ESFERAS DE QUITOSANA/GOMA DE CAJUEIRO DOPADAS COM ÓLEO ESSENCIAL DE LIPPIA SIDOIDES: EMBEBIÇÃO E CINÉTICA DE LIBERAÇÃO Haroldo C. B. Paula 1*, Fernanda Matoso Sombra 1, Rafaela de Freitas Cavalcante 1, Flávia O. M. S. Abreu 1, Regina C. M. de Paula 2 1* Departamento de Analítica e Físico-Química, Universidade Federal do Ceará - UFC, Fortaleza-CE hpaula@ufc.br 2 Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará - UFC, Fortaleza-CE Esferas à base de quitosana (QT) com goma de cajueiro (GC) foram preparadas e dopadas com óleo essencial de atividade larvicida (Lippia sidoides-ls), com o objetivo de avaliar a eficiência do sistema no controle da Aedes aegytpi. As esferas foram caracterizadas quanto ao seu tamanho, massa, forma, grau de dopagem de larvicida, embebição e cinética de liberação in vitro e in vivo. Os perfis de embebição (Q) revelaram que as esferas de QT apresentaram valores de Q na faixa de 4 a 6,7 e atingiram o equilíbrio em cerca de 30 min. Já as esferas de QT/GC apresentaram menores valores de Q, com uma variação de 0,4 a 3,8. A taxa de mortalidade de larvas de Aedes aegypti foi proporcional a quantidade de esferas adicionadas, as quais apresentaram um perfil larvicida prolongado, com 100% de mortalidade após 72h. As esferas de QT/GC apresentaram menor índice de mortalidade do que as esferas de QT, provavelmente devido à menor dopagem de larvicida. Esses resultados apontam que o sistema de liberação QT/GC dopado com LS mostrou-se eficiente para o controle das larvas do mosquito Aedes aegypti. Palavras-chave: Biomateriais, Esferas, Quitosana, Sistema de liberação controlada, Aedes aegypti. Chitosan/Cashew Gum beads loaded with Lippia Sidoides essential oil: Swelling and release kinetics Beads based on Chitosan (QT) and cashew gum (GC) were prepared and loaded with an essential oil with larvicide activity (Lippia sidoides -LS), aiming to evaluate the efficiency on the Aedes aegypti control. QT and QT/CG beads were characterized with respect to their size, shape, larvicide loading, swelling and in vitro and in vivo release kinetics. QT beads showed swelling degree (Q) values from 4 to 6.7, reaching equilibrium after 30 min, whereas QT/CG beads showed lower swelling values, from 0.4 to 3.8. In vivo release showed that the mortality degree was related to the mass of the beads, and both QT and QT/GC presented a prolonged larvicide effect, with 100% of mortality after 72h. QT/GC showed a lower mortality effect than QT beads probably due to the lower LS loading. These results showed that QT/GC loaded with LS are efficient in the larval control of Aedes aegypti. Keywords: Biomaterials, beads, chitosan, drug delivery, Aedes aegypti. Introdução A Dengue é uma doença que é transmitida pelo mosquito Aedes aegypti e atualmente, se faz presente em um grande número de municípios brasileiros, com cerca de 400 mil casos documentados em 2008. No Estado do Ceará foram registrados 2850 casos em 83 municípios no primeiro trimestre de 2009 [1], sendo necessária a promoção de ações duradouras e contínuas para o controle do vetor com mínimo impacto sobre o meio ambiente. Temefós e alguns piretróides são inseticidas que têm sido usados no controle do mosquito adulto e de suas larvas, entretanto, o vetor da dengue tem exibido resistência ao principio ativo convencional [2]. Desta forma, é necessário o desenvolvimento de novas formulações que possam ser usadas de forma alternativa. As formulações de pesticidas são projetadas para que ocorra o máximo de eficácia do principio ativo com segurança na administração do mesmo, de forma a proteger o usuário e o ambiente. Desta
