CULTURA DE TECIDOS: HISTÓRICO, CONCEITOS, APLICAÇÕES, ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO E MEIOS DE CULTURA AF060 BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Transcrição

1 CULTURA DE TECIDOS: HISTÓRICO, CONCEITOS, APLICAÇÕES, ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO E MEIOS DE CULTURA AF060 BIOTECNOLOGIA VEGETAL Prof. Dr. Luiz Antonio Biasi

2 CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS 1.HISTÓRICO 2.CONCEITOS 3.APLICAÇÕES 4.ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO 5.MEIOS DE CULTURA

3 1.HISTÓRICO -Haberlandt (1902) - 1º cultivo de células em solução nutritiva. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien., Math. Naturwiss. K., Abt. (1):111, Experiments on the culture of isolated plant cells. The Botanical Review, Berlin, 35(1):68-88, (Tradução para inglês). Gottlieb Haberlandt -Hannig (1904) - 1º cultivo de embriões imaturos -Knudson (1922) - 1º cultivo de embriões de orquídeas -White (1934) - Cultivo de ápices radiculares de tomate em meio líquido -Kogh et al. (1934) - Descoberta do AIA

4 -Skoog e Tsui (1948) - Formação de partes aéreas e raízes em calos de fumo Folke Skoog -Morel e Martin (1952) - Obtenção de dália livre de vírus. Morel, G. and Martin, C. Guerison de dahlias atteints d une maladie a virus. Comptes Rendus de l Académie des Sciences, 235: , Miller et al. (1955) - Descoberta da cinetina -Skoog e Miller (1957) - Experimento clássico com calo de fumo Balanço auxina/citocinina Carlos Miller Skoog, F. and Miller, C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro. Symposia of the Society for Experimental Biology, 11,

5 -Steward et al. (1958) e Reinert (1959) - Obtenção de embriões somáticos em calos de cenoura -Morel (1960) - Obtenção de orquídeas livre de vírus -Cocking (1960) - Obtenção de protoplastos -Murashige e Skoog (1962) - Meio de cultura MS -Takebe et al. (1971) - Obtenção de plantas a partir de protoplastos -Murashige et al. (1972) - Microenxertia em Citrus Toshio Murashige -Carlson et al. (1973) - Primeira hibridação somática em fumo. -Larkin e Scowcroft (1981) Variação somaclonal Biologia molecular Transformação genética de plantas

6 2.CONCEITOS DESENVOLVIMENTO Alterações que ocorrem no organismo ao longo do seu ciclo de vida nos níveis morfológico, fisiológico e bioquímico. Ex: evolução da fase embrionária para planta. Ex: mudança da fase vegetativa para reprodutiva. CRESCIMENTO Mudanças quantitativas irreversíveis. Ex: aumento de biomassa. Ex: aumento de comprimento. DIFERENCIAÇÃO Mudanças qualitativas. Processo pelo qual as células adquirem propriedades metabólicas, estruturais e funcionais distintas daquelas iniciais. DIFERENCIAÇÃO OCORRE PELA REGULAÇÃO NA ESPRESSÃO GÊNICA

7 MORFOGÊNESE Origem da forma da planta e sua organização que pode ser estudada nos níveis: *Estrutural (organização funcional da célula) *Tecidos *Órgãos *Planta inteira Mudanças quantitativas ENVOLVE CRESCIMENTO E DIFERENCIAÇÃO Mudanças qualitativas INTEGRAÇÃO ENTRE OS PROCESSOS DE DIVISÃO E ESPECIALIZAÇÃO CELULAR A morfogênese é o resultado de um complexo controle hormonal múltiplo, espacial e temporal, por meio da regulação e expressão gênica.

8 TOTIPOTÊNCIA HABERLANDT (1902) Toda célula vegetal íntegra possui capacidade para reproduzir um organismo inteiro. Rudolf Virchow (1858) TEORIA CELULAR As células são as unidades funcionais de todos os seres viventes Toda a célula nasce de outra célula Schleiden (1838) & Schwann (1839) As plantas são agregados de seres individuais e independentes, denominados de células Células dão origem aos tecidos (Ideias ainda incompletas)

9 DETERMINAÇÃO Processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma célula torna-se limitado a uma rota específica de morfogênese. COMPETÊNCIA Capacidade das células reagiram a sinais específicos de desenvolvimento. EPIGÊNESE Ativação seletiva e diferencial de genes, envolvendo células receptivas ou tecidos responsivos.

