INSTITUTO FEDERAL CATARINENSE CÂMPUS ARAQUARI CURSO DE BACHARELADO EM MEDICINA VETERINÁRIA

CÂMPUS ARAQUARI CURSO DE BACHARELADO EM MEDICINA VETERINÁRIA INQUÉRITO EPIDEMIOLÓGICO DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NO MUNICÍPIO DE JOINVILLE, SANTA CATARINA, BRASIL HIAGO DE OLIVEIRA CARLOS Relatório Final apresentado ao Instituto Federal Catarinense, em cumprimento a exigência do Edital N º 168/2014 PIBITI/PIBIC/PIBICAf/CNPq/IFCatarinense Orientadora: Profª Deolinda M. V. F. Carneiro Araquari Julho/2015

RESUMO A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença parasitária que apresenta ampla distribuição mundial e alto potencial zoonótico, constituindo assim uma enfermidade de grande impacto em saúde pública, causada pelo protozoário do gênero Leishmania. No ano de 2010 houve o primeiro diagnóstico de casos autóctones de Leishmaniose Visceral Canina (LVC) no Estado de Santa Catarina. Este estudo realizou em Joinville, no mês de maio de 2015, um levantamento sorológico para diagnóstico da LVC através da técnica de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), utilizando-se amostras de sangue colhidas sob responsabilidade da Vigilância Ambiental da cidade de 150 cães domiciliados próximos ao local onde ocorreu um caso alóctone da doença no ano de 2014. Das 150 amostras analisadas, 4% (6/150) foram soro reagentes, apresentando título sorológico igual ou maior que 1:40 na RIFI. Nenhum dos animais positivos apresentava sinais dermatológicos e/ou sistêmicos compatíveis com LVC. Logo, sugere-se que devem ser realizados novos estudos soro epidemiológicos, assim como a distribuição vetorial, que promovam maior conhecimento da infecção canina por Leishmania sp., e permitam o direcionamento de ações profiláticas e de controle dos focos de transmissão. PALAVRAS-CHAVE: Leishmaniose visceral canina, zoonose, epidemiologia.

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a Vigilância Ambiental de Joinville, em especial ao médico veterinário Jaime de Matos, pela doação das amostras biológicas para realização das a- nálises. Ao professor Dr. Mário Steindel responsável pelo Laboratório de Protozoologia da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) por disponibilizar o espaço e pessoal para a realização das análises sorológicas. Ao CNPq pela concessão da bolsa.

INTRODUÇÃO As leishmanioses são doenças causadas por protozoários tripanosomatídeos do gênero Leishmania, consideradas primariamente como zoonoses. Constituem-se importantes problemas de saúde pública, encontrando-se atualmente entre as doenças tropicais prioritárias da Organização Mundial de Saúde (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Estima-se uma incidência de 200 a 400 mil casos de LV em todo o mundo a cada ano (WHO, 2014). A LV caracteriza-se por ser uma doença infecto-parasitária de ampla diversidade epidemiológica, devido à variabilidade de possíveis espécies de hospedeiros, de vetores e de ambientes onde podem se estabelecer. Os hospedeiros vertebrados incluem grande variedade de mamíferos, entre eles, o homem, e são identificados como hospedeiros invertebrados e vetores exclusivamente fêmeas da Família Psychodidae, Subfamília Phlebotominae, popularmente conhecidos como flebotomíneos (WHO, 2010). O cão é o principal reservatório doméstico de Leishmania spp., por apresentar intenso parasitismo cutâneo, contato estreito com humanos e atrair a presença do vetor (MACHADO, 2004). De acordo com a recomendação do Ministério da Saúde (2006) os laboratórios credenciados deveriam utilizar o Teste Imunoenzimático (ELISA) como triagem diagnóstica em inquéritos caninos e a RIFI como técnica de confirmação. Os animais soropositivos, sintomáticos ou não, deveriam ser eutanasiados. A RIFI apresenta de 90 a 100% de sensibilidade e de 80 a 100% de especificidade, além de ser de fácil execução, fornecer diagnóstico rápido e a custo reduzido (IKEDA-GARCIA & FEITOSA, 2006). A LVC era considerada exótica em Santa Catarina até 2010. Os dois primeiros casos autóctones da enfermidade foram diagnosticados no Estado em 2010, em uma clínica veterinária particular, em animais oriundos do Canto dos Araçás, Florianópolis (FIGUEIREDO et al., 2012). O controle da doença deve ser feito de maneira estratégica, mediante a identificação e estratificação das áreas de risco pelos inquéritos sorológicos caninos e entomológicos, investigação epidemiológica dos casos humanos e condições ambientais adversas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Diante desse quadro o presente estudo objetivou caracterizar a condição epidemiológica da leishmaniose visceral canina (LVC) no município de Joinville, Santa Catarina, Brasil, no ano de 2015.