forma, vários autores têm-se dedicado a pesquisas de hidrogéis poliméricos para uso como veículos para pesticidas [3-5], reportando o encapsulamento de substâncias como metil paration, triflurani, clopirofos, tiocarbamatos e bacillus Thuringiencies [6]. Polímeros naturais têm sido preferencialmente empregados em substituição aos polímeros sintéticos, devido a não-toxidade, baixo custo, biodisponibilidade e biodegradabilidade [7]. A quitosana é um conhecido polissacarídeo composto de unidades glucosaminas e acetil-glucosaminas unidas por ligações β-d- (1,4) [8]. A goma de cajueiro (GC) é um polissacarídeo oriundo da Anacardium Occidentale (árvore do Cajueiro), sendo constituída de galactose (72%), D-glicose (14%), arabinose (4,6%), rhamnose (3,2%) e ácido glucurônico (4,7%) [9]. Hidrogéis poliméricos em microesferas podem ser usados para a liberação prolongada de várias substâncias empregadas na área farmacêutica, médica e na agricultura [10-19]. Microesferas de QT reticuladas com polifosfato [10] e não reticuladas [11] foram usadas para a adsorção de corantes reativos oriundos de efluentes de indústrias têxteis [12], na remoção de íons de alumínio, ferro e cobre de efluentes de minas de carvão [10,11] e de íons Cu (II) e Ni (II) [13]. Complexos coacervados de gelatina e quitosana foram empregados para encapsular beta-caroteno [14], tendo sido caracterizados por microscopia eletrônica (MEV), espectroscopia de infravermelho e análise térmica. Microesferas de quitosana com diâmetro médio de 2 mm foram empregadas como carreadores de uma substância com atividade antitumoral, a beta lapachona [15]. Apesar do uso extensivo de esferas na produção de sistemas de liberação controlada de substâncias nas áreas farmacêutica, cosmética e química, poucas publicações reportaram o uso de tais sistemas como veículos de pesticidas [3-5, 16-18]. Lippia sidoides (LS) é uma planta presente no Nordeste brasileiro, conhecida popularmente como alecrim pimenta, sendo encontrada principalmente nos Estados do Ceará e Rio Grande do Norte. Esta espécie produz um óleo essencial rico em timol e de potente ação antimicrobiana contra fungos e bactérias. Estudos recentes apontaram que o timol pode apresentar promissora atividade larvicida contra as larvas do A. aegypti [19,20]. Em trabalho anterior, diclorovinila dimetilfosfato (DDVP) foi usado como molécula modelo de pesticida dosado em esferas de quitosana com goma do cajueiro (QT/GC) [18]. Neste trabalho é reportada a preparação e caracterização de esferas de QT/GC contendo LS, onde os perfis de liberação in vitro e in vivo do larvicida foram investigados de forma a avaliar a potencialidade do sistema para uso como uma nova ferramenta no controle da dengue. Experimental Materiais Foram utilizados os polímeros quitosana (75% de grau de desacetilação, MW =1,8 x10 5 g/mol), fornecido pela Polymar e goma de cajueiro (1,1 x10 5 g/mol), obtida de árvores nativas do Ceará,
purificada conforme descrito em trabalho anterior [21], glicerina (Synth), Lippia Sidoides (Produtos Naturais LTDA Pronat Horizonte, CE), Tween 80 (Vetec) e Glutaraldeído (Sigma), todos usados sem qualquer tipo de preparação prévia. Produção das esferas de QT/GC Adicionou-se a uma solução de quitosana 4% em ácido acético os componentes glicerina, óleo essencial e emulsificante Tween 80. Adicionou-se entre 0,1 a 4% de LS na matriz polimérica. Essa mistura foi colocada em um emulsificador por 15 minutos para formação de uma emulsão estável. Posteriormente, gotejou-se a emulsão em NaOH a 5% e deixou-se em repouso por 5 minutos. As esferas então formadas foram lavadas com água deionizada, e imersas em uma solução aquosa 10 % de goma do cajueiro (GC) por 30 minutos. As esferas foram posteriormente reticuladas em uma solução aquosa 5% de glutaraldeido, lavadas com água e secas em dessecador. Caracterização das esferas As esferas foram analisadas por espectroscopia de infravermelho (FTIR) em equipamento SHIMADZU 8300 em pastilhas de KBr. A morfologia das esferas foi observada em um microscópio eletrônico de varredura Philips modelo XL-30 Holland, usando uma aceleração de tensão de 20 KV. Embebição Avaliou-se a embebição (Q) das esferas através da variação da massa das esferas secas (M o ) e depois de imersas em água em função do tempo (M t ). A embebição foi determinada usando a Equação 1: Q = (M t -M o ) (1) M o Determinação do teor de LS nas esferas. O teor de óleo essencial nas esferas foi determinado através de maceração