemoglobina anti-humana na área da linha de teste (T) e anticorpo de cabra anti camundongo na área da linha de controle (C). c) Uma almofada com anticorpo hemoglobina humana estiver presente na amostra de fezes do paciente dissolvida em salina tamponada, à mistura do conjugado ouro coloidal e a amostra extraída movem-se ao longo da membrana cromatograficamente por ação de capilaridade. d) Esta mistura migra para área de Teste (T) e forma uma linha visível como o complexo de anticorpos com a hemoglobina humana. e) Quando a hemoglobina humana estiver ausente na amostra extraída, não se forma nenhuma faixa de cor visível na área de Teste (T).

23 f) A presença de faixa de cor na área de Teste (T) indica um resultado positivo. Uma faixa colorida sempre aparecerá na faixa controle (C), que serve como indicador para o desempenho próprio do teste e do dispositivo. Amostra utilizada: Fezes recém-emitidas ou guardadas em geladeira por até 48 horas. Critérios para rejeição da amostra. Amostras obtidas com o uso de laxantes. Amostras colhidas por pacientes em período menstrual ou quando estiver com hemorroidas, sangrando ou utilizando medicamentos que podem causar irritação gastrointestinal. Materiais: Componentes do kit e/ou reagentes utilizados e materiais utilizados; O Kit contém materiais ou reagentes necessários para a realização de até 25 testes; Dispositivo ou Tira de teste contendo reagentes imobilizados em uma membrana em uma proteína matriz com azida sódica 25 unidades; Tubo coletor contendo uma suspensão de proteína e conservantes 25 unidades. Preparação do material e execução do exame: Desenroscar a tampa do tubo coletor e remover o aplicador inserindo o palito na amostra fecal em diferentes lócus; Recolocar o palito no tubo, fechar e agitar bem para uma boa suspensão; Retirar o dispositivo de teste da embalagem; Romper a extremidade do tubo coletor; Dispensar de 4 a 6 gotas da suspensão na cavidade do dispositivo; Aguardar 5 minutos e fazer a leitura do resultado; Descartar o material utilizado em local adequado. Resultados:

24 POSITIVO: Aparecem duas faixas rosa avermelhada uma na região teste (T) e outra na região controle (C). NEGATIVO: Aparece uma faixa rosa avermelhado na região controle(c) e não aparece na região de teste (T). INVÁLIDO: Não aparece faixa na região controle e na região de teste. Figura 4 - Kit do Método Imunocromatográfico (Fonte: arquivo pessoal). Figura 5 - Representação da corrida da solução salina tamponada mais a amostra (Fonte: arquivo pessoal). Figura 6 - Representação de um resultado positivo (Fonte: arquivo pessoal).

25 4. DADOS ESTATÍSTICOS Os dados foram obtidos por averiguação retrospectiva no sistema informatizado laboratorial (LIS) utilizado no Setor de Fluidos Orgânicos do Laboratório de Patologia Clínica do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, nos últimos seis anos. No período de agosto de 2008 à julho de 2011 o método utilizado foi o Meyer-Johannessen e, de agosto de 2011 à agosto de 2014, o método utilizado foi o Imunocromatográfico. MEYER- IMUNOCROMATOGRÁFICO JOHANNESSEN POSITIVO 571 1030 NEGATIVO 3155 1957 TOTAL por Método 3726 2987 TOTAL NO PERÍODO 6713 Tabela 1 - Representação quantitativa do total de exames realizados no período de agosto de 2008 à agosto de 2014, e do total de exames positivos e negativo no mesmo período para cada um dos métodos. MEYER- JOHANNESSEN POSITIVO NEGATIVO TOTAL AMOSTRAS 571 3155 3726 % 15% 85% 100% IMUNOCROMATOGRÁFICO POSITIVO NEGATIVO TOTAL AMOSTRAS 1030 1957 2987 % 34% 66% 100% Tabela 2 - Representação quantitativa do total de exames realizados e as porcentagens correspondentes em cada um dos métodos.

