MECANISMO DE ACÇÃO DOS ANTIMALÁRICOS E EMERGÊNCIA DE RESISTÊNCIAS

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar MESTRADO EM BIOQUÍMICA MECANISMO DE ACÇÃO DOS ANTIMALÁRICOS E EMERGÊNCIA DE RESISTÊNCIAS ANDREIA CORREIA ANDREIA GOMES JESSICA EIRA.. FARMACOLOGIA MOLECULAR E CELULAR Abril 2011

Índice Mecanismos de acção dos antimaláricos e emergência de resistências Introdução... 4 Malária... 4 Sintomas... 6 Plasmodium falciparum... 6 Plasmodium vivax... 7 Plasmodium ovale... 8 Plasmodium malariae... 8 Antimaláricos... 8 Fármacos utilizados no tratamento do ataque agudo... 9 Fármacos que produzem cura radical... 10 Fármacos utilizados para quimioprofilaxia... 10 Fármacos utilizados na prevenção da transmissão... 11 Novos fármacos antimaláricos... 11 4-Aminoquinolinas... 12 Cloroquina... 12 Amodiaquina... 12 Quinolina-metanóis... 13 Quinina e quinidina... 13 Mefloquina... 13 8-Aminoquinolinas... 14 Primaquina... 15 Inibidores antagonistas de folato... 15 Pirimetamina, progualino e sulfadoxina... 15 Combinação de antagonistas de quinina-folato... 16 Atovaquona... 16 Tetraciclinas (antibióticos)... 16 Doxiciclina... 16 Derivados de fenantrino-metanol... 17 Halofantrina... 17 Derivados amil-álcool... 17 Lumefantrina... 17 2

Endoperóxido de lactona e sesquiterpenos... 18 Artimisinina... 18 Resistência a fármacos... 19 Efeito da resistência dos fármacos antimaláricos ao nível do controlo da malária global... 20 Emergência de mutações genéticas... 21 Propagação da resistência a antimaláricos... 22 Marcadores genéticos da resistência... 24 Pirimetamina e cicloguanil... 24 Sulfadoxina... 25 Sulfadoxina-pirimetamina... 25 4-aminoquinolinas... 25 Amino-álcoois... 26 Quinina... 27 Artimisinina... 27 Atovaquona... 27 Conclusão... 28 Referências bibliográficas... 29 3

Introdução MALÁRIA A malária é classificada como a infecção parasítica mais importante a nível mundial, pela sua elevada morbilidade e mortalidade (1 a 3 milhões de pessoas por ano), sendo causa de graves problemas socioeconómicos que contribuem para o baixo desenvolvimento dos países afectados, que estão entre os mais pobres do Mundo [1], [2]. Cerca de 40% da população mundial vive em países endémicos da malária, distribuídos entre regiões tropicais e subtropicais (Figura 1) [3]. Esta doença é particularmente grave em alguns países da África (região tropical hiper-endémica), onde constitui 20% das causas de morte na infância (crianças até aos cinco anos). Além das crianças, também os portadores do vírus HIV e mulheres grávidas são grupos com elevado risco de contrair a malária (OMS), sendo que morrem cerca de 10.000 mulheres grávidas por ano, devido a anemias relacionadas com a malária [4]. Figura 1- Número total de mortes causadas por malária, a nível mundial, entre 2003 e 2008 (OMS) A malária é causada por parasitas protozoários do género Plasmodium, transmitidos para o humano através da picada de mosquitos fêmeas do género Anopheles sp, que necessitam de sangue para a maturação dos seus ovos. As quatro espécies de Plasmodium que infectam humanos são P. falciparum, P. vivax, P. ovale e P. malariae, sendo que a primeira é que proporciona maiores taxas de morbilidade e mortalidade [5]. Para a transmissão ocorrer é necessário que o parasita complete um ciclo de desenvolvimento complexo no mosquito [6], sendo que o seu ciclo de vida 4

abrange um ciclo sexuado (na fêmea do mosquito) e um ciclo assexuado (no Homem) (Figura 2). O ciclo inicia-se com a picada do mosquito infectado, que lança esporozoítos para a corrente sanguínea, na qual permanecem até atingir o fígado (30 minutos a 1 hora), onde é iniciada a fase pré-eritrocitária, ou exoeritrocitária, de desenvolvimento e multiplicação. Nesta fase os parasitas dividem-se nas células do parênquima hepático por esquizogonia, formando esquizontes que se segmentam em merozoítos. Estes por sua vez rompem as células hepáticas, sendo libertados novamente para a circulação. Numa segunda fase do ciclo assexuado, denominada fase eritrocitária, os merozoítos fixam-se e penetram nos eritrócitos, reproduzindo-se e alimentando-se no seu interior (trofozoítos). Durante esta transformação o parasita remodela a célula hospedeira, introduzindo no eritrócito variados compostos e digerindo a hemoglobina, até ao rebentamento da célula, libertando mais merozoítos que vão infectar outras hemácias, iniciando-se um novo ciclo eritrocitário [7]. No caso de P. falciparum todos os esquizontes dão origem a um elevado número de merozoítos, mas noutras espécies alguns esquizontes permanecem em estado de dormência no fígado (hipnozoíta), podendo ser reactivados passados meses ou mesmo anos (ciclo exoeritrocitário). Os trofozoítas, após alguns ciclos de divisão, principalmente quando não encontram condições favoráveis para nova reprodução, diferenciam-se nos gametócitos feminino (macrogametócito) e masculino (microgametócito). O ciclo só se completa quando os gametócitos voltam para o mosquito, ao serem sugados por este por uma nova picada. No estômago do insecto inicia-se o ciclo sexuado do parasita, que envolve a fertilização e a formação do zigoto. Este desenvolve-se num oocineto, que atravessa o estômago e dá origem ao oocisto, que por sua vez se divide por esporogonia no tubo digestivo do insecto, originando os esporozoítos por ruptura do esporocisto maduro. Os esporozoítos migram então para as glândulas salivares do mosquito, onde permanecem até serem libertados numa picada [7], [8]. 5