de cerca de 5 mg de esferas em etanol, seguida por análise em espectrofotômetro de absorção UV-Visível, no comprimento de onda de 260 nm. A concentração e o teor foram calculados através da curva de calibração. As análises foram feitas em triplicata. Estudos cinéticos da liberação in vitro A cinética in vitro do larvicida liberado das esferas foi monitorada através de espectroscopia de ultravioleta (UV). Para isto, pesou-se cerca de 6-10 mg de esferas e colocou-se em 20 ml de água deionizada. Com o decorrer do tempo, alíquotas de 0,5 ml foram retiradas e analisadas em espectrofotômetro de UV. As medidas foram feitas em triplicata. Testes in vivo Os testes in vivo foram realizados para observar a eficácia da liberação controlada de LS. As esferas dopadas com diferentes teores de LS foram colocadas em béqueres com 50 ml, no qual foi
colocada uma população de vinte larvas de St. aegypti no Estágio Três. A população de larvas vivas foi determinada após 24h, 48h e 72h de exposição. Cada teste foi feito em duplicata, usando um controle sem larvicida. Resultados e Discussão Caracterização das esferas As esferas QT/GC dopadas com óleo essencial e não-dopadas foram caracterizadas pelos seus principais grupamentos funcionais por espectroscopia de infravermelho (FTIR), conforme ilustrado na Figura I. As microesferas de QT/GC não-dopadas apresentam os modos de vibração de seus grupos componentes, evidenciados pela vibração da estrutura sacarídica em 1084 cm -1, do grupo amino e amida da QT, respectivamente em 1597 cm -1 e 1655 cm -1 e do grupo C-N em 1372 cm -1 [22,23]. As esferas reticuladas de QT/GC dopadas com óleo essencial apresentaram alterações visíveis nos modos de vibração com a adição do agente de reticulação, onde se observa uma diminuição significativa nas intensidades dos sinais entre 1000 e 2000 cm -1. A vibração de alguns grupos funcionais como os grupos C-H alcoólicos (1072 cm -1 ) os grupos amida I, (1658 cm -1 ), amino (N-H) e hidroxila (O-H) (3400 cm -1 ) foram deslocados para menores valores de absorbância conforme discutido em trabalho anterior [18]. A Absorbância B 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 4 0 0 0 n ú m e r o d e o n d a ( c m - 1 ) Figura I - Espectro de infravermelho das esferas de QT/GC não dopada (A) e dopada (B). As esferas de QT/GC dopadas com óleo essencial foram avaliadas quanto a sua morfologia por microscopia eletrônica de varredura, conforme pode ser visto na Figura II. A morfologia da esfera de QT/GC dopada com LS apresentou partículas com alta regularidade esférica com uma superfície altamente porosa. De acordo com estudo anterior, as esferas de QT/GC não-dopadas apresentam
uma superfície lisa e regular [18], sendo atribuído o aumento da porosidade da esfera à presença de óleo no seu interior. O tamanho médio das partículas de QT e QT/GC são respectivamente, 1,27±0,2 e 1,53±0,3 mm, e a massa média das partículas é de 2,8±0,4 e 3,9±0,5 mg para QT e QT/GC, respectivamente. Figura II micrografia de esferas de QT/GC dopadas com óleo essencial A embebição das esferas pode ser observada na Figura III. As esferas de QT apresentaram um perfil de embebição com valores de Q na faixa de 4 a 6,7, atingindo o equilíbrio após cerca de 30 min. Já as esferas QT/GC reticuladas apresentaram valores de Q variando de 0,4 a 3,8. O maior controle na embebição das esferas de QT/GC se deve ao fato de terem sido reticuladas com glutaraldeído, o que confere estabilidade ao sistema e menor capacidade de expansão da rede polimérica. O grau de embebição de um sistema particulado pode ser usado para avaliar o os parâmetros de transporte líquido, como o coeficiente de difusão D V de um soluto em uma matriz polimérica, de acordo com as Equações 2 e 3 [16,18], cujos valores constam na Tabela I: Mt/M =(36Dt/ пr 2 ) 1/2 (3Dt/ r 2 ) (2) D V = (rө/ 6) 2 п (3) Onde M t é a massa de água embebida no tempo t, M a massa embebida no equilíbrio, D V é o coeficiente de difusão, r o raio da microesferas, Ө o coeficiente angular obtido a partir de M t / M versus t ½.