MATERIAIS E MÉTODOS Colheitas de material biológico A colheita de sangue total foi feita sob responsabilidade da Vigilância Ambiental de Joinville entre os dias 6 e 9 de abril de 2015 em 150 cães domiciliados em área próxima ao local onde ocorreu um caso autóctone de LVC no município no ano de 2014. Segundo o Ministério da Saúde (2014), na suspeita clínica de um cão com LVC deve-se delimitar uma área para investigação do foco, onde define-se como área para investigação aquela que, a partir do primeiro caso canino (suspeito ou confirmado), estiver circunscrita em um raio de no mínimo 100 cães a serem examinados. Foram coletados aproximadamente 3mL de sangue de cada cão por meio de venopunção cefálica ou jugular e armazenadas em caixa térmica com gelo reciclável para posterior processamento em laboratório. Processamento das amostras As amostras foram processadas no Laboratório de Microbiologia do Instituto Federal Catarinense Câmpus Araquari (IFC-Araquari), sendo centrifugadas a 3.000 rpm por 5 minutos. O soro obtido foi então transferido para eppendorfs estéreis em duplicata, identificados e armazenados sobre congelamento a uma temperatura de -18ºC. Análise sorológica Para o diagnóstico da LVC foi utilizado a reação sorológica de Imunofluorescência Indireta (RIFI). As reações foram realizadas entre os dias 4 a 6 de maio no Laboratório de Protozoologia da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Foram utilizadas microplacas para a diluição dos soros, pipetando-se 190 μl de PBS 0,01M, ph 7,2, e 10 μl do soro a ser testado no primeiro orifício, homogeneizandose, perfazendo a diluição 1:20. Foram distribuídos 100 μl de PBS 0,01 M, ph 7,2 em outras quatro cavidades a partir da primeira diluição. Realizou-se a transferência de 100 μl da primeira diluição ao orifício seguinte, homogeneizando-se. Este procedimento foi reproduzido até a quarta cavidade, desprezando-se 100 microlitros da mesma. Com isso, foram obtidas as diluições de 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320. O processo de diluição foi realizado da mesma forma utilizando-se um soro sabidamente positivo e um soro sabidamente negativo, até ser obtida a diluição 1:40 destes, que foram utilizados como controle. Em lâminas impregnadas com o antígeno de L. infantum, foram distribuídos 10 μl de cada diluição nos orifícios, incubando-se a 37ºC por 30 minutos em câmara úmida. A seguir, foram lavadas em PBS ph 7,2, por 5 minutos, por duas vezes consecutivas e, a seguir, secas em estufa. O conjugado espécie-específico foi diluído, segundo seu título pré estabelecido, em solução de Azul de Evans a 20 mg%, a qual foi previamente diluída em PBS 0,01M, ph 7,2 na proporção de 1:5. Foram distribuídos 10 μl de conjugado para cada diluição, incubando-se novamente a 37ºC por 30 minutos em câmara úmida. Procedeu-se nova lavagem em PBS 0,01M, ph 7,2, por 5 minutos, duas vezes consecutivas, secando-se em estufa a 37 ºC. As lâminas foram montadas com glicerina