10 MORFOGÊNESE IN VITRO: *Organogênese Direta Indireta *Embriogênese somática Direta Indireta Explante Indireta Calo Direta Novos órgãos (organogênese) Novos embriões (embriões)

11 ORGANOGÊNESE INDIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE ABACATEIRO

12 ORGANOGÊNESE INDIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS CAULINARES DE MARACUJAZEIRO

13 ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS RADICULARES DE CAQUIZEIRO Segmento radicular

14 ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE CAQUIZEIRO Segmentos foliares

15 EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM TANGERINEIRA PONKAN

16

17 3.APLICAÇÕES Produção de mudas em larga escala Micropropagação (organogênese e embriogênese) Produção de material de propagação sadio (livre de virus) Cultura de meristemas + Termoterapia Microenxertia Crioterapia (técnica nova) Resgate de embriões de cruzamentos difíceis Cultivo de embriões zigóticos Conservação de germoplasma Conservação in vitro Criopreservação Obtenção de duplo haploides Cultura de anteras + duplicação cromossômica Obtenção de híbridos somáticos Fusão de protoplastos

18 Produção de material de propagação sadio (livre de virus)

19 Cultura de meristema Microenxertia

20 Produção de mudas em larga escala

21 Embriogênese e produção de sementes sintéticas CARTES R, P. et al. Encapsulated Somatic Embryos and Zygotic Embryos for Obtaining Artificial Seeds of Rauli-Beech (Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst.). Chilean J. Agric. Res., v.69, n.1, p , 2009.

22 Resgate de embriões de cruzamentos difíceis Resgate de embriões de videira Resgate de embriões de arroz Ohnishi et al. (Plant and Cell Physiology 52(7): ).

23 Resgate de embriões de mandioca Buttibwa et al. African Journal of Biotechnology. 14(27):

24 Conservação de germoplasma Rayssa Natasha Barros Mafra & Victor Spies Embrapa Clima Temperado

25 Conservação in vitro

26 Obtenção de duplo haploides Produção de duplo-haplóide de alho Fayos et al. Frontiers in Plant Science. 6:

27 Obtenção de híbridos somáticos Cultura e fusão de protoplastos Fig. 1 Plant regeneration from protoplast fusion experiment of a grass cultivar with a wild species.

28 Fig. 2 Tubers of different somatic hybrids in comparison to the fusion partners (cultivar: upper lines, wild species: lower lines, hybrids: in-between).

29 4.ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO ESTRUTURA BÁSICA DE UM LABORATÓRIO DE CULTURA DE TECIDOS 1.Sala de preparo de meio de cultura 2.Sala para manipulações assépticas 3.Sala de crescimento climatizada 4.Sala de lavagem de vidraria 5.Escritório 6.Banheiro AMBIENTES ADICIONAIS 1.Antecâmara 2.Almoxarifado 3.Sala de microscopia 4.Sala de biologia molecular ESTRUTURAS EXTERNAS 1.Ambiente para transferência ex vitro 2.Casa-de-vegetação 3.Telados 4.Depósitos

30 EQUIPAMENTOS BÁSICOS 1.Sala de preparo de meio de cultura *Balança *phmetro *Agitador magnético *Microondas *Destilador ou Deionizador *Refrigerador *Freezer 2.Sala para manipulações assépticas *Câmara de Fluxo Laminar *Microscópio Estereoscópico 3.Sala de crescimento climatizada *Ar condicionado *Timer para controle de fotoperíodo 4.Sala de lavagem de vidraria *Autoclave

31 1. SALA DE PREPARO DE MEIO DE CULTURA

32

33

34

35

36 2. SALA DE MANIPULAÇÃO ASSÉPTICA

37

38

39

40

41 3. SALA DE CRESCIMENTO CLIMATIZADA *CONTROLE DE LUZ: - Fotoperíodo: 16 horas - Intensidade luminosa: 20 a 50 µmol.m -2.s -1 - Tipos de lâmpadas: -Fluorescentes -LED *CONTROLE DE TEMPERATURA: - Geralmente 25 C - Ar condicionado *EQUIPAMENTOS: -BOD -Agitadores NOVAS ALTERNATIVAS: Uso da luz natural Sistemas autotróficos -Aumento do CO2 -Aumento da Intensidade luminosa -Redução da sacarose

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52 4. SALA DE LAVAGEM DE VIDRARIA

53

54 AMBIENTE PARA TRANSFERÊNCIA EX VITRO

55

56

57 CASA-DE-VEGETAÇÃO PARA ACLIMATIZAÇÃO

58

59

60

61

62

63 5.MEIOS DE CULTURA COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA: 1. SAIS MINERAIS: -Macronutrientes: -Nitrogênio: -Amônio -Nitrato *Concentração de amônio deve ser no máximo até 1/3 do N total. -Fósforo: H 2 PO 4 - -Potássio: íon livre -Cálcio: deficiência causa necrose apical -Magnésio: -Enxofre: -Micronutrientes: -Ferro: absorvido na forma de quelato com EDTA -Manganês: -Zinco: -Boro: -Cobre: -Molibdênio -Cobalto e Iodo:????