26 MEYER-JOHANNESSEN ANO/MÊS 2008 2009 201O 2011 JAN 112 114 81 FEV 97 114 61 MAR 122 152 70 ABR 97 94 60 MAI 121 138 86 JUN 108 113 82 JUL 135 102 88 AGO 154 104 119 SET 113 124 93 OUT 140 110 88 NOV 114 104 94 DEZ 72 85 65 Tabela 3 - Quantidade de exames de PSO realizados no HCRP-FMRP-USP utilizando o método de Meyer-Johannessen. IMUNOCROMATOGRÁFICO ANO/MÊS 2011 2012 2013 2014 JAN 78 71 98 FEV 75 61 13 MAR 109 86 35 ABR 82 101 96 MAI 103 101 14 JUN 76 80 82 JUL 78 96 109 AGO 123 81 131 110 SET 59 71 107 OUT 44 96 90 NOV 95 52 103 DEZ 82 35 64 Tabela 4 - Quantidade de exames de PSO realizados no HCRP-FMRP-USP utilizando o método Imunocromatográfico.

27 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES A necessidade de um método de triagem para busca ativa do carcinoma colorretal não é mais motivo de discussão. No Brasil, o melhor método é aquele que reúna preço baixo, fácil execução, sensibilidade elevada e aceitação social. Trabalhando com os recursos existentes o exame de sangue oculto é alternativa atraente apesar de não preencher todos os requisitos. (JATOBÁ, 2008) Os testes de PSO nas fezes são amplamente aceitos como métodos não invasivos e de baixo custo no rastreamento CCR. Foram desenvolvidos para integrarem os exames de rastreio de CCR. Apesar do discernimento de que afecções benignas possam ocasionar sangramento, os estudos que avaliam e comparam os testes disponíveis calculam seu desempenho através da detecção de adenomas avançados e neoplasias malignas. (BORGES, 2013) No presente estudo, foram avaliados os resultados positivos e negativos pelo teste de Meyer e o teste Imunocromatográfico. Foi possível observar a semelhança na quantidade de exames pedidos em igual período tanto para o teste Meyer-Johannesen quanto para o teste Imunocromatográfico. Durante a realização deste estudo esperava-se encontrar maior número de resultados positivos para o teste de Meyer-Johannesen devido à interferência da dieta, porém, o estudo demonstrou o contrario. A sensibilidade e a especificidade são demonstradas nos gráficos 1 e 2, onde a menor sensibilidade no teste Meyer-Johannessen é evidenciada na maior quantidade de resultados negativos (85%) se comparada ao teste Imunocromatográfico (66%) e a especificidade é evidenciada na maior quantidade de resultados positivos no teste Imunocromatográfico (34%) em relação ao teste Meyer-Johannessen (15%).

28 Gráfico 1 - Porcentagem de negativos e positivos do Método Meyer-Johannessen. Gráfico 2 - Porcentagem de negativos e positivos do Método Imunocromatográfico. Entretanto, segundo ALTENBURG (2007), não há diferenças significativas em relação à especificidade, quando comparado o teste de Meyer-Johannessen com o método Imunocromatográfico. As alterações de sensibilidade do método são devido ao aumento do número de falsos positivos. Já BORGES (2013) relata que tradicionalmente, os testes baseados no guáiaco, que reagem com a fração heme da hemoglobina, são usados na detecção de sangue oculto. Está bem documentado seu papel na redução da mortalidade por

29 CCR, contudo, este método ainda experimenta baixa sensibilidade e altos índices de falso-positivo. Mais recentemente, os testes Imunoquímicos (Imunocromatográfico), específicos para identificação de hemoglobina humana, vem ganhando interesse devido a sua maior sensibilidade na detecção de adenomas avançados e neoplasias. Apesar do exame com o guáiaco sofrer influência de fatores como a dieta e o uso de medicações, permanece como um método acessível, barato e não invasivo, tornando-o assim o método mais utilizado no Brasil. (ALTENBURG et al., 2007) Para que um método de triagem seja efetivo, é preciso que tenha alta sensibilidade. JATOBÁ et al (2008), observaram que no exame de sangue oculto feito pelo teste da benzidina, a sensibilidade é de 63,7%. Contrariamente, a especificidade foi 81%, não tão efetiva quando se trata de métodos de triagem populacional. O objetivo da detecção de sangue oculto nas fezes é localizar o sangramento na porção intestinal, porém o teste Meyer-Johannessen detecta também sangramentos a partir da porção inicial do TGI podendo levar a resultados falsopositivos, pois sangramentos em outros locais que não sejam a porção intestinal podem levar a exames complementares desnecessários e atraso no diagnóstico. Já o teste Imunocromatográfico detecta sangramento nas porções finais do TGI indicando uma possível patologia intestinal. A partir da análise dos dados obtidos, o gráfico 3 supõe que a quantidade de pedidos do exame de PSO vem diminuindo, isso pode ser devido à padronização recente do exame na detecção do CCR, pois a solicitação é indicada a pacientes acima dos 50 anos ou com histórico familiar ou pessoal, reduzindo pedidos rotineiros sem motivos aparentes. Não podemos desconsiderar na justificativa desta diminuição do número de exames a falta de kits em alguns meses para a realização do método Imunocromatográfico, o que não ocorria com o teste de Meyer-Johannessen feito in house.

