MICROESTAQUIA SERIADA IN VITRO DE ERVA-MATE 1

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1 MICROESTAQUIA SERIADA IN VITRO DE ERVA-MATE 1 COMIRAN, Mariane 2 ; QUADROS, Kenia Michele de 3 ;BISOGNIN, Dilson Antônio 4 ; FISCHER, Hardi 5 ;RAUBER, Marcelo 6 ;PIMENTEL, Nathália 7 1 Trabalho de Pesquisa _UFSM 2 Graduando em Agronomia, Universidade Federal de Santa Maria UFSM, Santa Maria, Brasil. 3 Engenheira Florestal, Doutoranda em Engenharia Florestal, Universidade Federal de Santa Maria - UFSM, Santa Maria, Brasil. 4 Engenheiro Agrônomo, Ph.D., Professor Titular do Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Santa Maria - UFSM, Santa Maria, Brasil 5 Graduando em Agronomia, Universidade Federal de Santa Maria UFSM, Santa Maria, Brasil 6 Graduando em Engenharia Florestal, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, Brasil 7 Graduando em Engenharia Florestal, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, Brasil marianecomiran@hotmail.com, nab.nane@hotmail.com RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da microestaquia seriada in vitro nas microcepas e microestacas formadas nos diferentes subcultivos. Utilizaram-se três genótipos selecionados de erva-mate, cujas plântulas in vitro foram oriundas de embriões zigóticos excisados de sementes. Foram estabelecidos quatro subcultivos, com enraizamento in vitro, onde foi avaliada a porcentagem de enraizamento, de formação de calo e de sobrevivência do material propagado em cada subcultivo. Os genótipos estudados apresentaram grande capacidade propagativa visando a formação de plântulas in vitro, apresentando porcentagens de enraizamento semelhantes semelhante para os três genótipos e subcultivos estudados, demonstrando a juvenilidade das plântulas estudadas. Houve diferenças entre genótipos e subcultivos para a porcentagem de formação de calos e o genótipo 3 apresentou maior sobrevivência, obtendo-se ao final dos quatro subcultivos um grande número de plantas enraizadas em pequena área. Palavras-chave: Cultura de tecidos; jardim clonal, cultura de embriões. 1. INTRODUÇÃO A erva-mate (Ilex paraguariensis Saint Hilaire) é uma espécie nativa do sul do Brasil e se caracteriza por ser uma importante fonte de renda em vários países da América do Sul, como no Paraguai, Argentina e Brasil (SANSBERRO et al., 2000). Segundo Wendling (2004), a exploração de erva-mate baseia-se essencialmente no extrativismo de ervais nativos ou plantas cultivadas provenientes de sementes, ocasionando plantios de alta 1

2 heterogeneidade e dificultando o manejo da cultura e o seu processamento. Além disto, a propagação sexuada da cultura possui algumas limitações, como a baixa qualidade genética e fisiológica das sementes, baixo poder germinativo (STURION, 1988) além de dormência por imaturidade embrionária e tegumentar (HU, 1975). A propagação vegetativa ou clonagem é uma excelente alternativa na busca de avanços para a produção de mudas (GRAÇA et al., 1990), pois desta maneira, é possível multiplicar apenas genótipos selecionados, possibilitando maior ganho genético quando comparada a reprodução via semente. A clonagem, que consiste em multiplicar assexuadamente partes das plantas (células, tecidos, órgãos ou propágulos) de modo a gerar indivíduos geneticamente idênticos à planta-matriz da qual foi destacada (FERRARI et al., 2004), encontra sua base na capacidade que certas estruturas vegetativas possuem de formar um individuo completo (WENDLING et al., 2005). Muitos são os métodos utilizados na propagação vegetativa, dentre estes se destacam a micropropagação ou cultura de tecido in vitro. A micropropagação apresenta-se como uma técnica que possibilita a obtenção de grande número de plantas a partir de poucas matrizes, em um curto espaço de tempo e em reduzida área de laboratório (PAIVA e GOMES, 1995). A microestaquia é uma técnica na qual são utilizados propágulos rejuvenescidos na micropropagação para serem posteriormente enraizados in vitro ou ex vitro, visando à obtenção de mudas (QUADROS et al., 2011) e na microestaquia seriada, os explantes passam por sucessivos subcultivos em meio de cultura adequado, tendo seu ápice ou segmentos nodais retirados para a confecção de microestacas e seu produto uma microcepa. Estudos indicam que as características relacionadas à juvenilidade dos tecidos podem ser modificadas por meio da micropropagação seriada in vitro (GONÇALVES, 1982; HACKETT, 1987; BONGA e VON ADERKAS, 1992; HACKETT e MURRAY, 1993). O rejuvenescimento pode ser considerado uma forma de reverter às plantas do estado maduro para o juvenil (HACKETT e MURRAY, 1993), influenciando, principalmente no enraizamento dos propágulos propagados e na qualidade e velocidade de formação do sistema radicular (ASSIS, 1997). Neste sentido, a técnica da micropropagação pode ser eficiente no rejuvenescimento de propágulos maduros (FRANCLET et al., 1987), e no máximo aproveitamento dos tecidos vegetais visando a formação de mudas de qualidade por meio de enraizamento de microestacas. Para que se possa realizar a micropropagação clonal massal selecionam-se genótipos superiores, sendo essa superioridade genética dos indivíduos fenotipicamente selecionados comprovadas através de sua multiplicação. 2

