APLICAÇÃO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE EM FUNGO Candida albicans PARA VERIFICAR SUA INFLUÊNCIA NA PROLIFERAÇÃO CELULAR: IN VITRO FARINAZZO, A. F. 1 ; TOFFOLI, L.²; FRIES, L. M. V.³; CAPEL, L.M. M. 4 ; NOWOTNY, J. P. 5 Resumo: O objetivo foi avaliar o efeito do LASER com dose de 2J/cm² e o comprimento de onda a 660nm na proliferação do fungo Candida albicans. O trabalho foi realizado in vitro, no primeiro dia: foi preparado o meio e esterilizado os materiais, segundo: ativado o fungo, terceiro: preparo do grupo controle e irradiação do fungo, e no quarto: realizado a contagem com o espectrofotômetro. Foi observado que com a irradiação houve a proliferação celular. Palavras-chave: Candida albicans; fototerapia; LASER. Abstract: The objective was to evaluate the effect of LASER dose of 2J/cm ² and wavelength at 660nm in the proliferation of the fungus Candida albicans. The work was conducted in vitro, on the first day, the medium was prepared and sterilized materials, on the second day: enabled the fungus, third day: preparation of the control group and irradiation of the fungus, and the fourth day conducted the count with the spectrophotometer. It was observed that irradiation was with cell proliferation. Keyword: Candida albicans, phototherapy, LASER. INTRODUÇÃO Os fungos são organismos eucariontes, haploides podendo ser unicelulares ou multicelulares (FISHER; COOK, 2001). Existem relações entre as células fúngicas e as células animais, sendo assim se tornam difícil o tratamento das infecções causadas por fungos, pois existe o risco de combater as células infectadas e também as hospedeiras (FISHER; COOK, 2001, SCHAECHTER et al, 2002, HARVEY; CHAMPE; FISHER, 2008).
A Candida albicans é reconhecida por ser oportunista, hoje ela é vista como a responsável pelas mais graves doenças causadas por fungos (FISHER; COOK, 2001). Elas são encontradas em pequeno número na pele humana porem é capaz de colonizar rapidamente uma pele lesada (FISHER; COOK, 2001). Cremer foi o pioneiro da fototerapia em 1958, onde pouco se sabia sobre o seu mecanismo de ação, seus efeitos colaterais e os equipamentos eram precários (FACCHINI et al., 2000). O tratamento é realizado através da luz a partir de lâmpadas fluorescentes, LASERs e LEDs. (CALIFANO, 2006; CORAZZA, 2005). O LASER possui características como emissão de luz coerente, monocromática, colimada e polarizada com grande concentração de energia que é adequado a produzir alterações físicas e biológicas. (CHAVANTES, 2009; GIRRO; GIRRO, 2002). A interação do LASER com o sistema biológico depende da dosimetria, do comprimento de onda, do tipo do tecido e do tempo de irradiação. Sua aplicação pode resultar em uma inibição ou uma excitação do tecido (AIMBIRE 2006; CASTRO 2005; MEYER et al, 2010). Com o estudo in vitro é possível padronizar a amostra, deixando-a homogênea e controlando a temperatura (CARNEVALLI, 2011). O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito terapêutico da fototerapia, in vitro, utilizando LASER na indução da proliferação celular, tendo como hipótese a ser provada, a eficácia desse meio terapêutico. METODOLOGIA 1 Dia Local de estudo e Meios de cultivo: o estudo foi conduzido no Laboratório de Microbiologia do Centro Universitário de Maringá. O meio de cultura utilizado para o cultivo de Candida albicans foi Caldo Sabouraud com dextrose a 2% e Salina a 0,85% para diluição. Anteriormente ao uso, o meio, estante com ponteira e dois Erlenmeyer lacrados com boneca de algodão e papel craft foram devidamente acondicionados e esterilizados. 2 Dia Ativação do fungo Candida albicans: Dentro do fluxo laminar em temperatura ambiente foi retirado uma alçada do fungo Candida albicans e transferida para um tubo de ensaio contendo Caldo Sabouraud para sua
ativação. A alça bacteriológica foi esterilizada antes e após o procedimento em bico de Bunsen. Em seguida, o tubo contendo a levedura foi levado à estufa para o crescimento por um período de 24 horas em temperatura de 36,5ºC. 3 dia - Irradiação das leveduras: Após 24 horas, o tubo de ensaio contendo C. albicans foi retirado da estufa para que a mesma atingisse a temperatura ambiente, sendo levado ao fluxo laminar em seguida. Dentro do fluxo, foram transferidas 3 a 5 gotas da suspensão de Candida albicans com a ajuda de pipeta automática para um tubo de ensaio contendo 6,0 ml de solução salina 0,85%, onde foi utilizado o tubo número cinco da escala de MacFarland, como padrão de comparação. Em duas placas 96 