8 6 Q 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120 Tempo (min.) Figura III Cinética de inchamento das esferas de QT e de QT/GC em função do tempo para esferas de QT ( ) e para esferas de QT/GC ( ). Tabela I: Parâmetros do Transporte líquido das esferas de QT e QT /GC reticuladas. Esferas QT QT/GC Raio (10-3 m) 0,637 0,764 Inclinação Ө (10-3 /s) 2,35 0,19 D V (m 2 /s) 1,95 x 10-11 2,013x10-15 Q 6,7± 0,6 3,8± 0,3 Dopagem (%) 4,4 ± 0,36 2,4 ± 0,19 Os valores de Dv para as esferas de QT estão de acordo com o reportado em outros trabalhos, [17,24], e são inferiores para as esferas de QT/GC, provavelmente devido à adição da GC e pela adição do agente de reticulação, o que causou uma menor capacidade de expansão da rede e diminuiu a taxa de transporte líquido. Estes resultados estão de acordo com o reportado por Soppirnath [18], no qual ocorreu uma diminuição do transporte líquido com o aumento do grau de reticulação em esferas a base de poliacrilamida e goma guar, devido ao aumento de rigidez da rede com a reticulação de suas cadeias. Cinética da liberação de LS Os teores reais de LS contidos nas esferas e no meio de liberação, foram determinados através da construção de uma curva de calibração contendo o óleo essencial, dada pela Equação 4: Abs= 0,06064 +0,00347 conc. R 2 =0,9897 (4) A liberação de princípios ativos contidos em matrizes poliméricas é governada pela Equação 5, conforme descrito em trabalhos anteriores [17,18]:
Mt/M = Kt n (5) Nesta equação M t /M denota a fração de larvicida (óleo) liberada, t é o tempo de liberação e k representa uma constante característica do sistema. O coeficiente difusional (n) é um indicativo do mecanismo de liberação e assumem valores dependentes da geometria apresentada pelo sistema de liberação. A difusão de Fick tipo I é aplicada quando o sistema apresenta um padrão de liberação difusional, enquanto que a difusão tipo II é caracterizada por uma constante de relaxação. Um sistema de difusão não fickiano envolve os mecanismos de relaxação e difusionais combinados. O valor do expoente n da difusão assume um valor de 0,43 para amostras esféricas, enquanto assume valores entre 0,43 e 0,85 para transporte fickiano anômalo. Um valor de n igual a 0,85 é característico de transporte tipo II. A partir da Equação 5, usando o modelo de Higuchi, pode-se observar a cinética de liberação de LS a partir das esferas de QT e QT/GC. A Figura IV mostra o logaritmo da fração de larvicida liberada (M t /M ) em função do tempo para as esferas de QT e de QT/CG. Observa-se que as esferas de QT/GC reticuladas apresentaram um perfil de liberação mais prolongado e mais eficaz do que as esferas de QT. 0.0-0.5 Ln (M t /M 00 ) -1.0-1.5-2.0-2.5-3.0 0 10 20 30 40 50 60 Tempo 1/2 (min.) Figura IV - Perfil cinético de liberação in vitro de LS das esferas de QT ( ) e de QT/GC reticuladas ( ) de acordo com o modelo de Higuchi. A Tabela II mostra os valores de n e K obtidos, bem como o coeficiente de correlação da cinética de liberação de óleo essencial para as esferas de QT e QT/CG. O valor do expoente n para as esferas