3 Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da microestaquia seriada in vitro nas microcepas e microestacas formadas nos diferentes subcultivos, utilizando três genótipos selecionados em quatro subcultivos de erva-mate. 2. METODOLOGIA Os experimentos foram conduzidos no Núcleo de Melhoramento e Propagação Vegetativa de Plantas, no laboratório de cultura de tecidos do Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de Santa Maria, RS. Para o estabelecimento in vitro, embriões excisados de sementes foram inoculados individualmente em frascos contendo 3 ml de meio de cultura (HORBACH et al., 2011). Foi utilizado o meio ¼ de MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), com 3% de sacarose, 0,01% de mio-inositol, 0,65% de ágar e 0,01 mg L -1 de BAP (benzilaminopurina), com ph ajustado para 5,7 (SANSBERRO et al., 1998) com auxílio de Hidróxido de Sódio (NaOH) e Ácido Cloridrico (HCl). As plântulas emergidas foram transferidas para frascos de 150 ml contendo 20 ml de meio de cultura ¼ de MS. Essas plântulas tiveram seus ápices podados, formando microcepas que permaneceram in vitro para o crescimento de brotações. Em câmara de fluxo laminar, as brotações foram coletadas e as microestacas foram confeccionadas (QUADROS et al., 2011) e introduzidas em meio de cultura ¼ de MS (MURASHIGE E SKOOG, 1962), com 30 g.l -1 de sacarose e 7 g.l -1 de ágar acrescidos de mg L -1 de AIB diluído em solução alcoólica na proporção de 50%. Para este experimento, utilizaram-se três genótipos selecionados. Após enraizamento das microestacas, estas tiveram seus ápices podados para formação de microestacas do próximo subcultivo e assim sucessivamente até o quarto subcultivo. A cada subcultivo duas microestacas eram estabelecidas por genótipo. Todas as microestacas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2 ºC, fotoperíodo de 16 h, sob intensidade luminosa de 14,3 µe m -2 S -1 fornecidas por lâmpadas fluorescentes. A avaliação foi realizada 30 dias após instalação de cada subcultivo e foram contabilizadas as porcentagens de enraizamento, formação de calo e sobrevivência de microestacas e microcepas. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado e as médias foram comparadas por teste de Tukey, com 5% de probabilidade de erro, com o auxílio do programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 7.5 para Windows (SPSS Inc. Chicago II). 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 3

4 Após avaliação dos quatro subcultivos, pode-se inferir que a porcentagem de enraizamento foi alta (total de 73% entre os subcultivos e genótipos) não apresentou diferença entre os genótipos estudados e entre os subcultivos realizados (Figura 1). No entanto, a porcentagem de formação de calo apresentou diferença entre genótipos e entre subcultivos. Os subcultivos 2 e 3 apresentaram maior formação de calo e, entre os genótipos estudados, o clone 1 apresentou a menor porcentagem de formação de calo. Microestacas (%) Bb Enraizamento e formação de calo (%) Ab Ab Bb enraizamento genótipo 1 formação de calo genótipo 1 enraizamento genótipo 2 formação de calo genótipo 2 enraizamento genótipo 3 formação de calo genótipo Subcultivos Figura 1 Enraizamento e formação de calo por clones e subcultivos em microestacas e microcepas cultivadas in vitro. No subcultivo 2, a porcentagem de enraizamento entre todos os genótipos diminuiu, e a porcentagem de calo aumentou e, no subcultivo 4 ocorreu o inverso, pois a porcentagem de enraizamento aumentou e a porcentagem de formação de calo diminuiu. A alta porcentagem de enraizamento, semelhante entre os subcultivos e entre os genótipos, demonstra que o tecido se encontrava altamente rejuvenescido, e que os genótipos possuíam alta capacidade propagativa, evidenciando a correta seleção de genótipos. Segundo Franclet et al. (1987) a técnica de micropropagação é eficiente no rejuvenescimento de propágulos maduros, sendo isso observado para Eucalyptus spp., 4