30 Gráfico 3 - Comparação entre as quantidades de testes de PSO no período entre Agosto de 2008 a Agosto de 2014.

31 6. CONCLUSÃO Neste estudo, verificou-se que no período de agosto de 2008 a julho de 2011 o número de exames realizados com o método Meyer-Johannessen foram praticamente iguais ao Imunocromatográfico realizados de 2011 a 2014. No primeiro temos 15% de positividade para sangue oculto nas fezes e no segundo 34% positivos. O método Imunocromatográfico sugere mais especificidade, pois detecta a hemoglobina humana e mais sensíbilidade em relação ao método de Meyer- Johannessen, pois tem o dobro de positividade.

32 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALTENBURG FL; BIONDO-SIMÕES MLP; SANTIAGO A. Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes e Correlação com Alterações nas Colonoscopias. Rev bras Coloproct, 2007. BORGES, LUANA VILARINHO. Comparação entre testes químicos (o-tolidina) e imunoquímico de pesquisa de sangue oculto nas fezes e correlação com os achados colonoscópicos. São Paulo, 2013. FANG CB. Rastreamento do câncer colorretal. Ver Assoc Med.Bras. 2002 Instituto Nacional de Câncer (INCA). Estimativa 2010. Rio de Janeiro, 2009. Disponível em: http://www1.inca.gov.br/estimativa/2010/index.asp?link=mapa.asp&id=6. Instituto Nacional de Câncer (INCA), 2014. Disponível em: http://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/tiposdecancer/site/home/colorretal/definica o. JATOBÁ, Miriam Piratininga; CANDELÁRIA, Paulo Azeredo Passos; KLUG, Wilmar; FANG, Chia Bin; CAPELHUCHNIK, Peretz. Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes e Achado Colonoscópico em 60 Pacientes. Rev bras Coloproct, 2008. Jefferson Celli Honório; Maria Regina Pinheiro Tizzot. Análise dos Métodos de Sangue Oculto nas Fezes. Cadernos da Escola e Saúde. Curitiba-PR, 2010. MENEZIS, Camila Pinheiro; OLIVEIRA, Thompson Lopes; LUNDGREN, Patricia Urquiza. Pesquisa de Sangue Oculto nas fezes PSO: uma triagem alternativa na determinação das neoplasias colorretais. Rev. Bras. Farm, 2012. Moayyedi P; Achkar E. Does fecal occult blood testing really reduce mortality? A reanalysis of systematic review data. Am J Gastroenterol. 2006. Nelson RL, Persky V, Turyk M. Determination of factors responsible for the declining incidence of colorectal cancer. Dis. Colon Rectum. 42(6): 741-752, 1999. Novaes de Almeida FF, Araujo SEA, Santos FPS, Franco CJCS, Santos VR, Nahas SC, Harb-Gama A. Colorectal câncer screening. Rev Hosp Clin. 2000. Pinho MSL, Ferreira LC, Brigo MJK, Pereira Filho A, Wengerkievicz A, Ponath A, et al. Incidência do câncer colorretal na região de saúde de Joinville (SC). Rev Bras Coloproctol. 2003;23(2):73-76. ROCKEY DC. Occult gastrointestinal bleeding. The New England Journal of Medicine. 1999 Sistema de Informação Sobre Mortalidade-SIM. Consolidação da base de dados de 2011. Disponível em: http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/sim/consolidacao_sim_2011.pdf.

33 STRASINGER, S. K. Uroanálise e Fluídos Biológicos. 3ª edição. Editorial Premier. Filadélfia, EUA. Pg 196-197. 2000 WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Câncer. Fact sheet n. 297, 2009. Disponível em:<http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/index. html