foi 0,91 e 1,47, característicos de difusão não-fickiana (transporte tipo II). De forma análoga, outros autores também observaram valores de expoente n acima de 0,8 para esferas de alginato [4], tais como para microesferas de poliacrilamida-g-goma guar [17]. Tabela II: Parâmetros obtidos da cinética de liberação in vitro de óleo essencial pelas esferas de QT e QT /GC reticuladas. Esferas K n R 2 QT 0,0268 1,47 0,9998 QT/GC 0,0324 0,91 0,9997 Testes in vivo (bioensaios) com esferas de QT e QT-GC: As esferas de QT e QT/GC dopadas com LS foram avaliadas quanto à cinética de mortalidade contra larvas do mosquito A. aegypti, conforme ilustrado na Figura V. Para ambos os tipos de esferas, quanto maior a massa das esferas, maior o grau de mortalidade. O teste com 36 PPM de LS livre levou a 100% de mortalidade das larvas em 24h. Verificou-se um efeito prolongado de liberação do larvicida nas esferas de QT e de QT/GC, com 100% de mortalidade após 72 h de ensaio. As esferas de QT/GC apresentaram índices de mortalidades inferiores ao das esferas de QT em até 24h, o que pode ser atribuído a menor dopagem do sistema. No entanto, após 48h, independentemente da dopagem de cada sistema, tanto as esferas de QT quanto as de QT/GC apresentaram índice de mortalidade máximo superior a 75%. Pode-se concluir que esferas contendo LS nas concentrações de 7 a 16 PPM podem gerar um bom controle larval por mais de 3 dias. Conclusões As metodologias desenvolvidas permitiram o encapsulamento de LS nas esferas de QT/GC, com teores de dopagem na faixa de 2,4 a 4,4%, apresentando liberação prolongada com eficiência comprovada pelos bioensaios realizados. A caracterização físico-química permitiu observar o comportamento das esferas em relação a sua estrutura e embebição em meio aquoso. O sistema QT/GC apresentou menor grau de embebição e um perfil de liberação in vitro mais prolongado do que as esferas de QT, provavelmente devido à reticulação das cadeias poliméricas, o que restringe a capacidade de expansão da rede e, portanto, a mobilidade de transporte líquido. Os testes in vivo mostraram que os sistemas particulados dopados apresentaram valores de mortalidade acima de 80 ±8 %, após 48 h. Estes testes apresentaram desvios médios na faixa de 5 a 10 %. Estudos posteriores permitirão avaliar a eficácia dos sistemas estudados com um maior percentual de dopagem.
(a) Mortalidade (%) 100 80 60 40 20 20 30 40 50 60 70 80 Tempo (h) (b) Mortalidade (%) 100 80 60 40 20 0 20 30 40 50 60 70 80 Tempo (h) Figura V- Cinética da mortalidade das larvas com esferas de a) QT e de b) QT/GC, carregadas com 9 ( ), 13 ( ) e 18 mg ( )de óleo essencial. Agradecimentos Ao CNPQ pela bolsa PIBIC-UFC e ao CNPQ e BNB pelo auxílio financeiro. Referências Bibliográficas 1. Boletim de Secretaria da Saúde do Estado do Ceará, 11/05/2009. 2. Lima, J. B. P.; da Cunha, M. P.; da Silva, R. C.; Galardo, A. K. R.; Soares, S. D.; Braga, I. A.; Ramos, R. P.; Valle, D. Am J Tropical Med Hygiene 2003, 68, 329. 3. Aminabhavi, T. M.; Kulkarni, A. R.; Soppimath, K. S.; Balundgi, R. H.; Mehta, M. H.; Dave, A. M. Polymer News 1998, 23, 246. 4. Kulkarni, A. R.; Soppimath, K. S.; Aminabhavi, T. M.; Mehta, M. H.; Dave, A. M. J Appl Polym Sci 1999, 73, 2437. 5. Inoue, M.; Ontsubo, T.; Imai, M Proc Int Symp Controlled Rel Bioact Mater 1997, 24, 733. 6. Chamberlain, P.; Symes, K. C. Encapsulation and Controlled Release; Karsa, D. R.; Stepherson, R. A., Eds.; RSC: London, 1993; p 131. 7. Peppas, N. A. Int J Pharm 2004, 277, 11. 8. Berger, J.; Reist, M. ; Mayer, J. M.; Felt, O.; Peppas N. A.; Gurny, R. Eur J Pharm Biopharm 2004, 57, 35. 9. Paula, R. C. M.; Heatley, F.; Budd, P. M. Polym Int 1998, 45, 54.
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