O QU SÃO TSTS SOROLÓGICOS? Imunodiagnóstico Conceitos Prof: Prof: Teresa Teresa Gomes Gomes de de Oliveira Oliveira São técnicas para a detecção e quantificação de antígenos e anticorpos, ou outras substâncias que desempenhem o papel de antígeno no ensaio, tais como drogas, hormônios, ácidos nucléicos, citocinas, receptores de células, etc. Reatividade Cruzada Reações Cruzadas Anti-A Ac Anti-A Ac Anti-A Ac Ag A Ag B pitopo Compartilhado Ag C pitopo similar Quantificação da Resposta Imune Título - Fatôres que afetam as reações de Ag/Acs descreve uma quantidade relativa de ac. dependente do ensaio geralmente expressa como a recíproca da última diluição do soro que forneceu uma reação positiva Não tem unidade
Reações de Precipitação Concentração do Antígeno Concentração do Anticorpo Antígeno solúvel Precipitação ocorre na zona de equivalência m tubo são pouco utilizada atualmente (x: PCR - proteína C reativa) Imunodifusão Radial Simples - Mancini Gel contendo Ac anel de precipitação Ag Ag Ag Ag diam. diâmetro desconhecido x x x concentração (mg/dl) Imunodifusão radial simples-teste Quantitativo Dosagem de imuneglobulinas IgM, IgG,IgA AGLUTINAÇÃO Técnica de Mancini
Floculação (Aglutinação) de cristais de colesterol VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) cardiolipina de boi é sensibilizada com cristais de colesterol e lecitina pesquisa-se a presença de anticorpos anti-lípidios na sífilis Floculação VDRL cardiolipina de boi Prózona Diluição 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 Reação - - - + + + - Observação no microscópio (objetiva 4X e 10X prózona Título =? = 64
Fenômeno Prozona Falsos resultados negativos em soros com elevado título de anticorpos aglutinantes Ativa ou direta Aglutinação sse efeito é eliminado empregando-se diluições seriadas do soro + AGLUTINAÇÃO AGLUTINAÇÃO M PLACA GRUMOS Aglut. Positiva Aglut. Negativa SINAL: GRUMOS Aglutinação/Hemaglutinação Passiva ou Indireta Artificialmente adsorve-se se à partículas: antígeno anticorpo anticorpo passiva reversa Prof:Teresa Prof:Teresa Gomes Gomes de de Oliveira Oliveira
Aglutinação/Hemaglutinação Passiva ou Indireta + A reação pode ser feita em placas contendo 96 poços Hemaglutinação 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Hemaglutinação AGLUTINAÇÃO DO LÁTXL Paciente 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Pos. Neg. Título 1 64 2 8 3 512 4 <2 5 32 6 128 7 32 8 4
Inibição da Aglutinação ão/hemaglutinação (teste de Gravidez) Aglutinação/Hemaglutinação Passiva ou Indireta Reversa Teste Negativo Aglutinação + Teste Positivo Sem aglutinação + + Amostra do paciente (HCG) Anticorpos Imunofluorescência Direta Ac marcado com corante fluorescente liga-se ao Ag tecidual Ac marcado com corante fluorescente Ag Tecido Raiva Imunofluorescência Chlamydia trachomatis Indireta Ac liga-se ao Ag tecidual não marcado Anti-Ig marcada com corante fluorescente é usado para detectar a 1 a ligação do anticorpo Qualitativo Semi-Quantitativo Ac não marcado Anti-Ig marcada com Fluorocromo Ag Tecido
FAN - células Hep-2 Técnicas Imunoenzimáticas Imunoperoxidase Avrameas e Uriel - Nakame e Pierce (1966) m relação a IF: preparações duradouras não necessita de microscópio de fluorescência Vantagens da peroxidase: baixo peso molecular resultados reprodutíveis fácil visualização da coloração substrato: diaminobenzidina Imunoperoxidase Vírus pstein-barr
Técnicas Imunoenzimáticas LISA (enzyme-linked immunosorbent assay) nvgall e Perlmann (1971) nzimas e substratos cromógenos: peroxidase OPD (o-fenilenodiamina) TMB (3,3, 5,5 -tetrametilbenzidina) ABTS (2,2 -diazino do ácido etilbenzotiazolino sulfônico fosfatase alcalina nitrofenilfosfato LISA LISA* tapa 1: Ag (ex. virus) é adicionado ao tubo ou poço tapa 2: Soro do paciente (anticorpos??) é adicionado tapa 3: Ac anti-humano com enzima ligada é adicionado tapa 4: um substrato cromogênico é adicionado tapa 5: Haverá formação de cor, será medida em leitor de LISA *enzyme-linked immunosorbent assay
LISA Para a pesquisa de anticorpos Método indireto antígeno anticorpo (amostra) anti-imunoglobulina marcada substrato cromogênico LISA LISA Para a pesquisa de anticorpos Método de captura de IgM Para a pesquisa de antígenos Método de captura anti-igm IgM (amostra) antígeno anti-antígeno marcado Substrato cromogênico anticorpo antígeno (amostra) anti-antígeno marcado substrato cromogênico WSTRN BLOT Western-blotting
Western Blot Amostra Positiva Amostra Negativa HIV-1 Western Blot fita1: controle positivo fita 2: controle negativo amostra A: Negativa amostra B: Indeterminada amostra C: Positiva Dot-blotting Testes Rápidos Imunocromatografia