tamponada ph 8,5, cobrindo-se com lamínula, e foram avaliadas em microscópio de imunofluorescência. Após a leitura dos controles, procedeu-se o exame das amostras em teste. As amostras consideradas soro reagentes foram as que apresentaram título sorológico 1:40. RESULTADOS E DISCUSSÕES Neste estudo, em um total de 150 amostras analisadas, 4% (6/150) foram soro reagentes, apresentando título sorológico 1:40 na RIFI, conforme mostra a tabela 1. Trabalhos anteriores demonstraram que as prevalências de LVC são bastante elevadas no Brasil, atingindo taxas de 1-36% em diferentes regiões do país (SILVA et al., 2001). Em um estudo realizado por Almeida et al. (2010) dos 150 cães com suspeita clínica da infecção, 38% foram sorológicos ou parasitologicamente positivos. A prevalência de LVC foi estimada em 10,6% no município de Juatuba, Minas Gerais, considerada como uma área de transmissão esporádica, de acordo com a classificação do Ministério da Saúde (BORGES et al., 2014). Já Barbosa et al. (2010) realizou em seu trabalho uma análise sorológica em 100 cães procedentes de região endêmica, e 67% das amostras apresentaram-se positivas para Leishmania spp. Tabela 1 Resultados da sorologia das amostras submetidas a RIFI. Amostra 1:40 1:80 3 + 7 + 9 + 15 + 69 + + 129 + + Um recente estudo relatou o primeiro surto autóctone de LVC em Florianópolis-SC. Durante levantamento soro epidemiológico realizado pelo Centro de Controle de Doenças Zoonóticas (CCZ) envolvendo 2.124 cães, 29 (1,37%) foram soro positivos para LV (ELISA + RIFI). A confirmação da infecção por Leishmania sp. foi realizada pelo exame parasitológico da medula óssea, fígado, baço e linfonodos, cultura em meio Schneider e PCR. Os isolados de Leishmania sp. foram caracterizados por PCR-RFLP e hibridação com sondas específicas, permitindo a identificação de Leishmania infantum (STEINDEL et

al., 2013). Logo se ressalta a importância da associação de métodos diagnósticos mais específicos, como o parasitológico, para a detecção do agente etiológico. Estudos relatam não haver predisposição etária, sexual ou racial quanto à infecção por Leishmania sp. em cães (GONTIJO & MELO, 2004). Apesar da maior ocorrência de fêmeas infectadas, todos os cães soro reagentes eram sem raça definida (SRD). A faixa etária mais frequentemente relatada foi em cães adultos, como verificado por Gállego (2004), que afirma que a enfermidade é mais descrita em cães adultos devido ao longo período de incubação do parasito, que, em média, é de dois meses, além do maior tempo de exposição ao vetor. Entretanto, França-Silva et al. (2003) observaram que os cães, independente da idade, têm a mesma probabilidade de contrair a leishmaniose, não excluindo a importância das outras faixas etárias na epidemiologia da doença canina. Nenhum dos animais positivos apresentava sinais dermatológicos e/ou sistêmicos compatíveis com LVC. No Brasil, a forma assintomática da doença geralmente representa 40 a 60% de uma população soro positiva (FARRELL, 2002). Todos os casos estão sendo caracterizados como autóctones e por se tratarem de resultados preliminares, demais exames sorológicos e parasitológicos serão realizados para uma investigação mais acurada. Os conhecimentos gerados sobre a situação da doença nesta região, através do descobrimento da presença de animais infectados fornecem subsídios auxiliares ao mapeamento da atual condição epidemiológica da leishmaniose no Estado. A possibilidade da melhor compreensão das características epidemiológicas na região permite o direcionamento de ações profiláticas e de controle dos focos de transmissão ativa. A realização de inquéritos sorológicos em cães, como neste trabalho, pode ser considerada de grande importância. A identificação dos casos serve de ferramenta para direcionar e priorizar ações específicas para cada localidade (BRASIL, 2006; ARAÚJO, 2011) além de auxiliar na detecção de focos silenciosos da doença. É de extrema importância que vigilâncias entomológicas e epidemiológicas sejam implementadas em áreas indenes, proporcionando subsídios para detectar a presença do vetor e/ou a enzootia canina antes da instalação do ciclo antropozoonótico. É de suma importância que se defina qual a real extensão do problema e quais os fatores de risco para a população humana e canina.

