1 Instituto de Biociências IBB Departamento de Microbiologia e Imunologia Curso de Biomedicina Disciplina de Microbiologia Médica Aluno (a): Botucatu 2012
2 ASPECTOS GERAIS DA CARACTERIZAÇÃO MACROSCÓPICA DAS COLÔNIAS FÚNGICAS A cultura de um microrganismo refere-se à capacidade que este tem de crescer em meios nutritivos artificiais. Esse crescimento é evidenciado macroscopicamente pela formação de uma unidade estrutural, denominada colônia. As colônias de determinados fungos geralmente apresentam morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a mesma composição química e submetidos às mesmas condições de incubação. Através dos seus aspectos macro-estruturais de uma colônia, é possível sugerir a espécie fúngica presente na cultura. Sendo assim, o conhecimento do aspecto macro-morfológico das colônias é de extrema utilidade para a sugestão da identificação preliminar de determinada espécie fúngica. Na observação das características culturais de determinado fungo, devemos ressaltar os seguintes aspectos, segundo proposto por SIDRIM, JJC, BRILHANTE, RSN, ROCHA, MFG. (Cap. 8 - Aspectos Gerais de fungos filamentosos e dimórficos na apresentação filamentosa. In: SIDRIM, JJC, ROCHA, MFG. Micologia Médica a luz de autores contemporâneos. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2004, p. 83-86), com algumas modificações: a) tamanho da colônia: pode ser bastante variável na dependência da quantidade e qualidade de substrato ofertado e da espécie fúngica. Por exemplo, os fungos zigomicetos apresentam velocidade de crescimento rápido e suas colônias tendem a ocupar toda a superfície da placa. O mesmo ocorre com as espécies do gênero Aspergillus quando cultivadas a 35 o C. Já o fungo Piedraia hortae apresenta crescimento muito lento, sendo sua colônia restrita ao centro da placa de Petri. b) bordas: na periferia das colônias fúngicas podem ser observados muitos desenhos que vão desde morfologias bem delimitadas até achados de projeções irregulares que lembram franjas. Além disso, também pode ser observada, nas bordas das colônias uma variação da coloração em relação ao centro. Esse achado é peça-chave para indicar o possível patógeno implicado, como por exemplo, nas colônias de Sporothrix schenckii, onde se observa que as bordas tornam-se escuras com o envelhecimento da cultura. c) textura: é a característica mais importante utilizada na caracterização de uma colônia fúngica. A textura descreve a altura das hifas aéreas. As colônias podem ser classificadas quanto à textura em diversos tipos: colônias algodonosas: aquelas que se assemelham com algodão,
3 colônias furfuráceas: aquelas que lembram um punhado de substância farinácea espalhada em uma superfície, colônias penugentas: aquelas nas quais se evidenciam estruturas que lembram penas de aves dispersas na superfície do meio, colônias arenosas ou pulverulentas: aquelas que lembram areia de praia, colônias veludosas: aquelas que apresentam o aspecto de tecido aveludado, colônias membranosas: aquelas que são bem aderidas à superfície do meio de cultura, recobrindo-o como uma película, colônias glabrosas: aquelas com aspecto compacto, coriáceo, podendo ter superfície lisa ou irregular e sempre com ausência de filamento, ou seja, não algodonosa, colônias cremosas: aquelas que apresentam aspecto visual cremoso, sendo comumente observados no grupo das leveduras e da maioria das colônias bacterianas. d) relevo: diz respeito à topografia da colônia e pode ser: colônias cerebriformes: apresentam topografia de altos e baixos, fazendo circunvoluções que lembram as observadas no cérebro, colônias rugosas: nada mais são do que variações da cerebriforme, porém as pregas topográficas são menos evidentes, sendo as vezes radiais partindo do centro da colônia, colônias apiculadas: caracterizam-se pela presença de uma saliência na parte central lembrando um pequeno cume, colônias crateriformes: são aquelas que se aprofundam no meio de cultura, assumindo o aspecto de cratera. e) pigmentação: quando se fala em pigmentação de uma colônia fúngica deve-se levar em consideração alguns aspectos primários: - se o pigmento é encontrado na superfície da colônia ou no reverso, - se o pigmento é encontrado tanto na superfície quanto no reverso da colônia, - se o pigmento é ou não difusível no meio de cultura, - se o pigmento está presente apenas nos esporos e ausente nas hifas, como observado na maioria das espécies de Aspergillus e Penicillium, ou
