CULTURA DE TECIDOS: HISTÓRICO, CONCEITOS, APLICAÇÕES E ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO AF073 BIOTECNOLOGIA VEGETAL Prof. Dr. Luiz Antonio Biasi
CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS 1.HISTÓRICO 2.CONCEITOS 3.APLICAÇÕES 4.ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
1.HISTÓRICO -Haberlandt (1902) - 1º cultivo de células em solução nutritiva. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien., Math. Naturwiss. K., Abt. (1):111, 69-92. 1902. Experiments on the culture of isolated plant cells. The Botanical Review, Berlin, 35(1):68-88, 1969. (Tradução para inglês). Gottlieb Haberlandt -Hannig (1904) - 1º cultivo de embriões imaturos -Knudson (1922) - 1º cultivo de embriões de orquídeas -White (1934) - Cultivo de ápices radiculares de tomate em meio líquido -Kogh et al. (1934) - Descoberta do AIA
-Skoog e Tsui (1948) - Formação de partes aéreas e raízes em calos de fumo Folke Skoog -Morel e Martin (1952) - Obtenção de dália livre de vírus. Morel, G. and Martin, C. Guerison de dahlias atteints d une maladie a virus. Comptes Rendus de l Académie des Sciences, 235:1324-1325, 1952. -Miller et al. (1955) - Descoberta da cinetina -Skoog e Miller (1957) - Experimento clássico com calo de fumo Balanço auxina/citocinina Carlos Miller Skoog, F. and Miller, C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro. Symposia of the Society for Experimental Biology, 11, 118-131. 1957.
-Steward et al. (1958) e Reinert (1959) - Obtenção de embriões somáticos em calos de cenoura -Morel (1960) - Obtenção de orquídeas livre de vírus -Cocking (1960) - Obtenção de protoplastos -Murashige e Skoog (1962) - Meio de cultura MS -Takebe et al. (1971) - Obtenção de plantas a partir de protoplastos -Murashige et al. (1972) - Microenxertia em Citrus Toshio Murashige -Carlson et al. (1973) - Primeira hibridação somática em fumo. -Larkin e Scowcroft (1981) Variação somaclonal Biologia molecular Transformação genética de plantas
2.CONCEITOS DESENVOLVIMENTO Alterações que ocorrem no organismo ao longo do seu ciclo de vida nos níveis morfológico, fisiológico e bioquímico. CRESCIMENTO Ex: evolução da fase embrionária para planta. Ex: mudança da fase vegetativa para reprodutiva. Mudanças quantitativas irreversíveis. Ex: aumento de biomassa. Ex: aumento de comprimento. DIFERENCIAÇÃO Processo pelo qual as células, os tecidos ou órgãos durante o desenvolvimento, adquirem propriedades metabólicas, estruturais e funcionais distintas daquelas iniciais. DIFERENCIAÇÃO OCORRE PELA REGULAÇÃO NA ESPRESSÃO GÊNICA
DESDIFERENCIAÇÃO CELULAR Retorno de células diferenciadas ao estado meristemático não diferenciado. INDUÇÃO É o desencadeamento de um processo morfogenético pela exposição do explante a um estímulo físico, químico ou biológico. A indução envolve o controle da expressão gênica, embora não seja um fenômeno genético, pois não ocorre ganho ou perda genética (modificação alélica ou genotípica). Refere-se somente a expressão dos genes pré existentes. Em cultura de tecidos, é a sinalização por um fitormônio a uma resposta específica a nível celular. EPIGÊNESE Ativação seletiva e diferencial de genes, envolvendo células receptivas ou tecidos responsivos.
TOTIPOTÊNCIA HABERLANDT (1902) Toda célula vegetal íntegra possui capacidade para reproduzir um organismo inteiro. Rudolf Virchow (1858) TEORIA CELULAR As células são as unidades funcionais de todos os seres viventes Toda a célula nasce de outra célula Schleiden (1838) & Schwann (1839) As plantas são agregados de seres individuais e independentes, denominados de células Células dão origem aos tecidos (Ideias ainda incompletas)
DETERMINAÇÃO Processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma célula torna-se limitado a uma rota específica de morfogênese. A determinação celular diz respeito a uma canalização progressiva no desenvolvimento. COMPETÊNCIA Capacidade das células reagiram a sinais específicos de desenvolvimento. Capacidade das células de expressar um potencial inerente. MORFOGÊNESE Integração entre crescimento (mudanças quantitativas) e diferenciação (alterações qualitativas), mediada por divisão e especialização celular. A morfogênese é o resultado de um complexo controle hormonal múltiplo, espacial e temporal, através da regulação e expressão de sistemas gênicos múltiplos.