5 onde o potencial de enraizamento dos propágulos de árvores maduras aumenta com os sucessivos cultivos in vitro. Para finalidade de micropropagação clonal a formação de calos é indesejável uma vez que a constituição cromossômica deste material é, em geral, instável, podendo originar variantes genéticos, por meio de um processo chamado variação somaclonal (LARKING e SCOWCROFT, 1981). Além disso, a presença de calos pode afetar o enraizamento, pois o enraizamento das microestacas é altamente dependente do rejuvenescimento, e onde ocorre formação de calo (proliferação de células não diferenciadas) ele é inibido temporariamente ou permanentemente. Desta maneira, pode-se observar que nos subcultivos dois e três ocorreu maior capacidade de formação de calos e menor enraizamento. A sobrevivência foi superior no clone 3 (dados não apresentados), seguido do clone 1 e do clone 2. Entre os subcultivos, a ordem de sobrevivência dos subcultivos foi: 2>3>1>4. Neste estudo, a porcentagem média de enraizamento foi alta, sendo que o número total de microestacas, ao final dos quatro subcultivos foi de 217 plantas. Estes valores demonstram que os genótipos selecionados para este estudo possuem alta capacidade de propagação, além de que a microestaquia seriada manteve os tecidos rejuvenescidos. 5. CONCLUSÃO Os genótipos utilizados apresentaram grande capacidade propagativa, visando à formação de mudas por meio do enraizamento, obtendo-se ao final do estudo um grande número de plântulas. A semelhança de enraizamento entre genótipos e entre subcultivos demonstram que os tecidos são juvenis, e que os genótipos forma adequados para a finalidade deste estudo. REFERÊNCIAS ASSIS, T. F. Propagação vegetativa de Eucalyptus por microestaquia. In: IUFRO CONFERENCE ON SILVICULTURE AND IMPROVEMENT OF EUCALYPTS, 1997, Salvador. Proceedings... Colombo, PR: EMBRAPA, v. 1, p FERRARI. M. P. et al. Propagação vegetativa de espécies florestais. Colombo: Embrapa Florestas - CNPF, p. (Documentos, n.94). 5

6 FRANCLET, A.; BOULAY, M.; BEKKAOUI, F.; FOURET, Y.; VERSCHOOREMARTOUZET, B.; WALKER, N. Rejuvenation. In: BONGA, J. M.; DURZAN, D. J. (Eds.). Cell and tissue culture in forestry. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, v.1, p GONÇALVES, A. N. Reversão à juvenilidade e clonagem de Eucalyptus urophylla. S. T. in vitro. Piracicaba, SP: ESALQ, f. Tese (Doutorado em Agronomia) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba. GRAÇA, M. E. C. et al. Produção de mudas de erva-mate por estaquia. Curitiba: Embrapa Florestas EMATER, p. HACKETT, W. P. Juvenility and maturity. In: BONGA, J. M.; DURZAN, D. J. (Eds.). Cell and tissue culture in forestry. Dordrecht: Keuwer Academic Publishers, 1987b. v.1, p HACKETT, W. P.; MURRAY, J. R. Maturation and rejuvenation in woody species. In: AHUJA, M. R. Micropropagation of woody plants. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, p HORBACH, M. A. et al. Micropropagação de plântulas de erva-mate obtidas de embriões zigóticos. Ciência Rural, Santa Maria, v.41, n.1, p , HU, C. Y. In vitro culture of rudimentary embrios of eleven Ilex species. J. Amer. Soc. Hort. Sci. v. 100, n. 3, p , LARKIN, P. J.; SCOWCROFT, W. R. Somaclonal variation: a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theoretical and Applied Genetics, Berlin, v. 60, p , 1981 MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, v. 15, p , PAIVA, H. N.; GOMES, J. M. Propagação vegetativa de espécies florestais. Viçosa: UFV, MG, p. (Boletim, 332). QUADROS, K. M. et al. Aclimatização e enraizamento ex vitro de microestacas juvenis de erva-mate. In: 5 CONGRESSO SUDAMERICANO DE LA YERBA MATE, 2011, Argentina. Anais...Posadas, Instituto Nacional de la Yerba Mate; Universidad Nacional de Missiones, 2011, p SANSBERRO, P. A. et al. In vitro culture of rudimentary embryos of Ilex paraguariensis: responses to exogenous cytokinins. J. Plant Growth Regul., v.17, p ,

7 SANSBERRO, P. A. et al. Plant regeneration of Ilex paraguariensis (Aquifoliaceae) by in vitro culture of nodal segments. Biocell. v. 24, n. 1, p STURION, J. A. Produção de mudas e implantação de povoamentos com erva-mate. Curitiba, EMBRAPA-CNPF, p (Circular Técnica, 17). VON ADERKAS, P.; BONGA, J. M. Influencing micropropagation and somatic embryogenesis in mature trees by manipulation of phase change, stress and culture environment. Tree Physiology, n. 20, p , WENDLING, I. Propagação vegetativa de erva-mate (Ilex paraguariensis Saint Hilaire): estado da arte e tendências futuras. Colombo: Embrapa Florestas, 46 p (Embrapa Florestas. Documentos, 91). WENDLING, I. et al. Técnicas de produção de mudas de plantas ornamentais. Viçosa, MG: Aprenda Fácil, v. 3, 223 p