Figura 2- Ciclo de vida de Plasmodium. SINTOMAS A fase eritrocitária é aquela que causa a doença, sendo que a fase exoeritrocitária é assintomática. Os sintomas clínicos da doença são primeiramente devido à ruptura e destruição dos eritrócitos. A malária pode ter um decurso gradual ou fulminante, apresentando sintomas não específicos, o que torna por vezes difícil o diagnóstico. Assim, a maioria dos pacientes apresenta ataques agudos febres altas, calafrios, dores de cabeça e diaforese, pelo que a doença poderá ser confundida com uma infecção viral comum. Outros sintomas comuns são tonturas, indisposição, mialgia, taquicardia, palidez, icterícia, hepatomegalia e esplenomegalia [8]. Os episódios periódicos de febre que caracterizam a malária são decorrentes da ruptura sincronizada dos eritrócitos, com libertação dos merozoítas e de restos celulares, com aumento dos níveis plasmáticos do factor de necrose tumoral α (TNF-α) [7]. Plasmodium falciparum Apresenta um ciclo eritrocitário de 48 horas no Homem e é a espécie que causa a forma da doença malárica com maior morbilidade e mortalidade, a malária maligna ou 6

severa. No entanto, este parasita não apresenta ciclo exoeritrocitário, pelo que se a fase eritrocitária for erradicada não existe risco de ocorrer recidivas [7]. Os eritrócitos infectados por P. falciparum sofrem modificação das suas propriedades celulares, especialmente na sua superfície, tornando-se capazes de se agregarem entre si e de se aderirem aos vasos na micro circulação de tecidos específicos, como o cérebro ou a placenta. Como resultado, pode ocorrer obstrução do fluxo sanguíneo, causando hipoxia e consequente disfunção orgânica, como por exemplo insuficiência renal ou encefalopatia (malária cerebral) [7], [3]. Nas mulheres grávidas estes agregados na placenta são prejudiciais para o desenvolvimento fetal [3]. As maiores complicações da malária maligna incluem a malária cerebral, edema pulmonar, falha renal, anemia severa e hemorragias. Por outro lado, a acidose e a hipoglicemia constituem as complicações metabólicas mais comuns. Frequentemente, muitos destes problemas estão presentes em simultâneo no paciente ou desenvolvem-se sucessivamente num curto espaço de tempo, progredindo para a morte em poucos dias ou mesmo horas [8]. A anemia severa que se verifica nos pacientes com a doença deve-se à destruição dos eritrócitos e à reduzida taxa de eritropoiese, associada com níveis aumentados de TNF-α e com os níveis reduzidos de Interleucina-10 (IL-10) [3]. A malária cerebral é a forma mais comum causa de morte nos pacientes com malária maligna, caracterizando-se inicialmente por sonolência e confusão ou com convulsões generalizadas, com progressão para o coma [8]. Plasmodium vivax Causador de malária benigna, com sintomas mais leves do que na malária severa, raramente fatal (ruptura do baço). O seu ciclo eritrocitário é também de 48 horas mas, como apresenta ciclo exoeritrocitário, pode ficar em estado dormente nos hepatócitos (hipnozoítas) e manifestar-se de forma recorrente durante anos (recidivas). Pensa-se que a progressão menos agressiva de P. vivax se deva à sua incapacidade de adesão ao endotélio vascular, mostrando uma preferência restrita à invasão de reticulócitos (eritrócitos imaturos) [9]. 7

Plasmodium ovale O ciclo eritrocitário é de 48 horas e apresenta ciclo exoeritrocitário. Semelhante a P. vivax [10]. Plasmodium malariae Não existe evidência da existência de formas quiescentes no fígado (hipnozoítas), como as encontradas em P. vivax e P. ovale. No entanto, as formas na fase pré-eritrocitária não maturam todas no mesmo dia, libertando-se parasitas durante alguns dias. Estes vão invadir eritrócitos envelhecidos em ciclos eritrocitários de 72 horas. Causa malária benigna, associada a lesões nefróticas renais [11]. O número de casos de malária a nível mundial parece estar a aumentar devido ao aumento do risco de transmissão em áreas em que o controlo da doença é diminuído, como a Índia por exemplo, ao aumento da prevalência de estirpes resistentes aos fármacos antimaláricos e, em alguns casos, devido ao aumento dos viajantes internacionais nas regiões endémicas, que funcionam como vectores da doença [12]. Antimaláricos O melhor método antimalárico consiste em evitar a doença impedindo a picada do mosquito. Esta pode ser feita utilizando roupas que cobrem o máximo de área do corpo possível, utilizando redes nos quartos e repelentes contra insectos [13]. Existem fármacos que podem ser utilizados de modo profilático, de forma a prevenir a doença, enquanto outros podem ser utilizados para tratar ataques agudos. Diferentes antimaláricos matam selectivamente o parasita nos seus diferentes estados de desenvolvimento no ciclo de vida, logo, a sua classificação é feita de acordo com essa sua selectividade (Figura 3) [13]. Podem-se fazer duas generalizações. Uma vez que nenhum fármaco mata esporozoítas, não é possível prevenir a infecção, mas sim prevenir o desenvolvimento da malária sintomática causada pelas formas eritrocíticas assexuadas. Também, nenhum dos fármacos antimaláricos é eficaz contra os estados do ciclo celular tanto das células 8

do fígado como dos eritrócitos que podem coexistir num paciente. Sendo assim, a cura completa requer a combinação de mais do que um fármaco [7]. Figura 3 O ciclo de vida do parasita da malária e o local de acção dos agentes antimaláricos. A figura mostra o ciclo pré ou exoeritrocitário no fígado e o ciclo eritrocitário no sangue. Locais de acção dos fármacos: A Fármacos utilizados no tratamento do ataque agudo (agentes esquizonticidas sanguíneos). B Fármacos que afectam os hipnozoítas exoeritrocitário e resultam em cura radical de P. vivax e P. ovale. C Fármacos que bloqueiam a ligação entre o estado exoeritrocitário e o estado eritrocitário (usados para quimioprofilaxia). D Fármacos que impedem a transmissão e, portanto, o aumento do reservatório humano da doença [13]. FÁRMACOS UTILIZADOS NO TRATAMENTO DO ATAQUE AGUDO Os agentes esquizonticidas sanguíneos (figura 1, local de acção A) são utilizados no tratamento do ataque agudo e são também conhecidos como fármacos para cura clínica ou supressiva. Actuam sobre as formas eritrocitárias do plasmódio e estes fármacos podem constituir a cura nos casos de infecção por P. falciparum ou P. malariae uma vez que estes não contêm o estado exoeritrocitário. Por outro lado, no caso de infecção por P. ovale ou P. vivax, os fármacos suprimem o ataque propriamente dito, mas as formas exoeritrocitárias podem causar recidivas posteriores. Como exemplos de fármacos existem os quinolina-metanóis (por exemplo, a quinina e a mefloquina), diversas 4-aminoquinolinas (por exemplo, a cloroquina), a 9