64 2. SUBSTÂNCIAS ORGÂNICAS: -Vitaminas: tiamina (B1), ácido nicotínico (niacina), piridoxina (B6) -Aminoácidos: glicina -Mio-inositol -Adenina 3. CARBOIDRATOS: -Sacarose (mais utilizado) -Outros carboidratros: sorbitol; dextrose (glicose); maltose; galactose. 4. AGENTES SOLIDIFICANTES -Agar: polissacarídeo de algas marinhas (6 a 7%) -Gomas: polímeros produzidos por bactérias (2 a 3%) *Gelrite - Kelco Division of Merck & Co *Phyta-gel - Sigma Chemical Co 5. ÁGUA -Destilada; deionizada -Sistema Milli-Q : filtros de carvão ativado, colunas de troca iônica e filtros de acetato de celulose.

65 6. REGULADORES VEGETAIS -Auxinas -Citocininas -Giberelinas *Ácido indolacético (AIA) *Ácido indolbutírico (AIB) *Ácido naftalenoacético (ANA) *2,4-D *Picloran *Cinetina *Benziladenina (BAP) *Zeatina *2iP *Ácido giberélico (GA 3 )

66 REGULADORES VEGETAIS AUXINAS: Divisão celular Alongamento celular Diferenciação celular Auxinas naturais Auxinas artificiais

67 CITOCININAS: Divisão celular Diferenciação celular Citocininas naturais Citocininas artificiais

68

69 GIBERELINAS: Alongamento celular Divisão celular

70 OUTROS REGULADORES: Brassinosteróides: -Mais de 60 conhecidos -Alongamento de caules; crescimento do tubo polínico; desenrolamento de folhas de gramíneas Poliaminas: -Encontradas em plantas e animais -Tipos: putrescinas;espermidinas; esperminas -Divisão e alongamento celular; enraizamento; formação de tubérculos Ácido jasmônico: -Formação de tubérculos; amadurecimento de frutos; formação de pigmentos; sinalizador de estresse Ácido salicílico: -Estimula a floração; floração em plantas termogênicas; mecanismo de defesa.

71 Composição de 1 litro do meio de cultura MS em gramas. Proporção entre os componentes do meio de cultura em g / litro ,63 0,103 0,01 959,25 Água Ágar Substâncias orgânicas Sacarose Sais Reguladores de crescimento

72 Composição de alguns meios de cultura. Componentes MS NN WPM QL Macronutrientes mg L -1 μm mg L -1 μm mg L -1 μm mg L -1 μm NH 4 NO , , , ,00 KNO , , ,36 K 2 SO , KH 2 PO , , , ,96 Ca(NO 3 ) 2.4H 2 O , ,80 CaCl 2.2H 2 O , , CaCl , MgSO 4.7H 2 O , , , ,45 Micronutrientes Fe 2 SO 4.7H 2 O 27,80 100,00 27,80 100,00 27,80 100,00 27,80 100,00 Na 2 EDTA 37,30 100,20 37,30 100,20 37,30 100,20 37,30 100,20 H 3 BO 3 6,20 100,26 10,00 161,71 6,20 100,26 6,20 100,26 MnSO 4.H 2 O ,90 111, MnSO 4.4H 2 O 22,30 99, ,30 99,97 1,00 4,48 ZnSO 4.7H 2 O 8,60 29,91 10,00 34,77 8,60 29,91 8,60 29,91 KI 0,83 5, ,08 0,4 8 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0,25 1,03 0,25 1,03 0,25 1,03 0,25 1,03 CoCl 2.6H 2 O 0,025 0, ,025 0,10 CuSO 4.5H 2 O 0,025 0,10 0,025 0,10 0,25 1,00 0,025 0,10 MS Murashige & Skoog (1962) NN Nitsch & Nitsch (1969) WPM Lloyd & McCown (1986) QL Quoirin & Lepoivre (1977)