Técnica Básicas para Análises de Células e Tecidos Visão panorâmica da célula Algumas grandezas... 1km 1.000m 1m 100 cm 1cm 10 mm 1mm 1000 m 1 m 1000 nm 1Å (Angstron) 10-10 m 1
Visão panorâmica da célula Aumento e Poder de Resolução Resolução: menor distância para que duas partículas apareçam como objetos separados. O limite de resolução da Microscopia Óptica é de 0,2 m Visão panorâmica da célula 2
Desenvolvimento da Microscopia -Microscópio Óptico (luz) -Microscópio Eletrônico (elétrons) Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico utiliza feixes de luz Sistemas de lentes (condensador, objetiva e ocular) O limite de resolução do MO é de 0,2 m e dependeessencialmente daobjetiva. 3
Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico de campo claro 4
Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico de fluorescência Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico de fluorescência 5
Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico confocal Desenvolvimento da Microscopia Outros tipos de microscópios ópticos Iluminação direta (sem coloração) Contraste de fase (refração da luz) Contraste diferencial de interferência (refração da luz) 6
Desenvolvimento da Microscopia Microscópio eletrônico -utiliza feixes de elétrons -lentes eletromagnéticas Alta resolução, abaixo de 0,3 nm. Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio Desenvolvimento da Microscopia Microscópio eletrônico de transmissão: Alta resolução Necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 m) Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio Imagem elétron-densa (escura) e elétron-lúcida (clara) Estrutura e funcionamento 7
Desenvolvimento da Microscopia Microscópio eletrônico de transmissão Desenvolvimento da Microscopia Microscópio eletrônico de varredura Alta resolução Fragmentos maiores ou tecidos inteiros Material biológico é recoberto com metais como ouro ou platina Estrutura tridimensional (3D) 8
Desenvolvimento da Microscopia Microscópio eletrônico de varredura MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA Microscópio eletrônico de varredura 9
Centro de Microscopia Eletrônica UNESP - Botucatu MEV MET 10
Preparação de material para análise ao microscópio As células e tecidos precisam estar perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivas. Preparação de material para análise ao microscópio Fixação Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio. 11
Preparação de material para análise ao microscópio Lavagem Preparação de material para análise ao microscópio Desidratação Retirada da água presente nos tecidos através de sucessivos banhos em uma série de etanol (70% 80% 90% 100%). 12
Preparação de material para análise ao microscópio Diafanização ou clareamento Substituição do etanol por líquido miscível (geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios. Preparação de material para análise ao microscópio Meio de impregnação Substituição do líquido (xilol) por parafina ou resina sintética. A resina sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 m). O ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 m) e por isso utiliza se resinas mais duras. Neste caso os cortes são feitos com navalhas de vidro ou diamante. 13
Preparação de material para análise ao microscópio Meio de inclusão Suporte para o tecido impregnado. Preparação de material para análise ao microscópio Tecido preparado para análise ao Microscópio Eletrônico 14
Preparação de material para análise ao microscópio Micrótomo Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1 m de espessura). Preparação de material para análise ao microscópio Micrótomo automatizado Permite a obtenção rápida de cortes sem passar pelas etapas descritas antes. 15
Preparação de material para análise ao microscópio Micrótomo Realizando cortes do material Preparação de material para análise ao microscópio Micrótomo Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1 m de espessura). 16
Preparação de material para análise ao microscópio Estufa 60 o C Derreter e eliminar a parafina Preparação de material para análise ao microscópio Xilol Retirada da parafina Série alcoólica - Rehidratação. Hidratação completa 17
Preparação de material para análise ao microscópio Coloração Preparação de material para análise ao microscópio Coloração A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base. Estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos. Estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos. Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina... Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida... Hematoxilina/Eosina (HE) Coloração freqüentemente utilizada Além destes corantes freqüentemente utilizados, utiliza se também outros tipos de coloração, como a impregnação com sais de prata e ouro. 18
Preparação de material para análise ao microscópio Além destas colorações frequentemente utilizadas, outros métodos baseados em reações químicas (citoquímica), imunológicas (imunocitoquímica), entre outras, também podem ser empregados....outras técnicas que podem ser empregadas na Biologia Celular e Molecular : Radioautografia : Imunocitoquímica : Cromatografia : Eletroforese : Cristalografia e difração de raio-x : Hibridação de ácidos nucléicos 19
Preparação de material para análise ao microscópio Montagem das lâminas Preparação de material para análise ao microscópio Análise do Material 20
Preparação de material para análise ao microscópio Resultados Plano de corte 21