halofantrina, o fenantreno, agentes que interferem na síntese do folato (por exemplo, sulfonas) ou na acção deste (por exemplo, pirimetamina e proguanilo), bem como a atovaquona. Muitas vezes, os fármacos são utilizados na forma de combinações com outros agentes, como é o caso dos antibióticos, a tetraciclina e a doxiciclina, que quando combinados com os fármacos supracitados se mostraram úteis [13]. FÁRMACOS QUE PRODUZEM CURA RADICAL Os agentes esquizonticidas teciduais produzem a cura radical por actuarem sobre os parasitas do fígado (figura 1, local de acção B). Apenas as 8-aminoquinolinas (por exemplo, a primaquina e a tafenoquina) apresentam essa acção. Estes fármacos também destroem os gametócitos e reduzem, assim, a disseminação da infecção [13]. FÁRMACOS UTILIZADOS PARA QUIMIOPROFILAXIA Os agentes profiláticos causais correspondem aos fármacos de tratamento profilático. Estes bloqueiam a ligação entre o estado exoeritrocitário e o estado eritrocitário, impedindo o desenvolvimento de ataques de malária. A verdadeira profilaxia causal, ou seja, a prevenção da infecção pela destruição dos esporozoítas na altura da entrada no hospedeiro, não é possível hoje em dia com os fármacos disponíveis, embora possa vir a ser possível com o uso de vacinas. Agora, a prevenção do desenvolvimento dos ataques clínicos pode ser obtida através de agentes quimioprofiláticos que matam o parasita quando este emerge do fígado após o estado pré-eritrocitário (figura 1, local de acção C). Os fármacos utilizados para este fim, são principalmente os já mencionados: cloroquina (para áreas sem resistência a P. falciparum), mefloquina (para áreas com resistência à cloroquina por parte da P. falciparum), proguanilo, pirimetamina, dapsona e doxiciclina (para profilaxia terminal de infecções por P. vivax e P. ovale). Geralmente, estes fármacos são utilizados em combinação. Este tipo de agentes quimioprofiláticos é administrado a indivíduos que viajam para zonas do globo onde a malária é endémica [13], [14]. 10

FÁRMACOS UTILIZADOS NA PREVENÇÃO DA TRANSMISSÃO Os agentes gametocidas (por exemplo a primaquina, o proguanilo e a pirimetamina) têm uma acção adicional de destruir os gametócitos (figura 1, local de acção D), impedindo a transmissão da doença pelo mosquito e prevenindo, assim, o reservatório humano da doença. Contudo, estes agentes raramente são utilizados apenas para esta acção [13]. NOVOS FÁRMACOS ANTIMALÁRICOS Hoje em dia estão a ser estudados novos fármacos para o tratamento da malária com resultados positivos obtidos em animais. A pionaridina, que é activa contra P. falciparum e P. vivax, também exibe actividade contra P. falciparum resistente à cloroquina. Já a lumefantrina é eficaz contra Pneumocystis carinii quando utilizada em combinação com mefloquina ou derivados de artemisinina e é estruturalmente relacionada com a quinina [13]. 11

Tabela 1 Principais Fármacos antimaláricos [14]. FÁRMACO CLASSE APLICAÇÃO Cloroquina Tratamento e quimioprofilaxia da infecção por parasitas sensíveis Amodiaquina 4-aminoquinolina Tratamento da infecção por algumas das estirpes de P. falciparum resistentes à cloroquina Quinina Tratamento oral da infecção por P. falciparum resistente à cloroquina Quinidina Quinolina-metanóis Terapia intravenosade infecções severas por P. falciparum Mefloquina Quimioprofilaxia e tratamento de infecções por P. falciparum Primaquina 8-aminoquinolina Cura radical e profilaxia terminal de infecções por P. vivax e P. ovale Tratamento de infecções por algumas Sulfadoxina-pirimetamina estirpes de P. falciparum Combinação de antagonista de Tratamento de infecções por P. folato Clorproguanilo-dapsona falciparum resistente a combinações de fármacos na África Atovaquona-Proguanilo Combinação de antagonista de Tratamento e quimioprofilaxia de quinona-folato infecções por P. falciparum Proguanilo Antagonista de folato Quimioprofilaxia (com cloroquina) Doxiciclina Tetraciclina Tratamento (com quinina) de infecções com P. falciparum; quimioprofilaxia Halofantrina Fenantreno metanol Tratamento de infecções por algumas estirpes de P. falciparum resistentes à cloroquina Lumefantrina Amil álcool Tratamento de malária por P. falciparum em combinação fixa com arteméter Artemisinina Tratamento de infecções por P. Endoperóxidos de lactona falciparum resistente a combinação de sesquiterpeno fármacos 12

4-AMINOQUINOLINAS CLOROQUINA A Cloroquina tem sido o fármaco de eleição tanto para tratamento como para quimioprofilaxia da malária desde os anos 40 mas a sua eficácia contra P. falciparum tem vindo a ficar seriamente comprometida devido à resistência ao fármaco. Contudo, permanece como o fármaco de eleição no tratamento contra P. Figura 4 Estrutura da Cloroquina. falciparum sensível e para outras espécies de parasitas da malária humana. Quando não é limitada pela resistência, a acção da cloroquina é muito eficaz como esquizonticida sanguíneo. Também é moderadamente eficaz contra os gametócitos de P. vivax, de P. ovale e de P. malariae mas não de P. falciparum. Também não é eficaz contra os parasitas no estado hepático. O mecanismo de acção da cloroquina é controverso. Provavelmente actua prevenindo a polimerização do heme (produto de degradação da hemoglobina) em hemozoína, provocando assim a toxicidade ao parasita devido à acumulação de heme livre [14]. AMODIAQUINA A Amodiaquina é estreitamente relacionada com a cloroquina, e provavelmente partilha o mesmo mecanismo de acção e resistência com esse fármaco. É amplamente utilizado para tratamento da malária devido ao seu baixo custo, toxicidade limitada e, em algumas áreas, devido à sua eficácia Figura 5 Estrutura da Amodiaquina. contra estirpes de P. falciparum resistentes à cloroquina. Toxicidades importantes da amodiaqina, incluindo agranulocitose, anemia aplástica, e hepatotoxicidade têm limitado o uso do fármaco nos últimos anos. Contudo, uma reavaliação recente mostrou que a toxicidade séria proveniente da amodiaquina é rara e já é defendida a sua utilização como substituição para a cloroquina em áreas com grandes taxas de resistência e com recursos limitados [14]. 13

QUINOLINA-METANÓIS QUININA E QUINIDINA A Quinina e a Quinidina prevalecem como sendo as terapias de primeira linha para a malária por P. falciparum especialmente para as formas severas da doença apesar da toxicidade poder complicar a terapia. A resistência à quinina é incomum mas cada vez mais recorrente na actualidade. Figura 6 Estrutura da Quinina. A quinina é primeiramente metabolizada no fígado e excretada na urina. Tem actuação rápida, e é um esquizonticida sanguíneo altamente eficaz contra as quatro espécies de parasitas da malária humana. O fármaco é gametocida contra P. ovale e P. vivax mas não contra P. falciparum. Não é eficaz contra os estados hepáticos do parasita e o seu mecanismo de acção ainda é desconhecido [14]. MEFLOQUINA A Mefloquina é uma terapia eficaz contra muitas estirpes de P. falciparum resistentes à cloroquina e contra outras espécies. Apesar da toxicidade ser uma preocupação, a mefloquina, este é um dos fármacos quimioprofiláticos recomendado para utilização na maioria das regiões onde a malária é endémica e onde existem as estirpes resistentes à cloroquina. Figura 7 Estrutura da Mefloquina. A sua acção antimalárica deve-se à sua forte actividade esquizonticida sanguínea contra P. falciparum e P.vivax, contudo não é eficaz contra estados hepáticos ou gametócitos. O mecanismo de acção da mefloquina ainda é desconhecido [14]. 8-AMINOQUINOLINAS 14