wells, foram pipetados em cada poço 190µl e Caldo Sabouraud e 10µl da suspensão de levedura preparada em salina. Foram utilizados 24 poços de cada placa sendo selecionados da seguinte forma: na horizontal somente as fileiras ímpares e na vertical as fileiras A, C, E, e G, para que durante a aplicação do LASER o feixe de luz não interferisse nos resultados dos poços próximos. Posteriormente, 200µl de Caldo Sabouraud foram misturados a cada solução. Foi selecionada uma placa aleatória para ser o grupo irradiado e outra para ser o grupo controle, que não sofreu a ação do LASER. Os 24 poços da placa escolhida foram irradiados com o aparelho de LASER da marca KLD, calibragem: Caneta 660nm - 20mw, dose: 2 J/cm², profundidade: superficial, frequência: contínuo. 200µl foram retirados dos 24 poços do grupo controle, sendo depositados em um Erlenmeyer fechado com rolha de algodão e papel craft. O mesmo procedimento foi realizado com o grupo irradiado e assim os dois recipientes foram levados à estufa em 36,5ºC por um período de 24 horas. 4 Dia Contagem. Após 24 horas de incubação foi feita a contagem indireta de crescimento com o auxílio de espectrofotômetro, onde foi padronizada a frequência de 540 nm e descontado o valor do branco (meio de cultura). Antes da leitura, as amostras foram diluídas, onde foi colocado 0,2 ml de Caldo Sabouraud em 2,8 ml de água destilada. CONCLUSÃO
Foi utilizado o programa SPSS 17.0 para verificar os dados, foram analisados as médias e o desvio padrão. O trabalho foi dividido em duas amostras, cinco irradiados cinco controle totalizando 10 grupos. Tabela 1- resultados parciais com a média e o desvio padrão dos grupos. Grupo Nº Média DP p* CONTROLE 5 0,32 ±0,065 0,00* IRRADIADO 5 0,41 ±0,054 0,00* Pode-se concluir que com a irradiação do LASER com a dose de 2J/cm² e comprimento de onda 660nm houve um crescimento celular significante no grupo irradiado em relação ao grupo controle. REFERÊNCIAS AIMBIRE, F.; ALBERTINI, R.; PACHECO, M.T.T.; CASTRO-FARIA-NETO, H.C.; LEONARDO, P.S.L.M.; IVERSEN, V.V.; LOPES-MARTINS.; R.A.B.; BJORDAL J.M. Low-Level Laser Therapy Induces Dose-Dependent Reduction of TNF Levels in Acute Inflammation, In: Photomedicine and Laser Surgery,v. 24, n. 1, p. 33 37, 2006. CALIFANO, A. R. Analise eletromiográfica do músculo masseter e feixe anterior do músculo temporal após indução de fadiga muscular e aplicação de LED (640NM); SP 2006. 93f. Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Bioengenharia do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, 2006. CARNEVALLI, C. M. M. Efeito da radiação do diodo laser (λ=830nm) em cultura de fibroblastos (CHO-k1).São José dos Campos; SP 2001. 69f. Dissertação (Pós-Graduação em Engenharia Biomédica) Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, 2001. CASTRO, J. L. F.; PINHEIRO, A. L. B.; WERNECK, C. E.; SOARES, C. P.; The Effect of Laser Therapy on the Proliferation of Oral KB Carcinoma Cells: An in Vitro Study,In: Photomedicine and Laser Surgery,v. 26, n. 6, p. 586 589, 2005. CHAVANTES, M., C. Laser em Biomedicina : Princípios e Prática. São Paulo: editora Atheneu, 2009, p. 17. CORAZZA. V. A. Fotobiomodulação comparativa entre o Laser e LED de baixa intensidade na angiogênese de feridas cutâneas de ratos; São Carlos; SP 2005. 89f. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Interunidade em Bioengenharia Escola de Engenharia de São Carlos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e Instituto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo. FACHINNI, F. P.; BIANCHI, M. O.; SILVA, B. A. B.. Fototerapia intensiva no tratamento de caso grave de doença hemolítica do recém-nascido. Jornal De Fisioterapia, Rio de Janeiro, p. 387-90. 14 fev. 2000. FISHER, F., COOK, N. B. Micologia: fundamentos e diagnóstico. Rio de Janeiro: editora Revinter, 2001, p. 2-6. GUIRRO, E.; GUIRRO, R. Fisioterapia Dermato-funcional. 3.ed. ver. E amp. São Paulo; Manole, 2007, p. 209-221. HARVEY, R. A.; CHAMPE, P. C;, FISHER, B. D. Microbiologia Ilustrada. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2008, p. 279-288. MEYER, P. F.; ARAÚJO, H.G.; CARVALHO, M.G.F.; TATUM, B.I.S.; FERNANDES, I.C.A.G.; RONZIO,O.A.; PINTO, M.V.M. Avaliação dos efeitos do LED na cicatrização de feridas cutâneas em ratos Wistar. Fisioterapia Brasil, v. 11, n. 6, nov./dez., p. 428-432, 2010. SCHAECHTER, M., ENGLEBERG, N. C., EISENSTEIN, B. I., MEDOFF, G. Microbiologia: Mecanismos das Doenças Infecciosas. Rio de Janeiro: editora Guanabara Koogan, 3 ed., 2002, p. 373-379.