4 em ambos (hifa e esporos), como observado nas espécies de fungos causadores de cromoblastomicose (Ex. Fonsecae pedrosoi). Observa-se uma grande variedade de cores na pigmentação fúngica que passam pelos tons de verde, amarelo, vermelho e castanho até ao preto. Portanto, a caracterização de uma colônia visando a auxiliar a identificação de determinada espécie fúngica, nada mais é do que um conjunto de características subjetivas, de expressão fenotípica, encontradas em determinada espécie. Dessa forma, deve-se sempre ter em mente que, embora a colônia fúngica possa sugerir, indicar e muitas vezes até acertar o caminho da identificação, não se deve, contudo, considera-la como única ou principal forma de identificação fúngica. Quando empregada como único critério pode levar a diagnósticos pouco precisos ou errôneos. PRÁTICA 1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS EXERCÍCIO 1 ASPECTOS MACROSCÓPICOS DE CULTURAS DE FUNGOS LEVEDURIFORME E FILAMENTOSO a) finalidade: auxiliar na identificação das colônias fúngicas. b) fundamento: As colônias de determinados microrganismos geralmente apresentam morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a mesma composição química e submetidos às mesmas condições de incubação. Através do aspecto macromorfológico da colônia é possível sugerir a espécie fúngica presente na cultura. Entretanto, antes de se determinar as características da cultura de determinada colônia, é preciso certificar-se de que a cultura está pura, ou seja, não deve ser evidenciada a presença de outros microrganismos através da observação de colônias diferentes em uma mesma placa ou tubo. Os estudos macroscópicos devem ser
5 baseados nas seguintes características: tamanho, bordas, textura, relevo (no verso e reverso da colônia) e pigmentação. Exemplo: Frente: colônia de fungo (Filamentoso ou Leveduriforme), de textura (algodonosa, aveludada, pulverulenta, glabra, cremosa, etc), de relevo (cerebriforme, rugoso, crateriforme, apiculado, liso) de coloração (...), com bordos (regulares ou irregulares). Verso: (presença ou ausência) de fendas ou dobras, coloração (...), e (ausência ou presença) de pigmento difusível no meio de cultura. Descrever as características coloniais das culturas de Saccharomyces sp. (cultura A) e Aspergillus sp. (cultura B), conforme o modelo que acima. Aspergillus sp. Saccharomyces sp.
6 EXERCÍCIO 2 - ASPECTOS MICROSCÓPICOS DAS CULTURAS DE FUNGOS - COLORAÇÃO COM LACTOFENOL AZUL ALGODÃO (LFAA) a) finalidade: O método de coloração com Lactofenol Azul Algodão é usado para preparar exame microscópico de colônias de fungos. É uma técnica que tem a finalidade de visualizar o micélio vegetativo e reprodutor de um fungo filamentoso, como também as características da célula vegetativa e reprodução por brotamento de leveduras. b) técnica: 1. Colocar uma gota de lactofenol azul-algodão sobre a lâmina. 2. Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma alíquota da cultura de levedura, utilizando alça ou fio de platina. 3. Colocar o fragmento da cultura ou a alíquota de levedura sobre a gota de lactofenol e homogeneizar. 4. Cobrir com lamínula e examinar ao microscópio nas objetivas de 10 e 40 vezes. Desenhar as estruturas observadas: Aspergillus sp. Saccharomyces sp.
7 c) interpretação Na coloração com lactofenol azul algodão é possível observar que existem dois tipos morfológicos de fungos: as leveduras e os filamentos (bolores ou micélios). As leveduras são unicelulares e podem ter diferentes formatos (oval, circular, naveta, etc) e se reproduzem por brotamento (únicos ou múltiplos) ou por fissão (mais raro). Os bolores são fungos filamentosos possuindo hifas septadas ou cenocíticas. Na sua reprodução assexuada, é possível visualizar no micélio vegetativo os clamidósporos e artrósporos, e no micélio reprodutor, os esporos endógenos (esporangiósporos) em esporângios (estrutura fechada) e esporos exógenos (conidiósporos, também denominados simplesmente conídios ou conídias) em conidióforos. A vantagem desta técnica é de ser fácil e rápida a sua preparação, e a desvantagem é que em muitos fungos não se observa os órgãos de frutificação. PRÁTICA 2 FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SUPERFICIAIS E CUTÂNEAS EXERCÍCIO 1 - PESQUISA DE Malassezia sp. POR CULTURA EM MEIO SABOURAUD ADICIONADO DE CLORANFENICOL, ACTIDIONE E 1% DE AZEITE DE OLIVA. a) Finalidade: este meio enriquecido com substrato lipídico é utilizado para pesquisar o fungo Malassezia furfur ou outras espécies de leveduras lipofílicas, normalmente associadas ao couro cabeludo e envolvidas na etiologia Pitiríase versicolor. Pesquisa de portadores assintomáticos (couro cabeludo). b) Procedimentos de coleta da amostra: umedecer o swab em solução salina estéril e a seguir friccionar no couro cabeludo, girando o swab em todos os lados.