PRIMAQUINA A Primaquina é o fármaco de eleição para a irradicação das formas hepáticas dormentes de P. vivax e P. ovale, uma vez que é o único agente activo contra estes dois estados hipnozoítas dormentes. É activo contra os estados hepáticos de todos os parasitas e para além disso, também é gametocida contra as quatro espécies da malária Figura 8 Estrutura da Primaquina. humana. Actua contra os parasitas no estado eritrocítico mas esta actividade é fraca e não apresenta um papel antimalárico importante. O mecanismo de acção ainda não é conhecido [14]. INIBIDORES E ANTAGONISTAS DE FOLATO O metabolismo do folato é crítico para a viabilidade dos parasitas da malária, tendo um papel essencial na sobrevivência e crescimento celular no hospedeiro. A deficiência em folato que surge na infecção por malária é particularmente importante em mulheres grávidas infectadas, uma vez que pode ser prejudicial para o feto [15]. PIRIMETAMINA, PROGUANILO E SULFADOXINA A Pirimetamina e o Proguanilo são ambos fármacos que actuam lentamente contra as formas eritrocíticas das estirpes susceptíveis das quatro espécies da malária humana. O Proguanilo também apresenta alguma actividade contra as formas hepáticas do parasita mas nenhum dos dois é adequadamente gametocida ou eficaz contra os estados hepáticos persistentes de P. ovale e P. vivax. Os mecanismos de acção da Pirimetamina e do Proguanilo recaem na inibição selectiva da dihidrofolato reductase plasmodial, que é uma enzima chave nas vias de síntese de folatos. Figura 9 Estrututra da Pirimetamina. Figura 10 Estrutura da Sulfadoxina. 15

A Sulfadoxina é fracamente activa contra esquizontes eritrocíticos mas não contra os estados hepáticos ou contra os gametócitos. Ela não é utilizada sozinha mas torna-se altamente eficaz quando utilizada em combinação com outros agentes. O seu mecanismo de acção baseia-se na inibição de uma outra enzima na via de síntese de folatos a dihidropteroato sintase [14]. COMBINAÇÃO DE ANTAGONISTAS DE QUINONA-FOLATO ATOVAQUONA A Atovaquona é uma hidroxinaftoquinona que foi inicialmente desenvolvida como um antimalárico para efeitos de profilaxia. O seu mecanismo de acção é ainda incerto, contudo, parece estar envolvida na interferência da cadeia transportadora de electrões na mitocôndria anulando o potencial de membrana na Figura 11 Estrutura da Atovaquona. mitocôndria. É administrado como multifármaco juntamente com o proguanilo (Malarona) [14]. A Atovaquona tem uma potente acção contra espécies de P. falciparum quando combinada com proguanilo apresentando simultaneamente uma baixa toxicidade. É um fármaco lipofílico e apresenta uma actividade mais demarcada contra os estados eritrocíticos do parasita. É também activo contra os estados hepáticos de P. falciparum mas não contra os hipnozoítos de P. vivax [7]. TETRACICLINAS (ANTIBIÓTICOS) DOXICICLINA A Tetraciclina e a Doxiciclina são activas contra os esquizontes eritrocíticos de todos os parasitas da malária humana e não são activas nos estados hepáticos. A doxiciclina é normalmente utilizada no tratamento da malária por P. falciparum Figura 12 Estrutura da Doxiciclina. 16

em conjunto com a quinidina e a quinina e tem-se tornado um fármaco quimioprofilático padrão em zonas com altas taxas de resistência a outros antimaláricos, incluindo a mefloquina. O seu mecanismo de acção ainda não é conhecido mas pensa-se que possa inibir a síntese proteica ou outras funções ao nível da mitocôndria ou do apicoplasto [14]. DERIVADOS DO FENANTRENO-METANOL HALOFANTRINA A halofantrina é um fármaco eficaz apenas contra os estados eritrocíticos das quatro espécies da malária humana. Apresenta alguma toxicidade e devido a este motivo não é utilizado para quimioprofilaxia. O seu mecanismo de acção ainda é desconhecido. É rapidamente eficiente contra a maioria das estirpes de P. falciparum resistentes à Figura 13 Estrutura da Halofantrina. cloroquina mas pode ocorrer resistência cruzada juntamente com a mefloquina [14]. DERIVADOS DO AMIL-ÁLCOOL LUMEFANTRINA A Lumefantrina é um amil-álcool relacionado com a halofantrina e é altamente eficaz no tratamento da malária por P. falciparum. Actualmente tem sido seleccionada como fármaco para terapia de primeira linha para a malária em muitos países Africanos devido à sua grande eficácia contra P. falciparum e por não apresentar a toxicidade que a halofantrina apresenta [14]. Figura 14 Estrutura da Lumefantrina. 17

ENDOPERÓXIDO DE LACTONA DE SESQUITERPENOS ARTEMISININA A artemisinina é o princípio activo de uma planta medicinal que é utilizada como antipirético na China há 2000 anos. Devido ao facto de ser insolúvel, foram sintetizados análogos da artemisinina para melhorar as solubilidades e as acções antimaláricas. Os análogos mais importantes são o artesunato (solúvel em água e Figura 15 Estrutura da Artemisinina. útil para administrações intra-venosas, intra-musculares e rectais) e o arteméter (solúvel em lípidos e útil para administração oral, intra-muscular e rectal). A artemisinina e os seus análogos são esquizonticidas sanguíneos de actuação muito rápida contra todos os parasitas da malária humana e não apresentam actividade antimalárica contra os estados hepáticos. O seu mecanismo de acção pode dever-se à produção de radicais livres após a clivagem das pontes de endoperóxido da artemisinina catalizada pelo ferro ou através da inibição da Cálcio ATPase do parasita. As Artemisininas, em particular o artesunato e o arteméter, têm desempenhado papéis cada vez mais importantes no tratamento da malária por P. falciparum resistente a multifármacos. São os únicos fármacos confiáveis no tratamento contra estirpes resistentes à quinina. Contudo, a sua eficácia é reduzida devido ao pequeno tempo de meia vida que apresenta no plasma, sendo assim pouco úteis na quimioprofilaxia. As artemisininas parecem ser melhor toleradas que a maioria dos antimaláricos e na intenção de contornar a resistência a multifármacos, estas são vulgarmente administradas na forma de combinação arteméter e lumefantrina, artesunato e amodiaquina, artesunato e mefloquina, artesunato e sulfadoxina e pirimetamina. 18

Resistência a fármacos Três das espécies de plasmódio que infectam humanos com malária podem conferir resistência a fármacos antimaláricos, sendo estas Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax e Plasmodium malariae. Resistência é definida como a habilidade da estirpe parasitária sobreviver e multiplicar-se, apesar da administração e absorção da medicação dada em doses iguais ou superiores àquelas usualmente recomendadas, mas dentro da tolerância do sujeito (OMS 1967), sendo, posteriormente, modificada de modo a incluir a frase A forma da droga activa contra o parasita deve ser capaz de obter acesso ao parasita ou ao eritrócito infectado para a duração do tempo necessário para sua acção normal. Esta modificação na definição de resistência teve como base um novo desenvolvimento na compreensão do metabolismo humano da sulfonamida. Uma vez que a farmacocinética dos medicamentos antimaláricos varia bastante entre indivíduos, a definição de resistência também inclui o perfil da concentração da substância activa em causa. Isto pode ser ilustrado num caso de um pró-fármaco que não está activo sob a forma ingerida e requer a conversão química por processos metabólicos, tornando-se então activo. Neste caso, a definição de resistência deve incluir uma exigência de um perfil padrão do metabolito biologicamente activo. A resistência aos fármacos antimaláricos é conferida por eventos genéticos espontâneos, raros, e pensa-se que estes são independentes do fármaco utilizado. Estes acontecimentos são mutações ou alterações no número de cópias de genes que estão relacionados com a metabolização do fármaco, ou então relacionam-se com o efluxo de bombas que afectam as concentrações do fármaco intraparisitário. Tanto múltiplos acontecimentos génicos ligados (epistasia) como um único evento podem ser o suficiente para o desenvolvimento de resistência. Ainda se pode ter resistência a multifármacos. Esta ocorre quando há alguns fármacos que pertencem à mesma família química ou que têm modos de acção semelhantes. A resistência a multifármacos de P. falciparum é visto quando o parasita é resistente a mais de dois compostos antimaláricos operacionais de classes químicas diferentes e modos de acção diferentes. Geralmente, as duas primeiras classes afectadas são as 4-aminoquinolinas e os antifolatos (diaminopirimidina, sulfonamidas). 19

A resistência a fármacos resulta num atraso ou falta de parasitas assexuados a partir do sangue, que permite a produção de gametócitos que são responsáveis pela transmissão do genótipo resistente. Assim, o aumento da resistência a fármacos antimaláricos tem mudado a epidemiologia mundial. EFEITO DA RESISTÊNCIA DOS FÁRMACOS ANTIMALÁRICOS AO NÍVEL DO CONTROLO DA MALÁRIA GLOBAL [16] Carga da doença o O aparecimento de resistência à cloroquina em África conduziu a um aumento de internações no hospital; o Aumentar as tendências da mortalidade foram encontradas ao nível da comunidade; o O tratamento ineficaz provoca anemia e baixo peso ao nascer e torna a saúde das crianças e adultos infectados com o P. falciparum e P. vivax mais frágeis; o Resistência a antimaláricos estiveram, pelo menos parcialmente, nos casos de malária epidemias; o A resistência a antimaláricos está associado a uma transmissão aumentada. Custo económico o A resistência a antimaláricos tem aumentado o custo global do controlo da doença, incluindo o custo de desenvolvimento de novos medicamentos; o Falha terapêutica exige a consulta numa unidade de saúde para diagnóstico e tratamento, resultando na perda de dias de trabalho para os adultos, a ausência de escola para crianças e aumento do custo para o sistema de saúde. Alteração da distribuição das espécies de malária 20

o A proporção de malária por P. falciparum mudou, como o aumento de relação ao P. vivax. Acesso a tratamento de alta qualidade o O tratamento ineficaz no sector público, devido a resistência, poderia levar a uma maior dependência dos pacientes sobre o sector privado não regulamentado, o que poderia aumentar o uso de monoterapia ou medicamentos à falsificação e aumentar o risco de resistência a fármacos. EMERGÊNCIA DE MUTAÇÕES GENÉTICAS Certos autores consideram que o desenvolvimento da resistência ocorre em duas fases, em que a primeira, se considera o acontecimento genético inicial que origina o mutante resistente (mutação de novo). Esta modificação genética confere ao parasita uma vantagem de sobrevivência contra ao fármaco. Na segunda fase, os parasitas resistentes são seleccionados e multiplicam-se, eventualmente resultando numa população de parasitas resistentes, não susceptíveis a um tratamento. Tem-se de ter em consideração que estes acontecimentos genéticos que conferem resistência aos antimaláricos são raros e espontâneos. Estas mutações determinam o alvo do fármaco ou então afectam as bombas que regulam as concentrações intraparasiticas do fármaco. Apesar do surgimento de resistência genética aos antimaláricos, algumas medidas podem ser tomadas para minimizar o risco. Por exemplo, em doentes não imunes, quando infectados com um grande número de parasitas, o tratamento inadequado (porque, por exemplo, a má qualidade, má aderência, vómitos de um tratamento oral) confere uma grande fonte de resistência de novo. Isso realça a necessidade de corrigir a prescrição, a adesão a medicamentos prescritos e de prestação de tratamentos eficazes, especialmente para pacientes hiper-parasitémicos [16]. 21

PROPAGAÇÃO DA RESISTÊNCIA A ANTIMALÁRICOS Outra selecção de mutantes resistentes a antimaláricos ocorre quando os parasitas são expostos a concentrações sub-terapêuticas dos fármacos. Isto acontece porque uma concentração do fármaco inadequada vai erradicar só os parasitas que ainda são sensíveis. Em modelos experimentais ( in vitro, animais ou voluntários) as mutações que conferem resistência a antimaláricos têm sido seleccionadas sem a passagem do mosquito, ou seja, sem a recombinação meiótica, quando um grande número de parasitas é exposto a concentrações de fármacos subterapêuticos [16]. A remoção da pressão do fármaco pode reduzir a probabilidade de mutantes resistentes sobreviverem [17], contudo, esta não pode ser sempre removida. Além disso, a propagação da resistência depende da transmissão e posterior recrudescimento de uma infecção que tem originado parasitas de malária resistente de novo. Portanto, a produção de gametócitos deve ser evitada pela administração de um tratamento precoce adequado. Há um intervalo de tempo para a selecção, durante a qual os níveis de fármaco permitem um benefício de sobrevivência mais sensível á estirpe do parasita resistente. Antes disso, as concentrações do fármaco são altas o suficiente para matar os parasitas parcialmente resistente, após esse tempo, as concentrações do fármaco são muito baixas, e as linhagens do parasita sensíveis irão sobreviver [18]. A propagação subsequente de mutantes resistentes do parasita da malária é facilitada pela administração de fármacos com fases de eliminação longa. A actividade residual antimaláricos que está presente durante o período pós-tratamento, serve como um filtro selectivo, que previne a infecção por parasitas sensíveis, mas permite que a infecção por parasitas resistentes. Fármacos como a mefloquina, cloroquina e piperaquina, que persistem no sangue durante meses, fornecem um filtro selectivo longo depois da sua administração ter cessado. FACTORES QUE INFLUENCIAM A PROPAGAÇÃO DA RESISTÊNCIA Factores que influenciam o desenvolvimento da resistência a fármacos antimaláricos: o A frequência intrínseca com as alterações genéticas que ocorrem; 22

o o o o o o o o o O grau de resistência conferida pela variação genética; A proporção de todos os agentes infecciosos transmissíveis expostos à droga (pressão de selecção); O número de parasitas expostos à droga; As concentrações de fármaco a que os parasitas são expostos; A farmacocinética e farmacodinâmica dos medicamentos antimaláricos; Dosagem, tempo de adesão, qualidade, disponibilidade e distribuição de padrões do uso de fármacos; O perfil da imunidade da comunidade e do indivíduo; A presença simultânea de outros fármacos ou substâncias no sangue ao qual o parasita é não resistente; A intensidade de transmissão. Apesar do actual debate sobre se a resistência surge mais rapidamente em ambientes com baixa ou alta transmissão [19], estudos epidemiológicos têm implicado configurações de baixa transmissão como origem primária de resistência a fármacos [20]. Isto é, provavelmente, devido ao facto de que em áreas de transmissão baixa, a maioria das infecções da malária são sintomáticos e, portanto, proporcionalmente, mais pessoas recebem o tratamento, oferecendo mais oportunidades selecção. Áreas de alta transmissão parecem ser menos susceptíveis ao aparecimento de resistência aos fármacos, principalmente porque a maioria das infecções de malária são assintomáticas e são adquiridas várias vezes ao longo da vida. A taxa na qual premunição é adquirida depende da intensidade de transmissão. Além disso, infecções complexas policlonais em pessoas semi-imunes permitem a possibilidade de desenvolvimento de possíveis mecanismos de resistência multigénica ou concorrência no hospedeiro ou o mosquito [21]. A imunidade pode também reduzir consideravelmente o aparecimento e disseminação da resistência. A defesa do hospedeiro tem um grande efeito antiparasitário, e qualquer parasita resistente a fármacos ani-maláricos gerado espontaneamente deve lidar não só com as concentrações de medicamentos antimaláricos, mas também com a imunidade do hospedeiro, que mata os parasitas, independentemente da sua resistência aos antimaláricos e reduz a probabilidade de sobrevivência do parasita (independente dos fármacos), isto, em todas as fases do ciclo de transmissão. A imunidade inata elimina parasitas do sangue, incluindo mutantes 23

resistentes de novo, e também melhora as taxas de cura, mesmo com os fármacos, reduzindo assim, a vantagem de transmissão dos parasitas resistentes. Mesmo que um mutante resistente sobreviva ao tratamento inicial e, a probabilidade de formação de gametócitos suficientes para a transmissão é reduzida como resultado de imunidade à fase assexuada (o que reduz a taxa de multiplicação e reduz a densidade em que a infecção é controlada) e para a fase sexual. MARCADORES GENÉTICOS DA RESISTÊNCIA Um número limitado de genes envolvidos ou potencialmente envolvidos na resistência a antimaláricos do P. falciparum foram identificados: os genes que codificam o dihidrofolato redutase (Pfdhfr), sintase dihydropteroate (Pfdhps), o transportador de resistência à cloroquina (pfcrt), a multirresistência uma proteína (Pfmdr1), Na + / H + (Pfnhe-1) e citocromo b. Embora tenha havido algum sucesso na identificação dos marcadores moleculares de resistência de muitos medicamentos antimaláricos são necessárias mais pesquisas para identificar para outros antimaláricos, em particular, a artemisinina. O conhecimento actual sobre os marcadores moleculares de resistência a vários tratamentos antimaláricos está resumido abaixo. PIRIMETAMINA E CICLOGUANIL Estudos com o gene Pfdhfr têm mostrado consistentemente a importância para uma mutação pontual no codão Ser108Asn levando a um fenótipo resistente de P. falciparum. Mutações pontuais adicionais nas posições Asn51Ile, Cys59Arg e Ile164Leu reforçam a resistência de P. falciparum. A resistência aumenta com o número de mutações. A resistência de cicloguanil parece estar associada com o dobro das mutações Ser108Thr e Ala16Val [22]. Na América do Sul, a mutação no codão 59 é menos comum e é substituída pela mutação Cys50Arg e pela inserção repetitiva de cinco aminoácidos entre os codões 30 e 31. Esta inserção repetitiva é encontrada associada com mutação Ile164Leu e levando ao fracasso do tratamento [23]. Outra mutação associada com a mutação encontrada em Ile164Leu foi encontrada na Tailândia. 24

SULFADOXINA O mecanismo de resistência à sulfadoxina tem sido associado com cinco mutações pontuais, no codons Ser436Ala/Phe, Ala437Gly, Lys540Glu, Ala581Gly e Ala613Thr/Ser do gene Pfdhps. As mutações em 437 e 540 conferem algum grau de resistência, as mutações 436, 581 e 613 contribuem para um maior grau de resistência [22]. SULFADOXINA-PIRIMETAMINA Na quimioterapia antimalárica, sulfadoxina é sempre combinada com a pirimetamina. A actividade antimalárica desta associação baseia-se na inibição específica de duas enzimas sucessivas na biossíntese de ácido fólico, com acção sinérgica subsequentes. Diversas mutações em ambos os genes, Pfdhfr e Pfdhps, são necessárias para induzir a falha do tratamento com a combinação sulfadoxinapirimetamina, tais como mutações triplas nos codões 108, 51 e 59 do gene Pfdhfr e mutações duplas nos codões 437 e 540 do gene Pfdhps [24]. Em estudos populacionais, as mutações no codão 59 do gene Pfdhfr e codão 540 do gene Pfdhps são fortemente sujeitas a insucesso do tratamento. Uma quíntupla mutação genética pode criar as condições necessárias para o surgimento da mutação Ile164Leu no gene Pfdhfr e da mutação Ala581Gly no gene Pfdhps [25]. A relação entre o genótipo do parasita e da resposta terapêutica à sulfadoxinapirimetamina é influenciada pelo parasita, farmacocinética e factores humanos. Quando um parasita tem o gene Pfdhfr selvagem (sem mutação), o risco de fracasso é comum, independentemente dos alelos Pfdhps. Em contraste, o risco aumenta com o número de mutações no gene Pfdhfr, particularmente quando há uma mutação adicional no gene Pfdhps ou quando a imunidade está a falhar [23]. Como resultado, apesar de sulfadoxina-pirimetamina permanecer em vigor, a emergência de uma ou duas mutações podem aumentar a transmissão da malária e a disseminação da resistência [26]. 4-AMINOQUINOLINAS O gene pfcrt está situado no cromossoma 7 e codifica uma proteína de transporte na membrana vacuolar. Este gene desempenha um papel importante na determinação do fenótipo de resistência à cloroquina, quando a lisina é substituída no codão 76 de treonina. Esta mutação está associada a diferentes conjuntos de mutações noutros 25

codões, mais comumente Cys72Ser, Met74Ile, Asn75Glu, Ala220Ser, Gln271Glu, Asn326Ser, Ile356Thr e Arg371Ile, embora o conjunto específico de acompanhar as mutações depende do sítio geográfico. O gene Pfmdr1, que está situado no cromossoma 5 também tem gerado interesse no contexto da resistência à cloroquina. As mutações para Pfmdr1 que têm sido associados com resistência à cloroquina são Asn86Tyr, Tyr184Phe, Ser1034Cys, Asn1042Asp e Asp1246Tyr. A instabilidade do linkage entre a mutação Lys76Thr no gene pfcrt e a mutação no Asn86Tyr no gene Pfmdr1 tem sido observado em alguns estudos. Alguns isolados resistentes à cloroquina têm demonstrado resistência cruzada com amodiaquina, tanto in vivo como in vitro. Os alelos Pfcrt e Pfmdr1 interagem para produzir diferentes níveis de resistência à cloroquina e amodiaquina. As mutações nos codões 72-76 do gene pfcrt observado na América do Sul estão associados com altos níveis de resistência à amodiaquina, enquanto mutações no gene pfcrt, no Sudeste da Ásia e África, estão ligadas a uma maior resistência à cloroquina e resistência moderada à amodiaquina. Esta diferença pode ser devido à extensão do uso prévio de amodiaquina em diferentes regiões. A resistência à amodiaquina também pode ser modulada por mutações Asn86Tyr e Asn1042Asp no gene Pfmdr1 [16]. AMINO-ÁLCOOIS O gene Pfmdr1 também tem sido implicado na resistência a amino-álcoois e na resistência à artemisinina. Estudos realizados mostraram que os aumentos em número de cópias desse gene são responsáveis pela resistência à mefloquina e um aumento do risco de falha do tratamento com artesunato-mefloquina e arteméter-lumefantrina (quatro doses de regime somente) [27]. A susceptibilidade in vitro à mefloquina, halofantrina, quinina e artemisinina aumenta quando o número de cópias do gene Pfmdr1 são reduzidos ou quando os parasitas realizado acarretam mutações no gene Pfmdr1 [28]. A amplificação e desamplificação do gene Pfmdr1 são relativamente, acontecimentos frequentes que estão relacionados com a rápida evolução da resistência à mefloquina, isto, quando o fármaco é usado como monoterapia. Em vários estudos, arteméter-lumefantrina apareceram para seleccionar o tipo selvagem do aleno Asn86 do gene Pfmdr1 em infecções de repetição, uma vez que, poderia ser um marcador de susceptibilidade reduzida à lumefantrina [29]. 26

QUININA É difícil demonstrar resistência à quinina. No cromossoma 13 de P. falciparum existe um gene candidato (Pfnhe-1) [30]. Estudos com clones isolados de campo indicam que Asn86Tyr, Ser1034Cys, Asn1042Asp e mutações Asp1246Tyr podem estar associados à susceptibilidade diminuída da quinina. Tal como a resposta à cloroquina, a quinina é influenciada por mutações nos genes transportador diversas (pfcrt, Pfmdr1 e Pfnhe-1) [16, 31]. ARTIMISININA Na malária por P. falciparum, pensa-se que a artemisinina inibe a bomba Ca 2+ - ATPase (SERCA) do retículo endoplasmático do parasita, isto porque se observou que o polimorfismo no seu gene, PfATP6, está relacionado com a resistência, in vitro, à arteméter em espécies isoladas P. falciparum [32], no entanto, é pouco provável de ser o único alvo [33]. Um marcador molecular para resistência à arteméter foi proposto, PfATPase6 Ser769Asn, mas esta sugestão baseia-se, exclusivamente, em resultados de testes in vitro, o que não confirma esta hipótese [34]. A amplificação do gene Pfmdr1 está associada a reduções relativamente pequenas, mas significativas na suscetibilidade à artemisinina, o que poderia explicar a resistência cruzada observada entre os aminoálcoois e artemisininas, isto in vitro [35]. ATOVAQUONA Análise molecular de isolados demonstrou que a resistência atovaquona está ligada a uma única mutação no gene do citocromo b (Tyr268Asn, Tyr268Ser ou Tyr268Cys), induzindo um aumento de cerca de 1000 vezes no IC50 para atovaquona. Em estudos anteriores, uma única mutação no citocromo b foi observada a comprometer a eficácia deste medicamento [36]. 27

Conclusão Mecanismos de acção dos antimaláricos e emergência de resistências A malária é uma doença provocada pelo protozoário Plasmodium, sendo que é transmitida ao Homem pelo mosquito Anopheles. Relativamente aos fármacos utilizados para combater esta doença, estes actuam de modo profilático, podendo assim prevenir a doença, enquanto outros podem ser utilizados para tratar ataques agudos. Existem também diferentes antimaláricos que erradicam, selectivamente, o parasita nos seus diferentes estados de desenvolvimento no ciclo de vida, logo, a sua classificação é feita de acordo com essa sua selectividade. Deste modo os antimaláricos actuam, essencialmente, contra o protozoário, sendo que esta doença também pode ser evitada se se evitar o contacto com o vector. Com o aparecimento destes antimaláricos houve também o surgimento da resistência a estes. Esta resistência é conferida por mutações a nível de vários genes que, por exemplo, codificam para bombas essenciais para a metabolização de determinados antimaláricos (exemplo a artimisinina). Depois por selecção natural estes protozoários acabam por ser mais resistentes que os restantes. Assim, pode-se considerar que o melhor método para combater a malária é evitando a picada do mosquito, sendo que, apesar da existência de tantos fármacos antimaláricos, existe já a ocorrência de diversas resistências do parasita a esses fármacos. 28

Referências 1. Cravo, P., Rosário, V. E., Aspectos de genética molecular da resistência aos fármacos antimaláricos. Bio-medicina e saúde pública. 2. Guerin, P.J., Olliano, P., et al., Malaria: current status of control, diagnosis, treatment, and a proposed agenda for research and development. Lancet Infectious Diseases, 2002. 2: p. 564-573. 3. Beeson, J.G., Brown, G. V., Pathogenesis of Plasmodium falciparum malaria: the roles of parasite adhesion and antigenic variation. Cellular and Molecular life sciences, 2001. 59: p. 258-271. 4. McGready, R., White, N. J., Nosten, F., Parasitological efficacy of antimalarials in the treatment and prevention of P. falciparum malaria in pregnancy 1998 to 2009: a systematic review. BJOG - International Journal of Obstetrics and Gynecology, 2011. 118: p. 123-135. 5. OMS, Guidelines for treatment of malaria. 2nd Edition ed. 6. Richle, M.A., Srivasan, P., et al., Towards genetic manipulations of wild mosquito populations to combat malaria: advances and challenges. Journal of Experimental Biology, 2003. 206: p. 3809-3816. 7. Goodman, Manual of Pharmacology and Therapeutics. 2008: Mc Graw Hill. 8. Trampuz, A., Jereb, M, et al., Clinical review: severe malaria. Clinical care, 2003. 7: p. 315-323. 9. Mueller, I., Galinski, M. R., et al., Key gaps in the knowledge of Plasmodium vivax, a neglected human malaria parasite. Lancet Infectious Diseases, 2009. 9: p. 555-566. 10. Collins, W.E., Jeffery, G. M., Plasmodium ovale: Parasite and disease. Clinical Microbiology reviews, 2005. 18: p. 570-581. 11. Collins, W.E., Jeffery, G. M., Plasmodium malariae: Parasite and disease. Clinical Microbiology reviews, 2007. 20: p. 579-592. 12. Pasvol, G., The treatment of complicated and severe malaria. Br Med Bull, 2005. 75-76: p. 29-47. 13. Rang, H., Farmacologia. 5ª Edição ed. 2004: Elsevier. 14. Katzung, B., Basic and Clinical Pharmacology. 10th ed. 2006: Mc Graw Hill. 15. Chango, A., Najar, L. A., Folate metabolism pathway and Plasmodium falciparum malaria infection in pregnancy. LA Nutrition reviews, 2011. 69: p. 34-40. 16. OMS, Global report on Antimalarial drug efficacy and drug resistance: 2000-2010. 17. Felger, I., Beck, H. P., Fitness costs of resistance to antimalarial drugs. Trends Parasitol, 2008. 24: p. 331-333. 18. Stepniewska, K., White, N. J., Pharmacokinetic determinant of the window of selection for antimalarial drug resistance. Antimoicrob Agents Chemother, 2008. 52: p. 1589-1596. 19. Hastings, I.M. and M.J. Mackinnon, The emergence of drug-resistant malaria. Parasitology, 1998. 117 ( Pt 5): p. 411-7. 20. Roper, C., et al., Intercontinental spread of pyrimethamine-resistant malaria. Science, 2004. 305(5687): p. 1124. 21. Dye, C., Williams, B. G., Multigenic drug resistance among inbred malaria parasites. Proc Biol Sci, 1997. 264: p. 61-67. 22. Hyde, J., Drug-resistant malaria - an insight. FEBS Journal, 2007. 274: p. 4688-4698. 23. Bacon, D., McCollum, A. M., et al., Dynamics of Malaria Drug Resistance Patterns in the Amazon Basin Region following Changes in Peruvian National Treatment Policy for Uncomplicated Malaria. Antimocrob Agents Chemotherapy, 2009. 53: p. 2042-2051. 29

24. Kublin, J.G., Dzinjalamala, F. K., et al., Molecular Markers for Failure of Sulfadoxine- Pyrimethamine and Chlorproguanil-Dapsone Treatment of Plasmodium falciparum Malaria. The Journal of Infectious Diseases, 2002. 185: p. 380-388. 25. Lynch, C., Pearce, R., et al., Emergence of a dhfr mutation conferring high-level drug resistance in Plasmodium falciparum populations from southwest Uganda. Journal of Infectious Diseases, 2008. 197: p. 1598-1604. 26. Mendez, F., Muñoz, A., et al., Determinants of treatment response to sulfadoxinepyrimethamine and subsequent transmission potential in P. falciparum malaria. American Journal of Epidemiology, 2002. 156: p. 230-238. 27. Ashley, E., Price, R., et al., In vivo sensitivity monitoring of mefloquine monotherapy and artesunate-mefloquine combinations for the treatment of uncomplicated falciparum malaria in Thailand in 2003. Tropical Med Int Health, 2006. 11: p. 1898-1899. 28. Nkhoma, S., Nair, S., et al., Parasites bearing a single copy of the multi-drug resistance gene (pfmdr-1) with wild-type SNPs predominate amongst Plasmodium falciparum isolates from Malawi. Acta Trop, 2009. 111: p. 78-81. 29. Sowunmi, A., Gbotosho, G. O., et al., Therapeutic efficacy and effects of artesunatemefloquine and mefloquine alone on malaria-associated anemia in children with uncomplicated Plasmodium falciparum malaria in southwest Nigeria. American Journal Trop Med Hyg, 2009. 81: p. 979-986. 30. Ferdig, M.T., Cooper, R. A., et al., Dissecting the loci of low-level quinine resistance in malaria parasites. Molecular Microbiology, 2004. 52: p. 985-997. 31. Eckland, E.H., Fidock, D. A., Advances in understanding the genetic basis of antimalarial drug resistance. Current Opin. Microbiol., 2007. 10: p. 363-370. 32. Krishna, S., Woodrow, C. J., et al., Re-evaluation of how artemisinins work in light of emerging evidence of in vitro resistance. Trends Mol Med., 2006. 12: p. 200-205. 33. Valderramos, S.G., Scanfeld, D., et al., Investigations into the role of the Plasmodium falciparum SERCA (PfATP6) L263E mutation in artemisinin action and resistance. Antimocrob Agents Chemother, 2010. 54: p. 3842-3852. 34. Tahar, R., Ringwald, P., Basco, L. K., Molecular epidemiology of malaria in Cameroon XXVIII. In vitro activity of dihydroartemisinin against clinical isolates of Plasmodium falciparum and sequence analysis of the P. falciparum ATPase 6 gene. American Journal Trop Med Hyg, 2009. 81: p. 13-18. 35. Chavchich, M., Gerena, L., Peters, J., et al., Role of pfmdr1 amplification and expression in induction of resistance to artemisinin derivatives in Plasmodium falciparum. Antimocrob Agents Chemother, 2010. 54: p. 2455-2464. 36. Musset, L., Bouchaud, O., Matheron, S., et al., Clinical atovaquone-proguanil resistance of Plasmodium falciparum associated with cytochrome b codon 268 mutations. Microbes Infect., 2006. 8: p. 2599-2604. 30