REFERÊNCIAS ALMEIDA, A.B.P.F. et al. Prevalência e epidemiologia da leishmaniose visceral em cães e humanos, na cidade de Cuiabá, Mato Grosso, Brasil. Ciência Rural, v.40, n.7, p.1610-1615, 2010. ARAÚJO, V.E.M. Análise da distribuição espaço-temporal da leishmaniose visceral e perfi l clínico-epidemiológico dos casos e óbitos, Belo Horizonte, Minas Gerais, 1994 a 2009. 2011. 208f. Tese (Doutorado em Ciências) - Curso de Pós-graduação Parasitologia, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, MG. BARBOSA, D.S. et al. Soroprevalência e variáveis epidemiológicas associadas à leishmaniose visceral canina em área endêmica no município de São Luís, Maranhão, Brasil. Ciência Animal Brasileira, v. 11, n. 3, p. 653-659, 2010. BORGES, L.F.N.M. et al. Prevalência e distribuição espacial da leishmaniose visceral em cães do município de Juatuba, Minas Gerais, Brasil. Ciência Rural, v.44, n.2, p.352-357, 2014. FARRELL, J.P. Leishmania. World class Parasites: v.4. London: Kluwer Academic Publishers, 2002. p.45-57. FIGUEIREDO, F.B. et. al. Leishmaniose Visceral Canina: Dois casos autóctones no município de Florianópolis, Estado de Santa Catarina. Acta Scientiae Veterinariae, 40(1): 1026. 2012. FRANÇA-SILVA, J.C. et al. Epidemiology of canine visceral leishmaniosis in the endemic area of Montes Claros Municipality, Minas Gerais State, Brazil. Veterinary Parasitology, v.111, p.161-173, 2003. GÁLLEGO, M. Zoonosis emergentes por patógenos parasitos: las leishmaniosis. Review Scientific and Technical Office International des Epizooties, v.23, n.2, p.661-676, 2004. GONTIJO, C.M.F.; MELO, M.N. Leishmaniose visceral no Brasil: quadro atual, desafios e perspectivas. Revista Brasileira de Epidemiologia. v.7, p.338-349, 2004. IKEDA-GARCIA, F.A.; FEITOSA, M.M. Métodos de diagnóstico da leishmaniose visceral canina. Clínica Veterinária. n.62, p.32-38, 2006. MACHADO, J. G. Comparação do diagnóstico sorológico da Leishmaniose Visceral Canina entre laboratórios de Belo Horizonte, 2003-2004. 2004. 45 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Secretaria de Vigilância em Saúde - Brasil. Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral. Brasília, 2006. 126p

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Secretaria de Vigilância em Saúde - Brasil. Guia de Vigilância em Saúde. Brasília, 2014. 812p SILVA, E.S. et al. Short report: detection of Leishmania DNA by polymerase chain reaction on blood samples from dogs with visceral leishmaniasis. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v.65, n.6, p.896-898, 2001. STEINDEL, M. et. al. Outbreak of autochthonous canine visceral leishmaniasis in Santa Catarina, Brazil. Pesquisa Veterinária Brasileira. v.33, n.4, p.490-496, 2013. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Leishmaniasis. Acessado em 10 abr. 2014. Online. Disponível em: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs375/en/ WORLD HEALTH ORGANIZATION. Control of the leishmaniases. Report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases. Genebra: World Health Organization. 2010.

AVALIAÇÃO GERAL DO PROJETO 1. DESCREVA OS PRINCIPAIS OBSTÁCULOS E DIFICULDADES ENCONTRADOS NA PESQUISA No momento da inscrição do presente projeto, o Instituto Federal Catarinense - Câmpus Araquari possuía uma parceria firmada com o Centro de Bem Estar Animal (CEBEA) de São Francisco do Sul, regulamentada através do convênio IFC Proex nº. 36/2013. A parceria garantiria a execução do projeto através do fornecimento de material biológico de cães que apresentassem lesões que cursassem com o quadro da leishmaniose visceral, para análises laboratoriais. Contudo, devido a questões políticas, e a troca dos responsáveis pelo Centro, a parceria foi inviabilizada no quarto trimestre de 2014. Diante desta nova situação se iniciou a busca de soluções para este problema, o que gerou algumas alterações no projeto, inclusive a alteração da cidade para a realização do mesmo. A nova alternativa adotada foi à realização de uma parceria com a Vigilância Ambiental de Joinville. Sendo assim, a coleta dos materiais biológicos para análise ocorreu sob responsabilidade do órgão anteriormente citado. Outro obstáculo enfrentado foi em relação a não aquisição dos testes rápidos que serviriam como triagem nos testes laboratoriais. Um laboratório privado iria doar 50 destes testes rápidos Dual Path Platform (DPP ) e os outros 100 seriam adquiridos a preços mais baixos com recursos próprios. Porém o laboratório em questão não realizou a doação. Além disso, o Ministério da Saúde (MS) reduziu o fornecimento e a distribuição dos testes rápidos em todos os órgãos de saúde do Estado (inclusive aos Centros de Controle de Zoonoses), o que impossibilitou totalmente a aquisição dos testes. Sendo assim a metodologia do projeto teve que ser mudada, e a análise sorológica realizada escolhida foi a Imunofluorescência Indireta (RIFI). 2. PREENCHA OS CAMPOS ABAIXO SE A PESQUISA ENVOLVE OS ITENS RELACIONADOS: 2.1. Material químico ou genético: Discrimine a quantidade utilizada e a forma de descarte do material no término da pesquisa 2.2 Meio ambiente: Descreva se durante o trabalho houve algum tipo de agressão ou violação do equilíbrio ecológico ambiental 3. DESCREVA SE HOUVE CONTRIBUIÇÕES DA PESQUISA PARA: 3.1. O desenvolvimento científico e tecnológico Os dados gerados por este estudo mostram-se extremamente importantes, ao passo que permitem a elaboração de um mapeamento a nível regional, sendo fundamental para o desenvolvimento de métodos de controle e diagnóstico da doença. Este levantamento ainda instigará a novos estudos, contribuindo para o aumento da eficácia das medidas que serão adotadas para a prevenção e controle do agente bem

como para informar a população e conscientizá-los da proporção da doença, embasados em dados estatísticos atuais. Ainda ressalta-se a importância que este estudo trouxe ao IFC Araquari no contexto de geração de dados e na veiculação destes, notadamente em Saúde Pública. 3.2. Capacitação de recursos humanos e sua fixação na área do projeto 3.3. Transferência de conhecimentos ou geração de novos produtos, tecnologias ou patentes 4. PARECER DO ORIENTADOR Relato das atividades desenvolvidas pelo aluno e seu rendimento acadêmico. Acadêmico responsável e comprometido. Desempenhou as atividades com excelência. Entre os dias 6 a 9 de abril de 2015 acompanhou as atividades de coleta de sangue, sob responsabilidade da Vigilância Ambiental de Joinville SC. Realizou o processamento das amostras no Laboratório de Microbiologia do Instituto Federal Catarinense Câmpus Araquari (IFC-Araquari). Acompanhou a realização das análises sorológicas (Imunofluorescência Indireta RIFI) entre os dias 4 a 6 de maio de 2015 no Laboratório de Protozoologia da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) em Florianópolis SC. Utilizou o presente projeto para apresentação nas disciplinas de TCC I e TCC II no segundo semestre de 2014 e primeiro semestre de 2015 respectivamente. As disciplinas faziam parte da grade curricular do bolsista. Realizava revisão bibliográfica mensalmente.