CÉLULAS INDIFERENCIADAS São células que mantém as características embrionárias. São isodiamétricas, pouco ou nenhum vacúolo e núcleo grande. Encontram-se nas regiões meristemáticas e embriões. Possuem grande capacidade de divisão celular. CLONES Conjunto geneticamente uniforme de indivíduos, derivados de um único indivíduo por propagação assexuada. CALOS Agregados celulares desorganizados que se originam pela proliferação desordenada de células a partir de tecidos cultivados in vitro.
ÁPICE CAULINAR Porção apical do caule, composto pelo meristema apical mais alguns primórdios foliares. MERISTEMA Conjunto de células indiferenciadas e de características embrionárias, de reduzido tamanho, localizado na porção mais apical das gemas e raízes. Primórdios foliares Meristema EXPLANTE Segmento de tecido ou órgão vegetal que é introduzido in vitro ou subcultivado durante os processos de cultura de tecidos.
3.APLICAÇÕES Produção de mudas em larga escala Micropropagação (organogênese e embriogênese) Produção de material de propagação sadio (livre de virus) Cultura de meristemas + Termoterapia Microenxertia Crioterapia (técnica nova) Resgate de embriões de cruzamentos difíceis Cultivo de embriões zigóticos Conservação de germoplasma Conservação in vitro Criopreservação Obtenção de duplo haploides Cultura de anteras + duplicação cromossômica Obtenção de híbridos somáticos Fusão de protoplastos
Produção de material de propagação sadio (livre de virus)
Cultura de meristema Microenxertia
Produção de mudas em larga escala
Embriogênese somática e produção de sementes sintéticas CARTES R, P. et al. Encapsulated Somatic Embryos and Zygotic Embryos for Obtaining Artificial Seeds of Rauli-Beech (Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst.). Chilean J. Agric. Res., v.69, n.1, p. 112-118, 2009.
Resgate de embriões de cruzamentos difíceis Resgate de embriões de videira Resgate de embriões de arroz Ohnishi et al. (Plant and Cell Physiology 52(7):1249-57. 2011).
Resgate de embriões de mandioca Buttibwa et al. African Journal of Biotechnology. 14(27):2191-2201. 2015
Conservação de germoplasma Rayssa Natasha Barros Mafra & Victor Spies http://www.ebah.com.br/content/abaaafw-eaf/criopreservacao Embrapa Clima Temperado
Conservação in vitro
Obtenção de duplo haploides Produção de duplo-haplóide de alho Fayos et al. Frontiers in Plant Science. 6:384. 2015.
Obtenção de híbridos somáticos Cultura e fusão de protoplastos Fig. 1 Plant regeneration from protoplast fusion experiment of a grass cultivar with a wild species. http://en.phytowelt.com/phytodiversity.html
Fig. 2 Tubers of different somatic hybrids in comparison to the fusion partners (cultivar: upper lines, wild species: lower lines, hybrids: in-between).
4.ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO ESTRUTURA BÁSICA DE UM LABORATÓRIO DE CULTURA DE TECIDOS 1.Sala de preparo de meio de cultura 2.Sala para manipulações assépticas 3.Sala de crescimento climatizada 4.Sala de lavagem de vidraria 5.Escritório 6.Banheiro AMBIENTES ADICIONAIS 1.Antecâmara 2.Almoxarifado 3.Sala de microscopia 4.Sala de biologia molecular ESTRUTURAS EXTERNAS 1.Ambiente para transferência ex vitro 2.Casa-de-vegetação 3.Telados 4.Depósitos
Planta de uma biofábrica Fonte: Rocha (2009)
EQUIPAMENTOS BÁSICOS 1.Sala de preparo de meio de cultura *Balança *phmetro *Agitador magnético *Microondas *Destilador ou Deionizador *Refrigerador *Freezer 2.Sala para manipulações assépticas *Câmara de Fluxo Laminar *Microscópio Estereoscópico 3.Sala de crescimento climatizada *Ar condicionado *Timer para controle de fotoperíodo 4.Sala de lavagem de vidraria *Autoclave
1. SALA DE PREPARO DE MEIO DE CULTURA
2. SALA DE MANIPULAÇÃO ASSÉPTICA
3. SALA DE CRESCIMENTO CLIMATIZADA *CONTROLE DE LUZ: - Fotoperíodo: 16 horas - Intensidade luminosa: 20 a 50 µmol.m -2.s -1 - Tipos de lâmpadas: -Fluorescentes -LED *CONTROLE DE TEMPERATURA: - Geralmente 25 C - Ar condicionado *EQUIPAMENTOS: -BOD -Agitadores NOVAS ALTERNATIVAS: Uso da luz natural Sistemas autotróficos -Aumento do CO 2 -Aumento da Intensidade luminosa -Redução da sacarose
4. SALA DE LAVAGEM DE VIDRARIA
AMBIENTE PARA TRANSFERÊNCIA EX VITRO
CASA-DE-VEGETAÇÃO PARA ACLIMATIZAÇÃO