8 c) Cultura do Material Clínico 1. Abrir cuidadosamente a placa próximo ao bico de Bunsen; 2. Friccionar suavemente o swab sobre a superfície do meio de cultura; 3. Identificar as placas com o número do grupo e data; 4. Vedar as placas com filme plástico; 5. Incubar as placas em estufa à 35ºC, por 7 dias. d) Interpretação (a ser feita na próxima aula) Observar as placas semeadas com o material a 35ºC por 7 dias e verificar se houve o crescimento de leveduras. Selecione uma colônia e faça a descrição macroscópica e preparação de lâminas com LFAA. Observar ao microscópio e desenhar. Discutir o significado clínico dos achados micológicos dos demais grupos. EXERCÍCIO 2 - OBSERVAÇÃO DE CULTURAS E LÂMINAS DE FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SUPERFICIAIS E CUTÂNEAS 2.1. Examinar ao microscópio material raspado de pele de pacientes com Pitiriase versicolor: Desenhar as estruturas observadas.
9 2.2. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos: Trichosporon sp. Hortae werneckii Microsporum canis Microsporum gypseum
10 Trichophyton mentagrophytes Epidermophyton flocosum EXERCÍCIO 3 PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS CLÍNICAS SUSPEITAS DE MICOSES SUPERFICIAIS E/OU CUTÂNEAS. FAZER EXAME MICOLÓGICO DIRETO E CULTIVO EM ÁGAR MYCOSEL. Procedimento: 1 abrir a lâmina contendo a amostra da lesão do paciente; 2 separar metade para cultura em ágar Mycosel; 3 adicionar uma gota de KOH 20 30% sobre a amostra; 4 aquecer rapidamente na chama do Bico de Bunsen para ajudar no processo de clareamento; 5 observar ao microscópio para visualização de elementos fúngicos. Amostra clínica: Resultado do Micológico Direto: Resultado da Cultura:
11 PRÁTICA 3 - FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SUBCUTÂNEAS EXERCÍCIO 1 Observar as lâminas de cortes histológicos de pacientes com Cromoblastomicose e Lacaziose. Desenhar as estruturas fúngicas observadas. Cromoblastomicose coloração: HE Lacaziose coloração GMS EXERCÍCIO 2. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos: Sporothrix schenckii (Fase Micelial) Sporothrix schenckii (Fase Leveduriforme)
12 Pythium insidosum Coloração com LFAA produção de esporângio em material vegetal Phialophora verrucosa Cladophialophora carrionii Fonsecaea pedrosoi
13 PRÁTICA 4 - FUNGOS DIMÓRFICOS CAUSADORES DE MICOSES SISTÊMICAS EXERCÍCIO 1. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos: Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Micelial) Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Leveduriforme) Histoplasma capsulatum (Fase Micelial) Histoplasma capsulatum (Fase Leveduriforme)
14 PRÁTICA 5 - FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES OPORTUNISTAS EXERCÍCIO 1. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas das espécies de Aspergillus: Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus niger
15 EXERCÍCIO 2. Observar ao microscópio e desenhar as estruturas visualizadas de esfregaço de secreção vaginal de paciente com vulvovaginite por C. albicans corado pelo método de Gram ou Giemsa. EXERCÍCIO 3. Descrever as características coloniais de cultura de Candida albicans cultivada em agar Sabouraud, observar e desenhar as estruturas microscópicas: esfregaço de cultura corado com LFAA, clamidósporo e formação de Tubo Germinativo. Candida albicans esfregaço de cultura filamentação tubo germinativo e clamidoconídio
16 EXERCÍCIO 4. Diferenciação de Candida albicans de outras espécies de Candida pelo método de CHROMagar-Candida. Observar o crescimento das colônias e diferenciar pela coloração: Candida albicans cor: Candida tropicalis cor: Candida spp. cor: EXERCÍCIO 5. Descrever as características coloniais de Cryptococcus neoformans cultivado em agar Sabouraud (SAB) e Agar Semente de Niger (NSA). Observar as características microscópicas de esfregaço de cultura corado pelo Nankin. Cryptococcus neoformans (cultivado em Agar Sabouraud) (cultivado em Agar Semente de Niger) coloração pela tinta da China (Nankin) EXERCÍCIO 6. Diferenciação entre C. neoformans e C. gattii pelo método de CGB (Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol) Teste CGB positivo Cor: Espécie: Teste CGB negativo Cor: Espécie: