PRODUÇÃO DE XILANASE POR LINHAGENS FÚNGICAS TERMOFÍLICAS ISOLADAS EM ÁREA DE CERRADO MENEZES, C. L. A. 1 ; SENNA, S. N. 2 ; ALVES- PRADO, H. F. 3 1 Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho, Câmpus de Ilha Solteira-SP, Graduação em Licenciatura/Bacharelado em Ciências Biológicas, Bolsista IC, CNPq, Processo 101668/2013-9 2 Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho, Câmpus de São José do Rio Preto-SP, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, bolsista Capes. 3 Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho, Câmpus de Ilha Solteira-SP, Depto. de Fitotecnia, Tecnologia de Alimentos e Sócio Economia. E-mail: cintialionela@yahoo.com.br Introdução As enzimas são os catalisadores do metabolismo e, como tal, são o foco de intensa investigação em nível mundial na comunidade biológica. A segunda metade do século XX presenciou expansão de conhecimento sem precedentes sobre a utilização de microrganismos e os seus produtos metabólicos, as enzimas, em diversas áreas da pesquisa (BEG et al., 2001). Dentre os micro-organismos com potencial para aplicações biotecnológicas são os fungos que vêm despertando interesse, devido à grande diversidade de enzimas que secretam no ambiente, sendo responsáveis pela deterioração de matéria orgânica de forma geral. Esses micro-organismos desempenham um importante papel na natureza por sua capacidade de ciclagem de nutrientes, decompondo resíduos lignocelulósicos (BENNET, 1998). Dentro desse contexto, estão as xilanases, enzimas que podem ser produzidas por uma variedade de microorganismos, mas, no entanto, são os fungos filamentosos que se destacam como principais produtores (HALTRICH et al., 1996; PHAN et al., 1998). As enzimas hemicelulolíticas apresentam potencial de aplicação industrial em vários setores como alimentício na panificação, na formulação de ração animal e na produção de xilitol; ainda nos setores farmacêutico, químico, de papel e celulose e mais recentemente na produção de etanol a partir de resíduos hemicelulolíticos. A CMCase (EC 3.2.1.4) é classificada como endoglucanase. Durante o processo fermentativo, as endoglucanases hidrolisam preferencialmente as ligações internas no polímero da celulose, produzindo oligossacarídeos de menor peso molecular. As endoglucanases clivam as ligações ß-(1-4)- glicosídicas em regiões amorfas da celulose ou na superfície das microfibrilas. (SANTOS et al., 2011). Tendo em vista esses fatores, o presente trabalho apresenta resultados de isolamento de micro-organismos produtores de hemicelulases e a produção das enzimas sob fermentação em estado sólido.
Material e Métodos Isolamento de micro-organismo Foi realizado isolamento de fungos filamentosos em uma área de Cerrado, localizada em propriedade particular, Fazenda São José, no município de Inocência-MS. Aproximadamente 1,0 g de amostra de solo, madeira em decomposição, materiais de compostagem, entre outros foram coletados em áreas de Cerrado do Mato Grosso do Sul e transferidos diretamente para frascos contendo 4 ml de meio nutriente composto por; 0,2% peptona; 0,14% (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0,20% K 2 HPO 4 ; 0,02% MgSO 4.7H 2 O; 0,03% uréia; 1,60 mg L -1 MnSO 4.H 2 O; 1,40 mg L -1 ZnSO 4.7H 2 O; 2,0 mg L -1 CoCl 2 ; 5 mg L -1 FeSO 4.7H 2 O, 2 tiras de palha de milho (3,0 cm x 0,5 cm) (Alves-Prado et al., 2010). Após incubação 45ºC por 24 horas, o material líquido foi transferido por esgotamento em estria, com o auxílio de uma alça de inoculação, para placas de Petri contendo o meio correspondente, com 1,0% de palha milho triturada, acrescido de 1,5% agar.. As culturas puras foram estocadas no mesmo meio contendo 0,5% de xilana e foram mantidas a 7ºC, para os testes de produção. Produção de xilanase O processo fermentativo se deu em frascos Erlenmeyrs de 250mL com 5g de substratos umedecidos com 10mL de solução salina. A composição da solução salina foi de 0,14% (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0,20% K 2 HPO 4 ; 0,02% MgSO 4.7H 2 O e 0,03% uréia para ph 5,0. Após a inoculação do micro-organismo, a fermentação ocorreu a uma temperatura de 45 C. Ao final de cada fermentação, a solução enzimática bruta foi extraída pela adição de 50 ml de água.o material foi filtrado e centrifugado a 10.000g por 10 min. obtendo uma solução livre de células, a qual foi utilizada para as análises enzimáticas. Determinação de atividade enzimática Foram determinadas as atividades xilanase (E.C. 3.2.1.8) de acordo com Damiano et al., (2003), utilizando xilana Birchwood-Sigma a 1,0%, como substrato reacional. Uma unidade de atividade xilanase será definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol de xilose por minuto, nas condições de reação, utilizando curva padrão de xilose. A atividade Carboximetilcelulase - CMCase (E.C. 3.2.1.4) seguiu protocolo semelhante à xilanase utilizando carboximetilcelulose Sigma a 4,0%, como substrato reacional. Uma unidade de atividade será definida como a quantidade capaz de liberar 1 µmol de glicose por minuto, nas condições de reação, usando curva padrão de glicose. Resultados
Foram analisadas cerca de 30 linhagens, quando ao potencial de produção de xilanase. Para a produção de xilanase, as linhagens foram cultivadas sob fermentação em estado sólido utilizando farelo de trigo como substrato (Tabela 1). As linhagens que apresentaram as melhores atividades enzimáticas foram IP-4 A2, IP-2 B1, IP-8 A1 e IP-16 A1. Assim, tais linhagens foram selecionadas para o cultivo em diferentes fontes de carbono. Foram utilizados os substratos isoladamente ou em mistura com farelo de trigo na proporção 1:1. Ambas as linhagens selecionadas apresentaram boa atividade xilanase em serragem. A atividade CMCase foi maior também em substrato serragem para a linhagem IP-2B1 (Figura 1). Tabela 1. Atividades xilanase e CMCase das linhagens fúngicas, isoladas de área de Cerrado, cultivadas sob fermentação em estado sólido, após 96 horas. Linhagens Xilanase (U ml -1 ) Linhagens Xilanase (U ml -1 ) IP-1 B1 4,80 IP-8 A1 11,90 IP-2 B1 15,90 IP-9 A1 1,27 IP-4 A1 1,50 IP-10 B1 2,20 IP-4 A2 19,00 IP-12 A11 4,20 IP-5A1 1,5 IP-12 A12 2,03 IP-6 B1 10,80 IP-15 A3 3,30 IP-6 B2 3,40 IP-15 B2 7,30 IP-7 B1 9,80 IP-16 A1 11,30 Figura 1. Atividade (a) xilanase) e (a) das linhagens fúngicas IP-4 A2, IP-2 B2 e IP-8 A1, cultivadas sob fermentação em estado sólido, em diferentes substratos, após 96 horas. a) b) Atividade Xilanase (U ml -1 ) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 BC S SM FT FT+BC FT+S Substratos IP-4 A2 IP-2 B1 IP-8 A1 Atividade CMCase (U ml -1 ) 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 BC S SM FT FT+BC FT+S Substratos IP-4 A2 IP-2 B1 IP-8 A1
BC: Bagaço de cana de açúcar; S: serragem; SM: sabugo de milho, FT:Farelo de trigo Discussão e Conclusão Lemos e Junior (2002) estudaram a produção de xilanase por Aspergillus awamori em bagaço de cana e obtiveram atividade enzimática de 100 U ml -1. Reis et al. (2003) observaram atividade xilanase de 220 U ml -1 produzida por Aspergillus nidulans. Kang et al. (2004) e Biswass et al. (2010) estudando Aspergillus niger obtiveram atividades de 5.070 U g -1 substrato e 290 U ml -1, respectivamente. Biswas et al. (2010) também observou a produção de 1350 U ml -1 por Trichoderma reeise cultivado em palha de milho. Níveis de atividade mais próximos aos encontrados em nesse estudo, foram obtidos por Muthezhilan et al. (2007) cultivando Penicillium oxalicum em farelo de trigo 3,89 U ml -1. Camassola e Dillon (2007), obtiveram 10 U g -1 substrato cultivando Penicillium echimulatum em bagaço de cana e farelo de trigo. e Terrasan et al. (2010) cultivando Penicillium janczewskii em farelo de trigo e bagaço de cana obtiveram atividade xilanase de 15,4 U ml -1 e 3,05 U ml -1, respectivamente. A área de Cerrado em estudo favoreceu o isolamento de diferentes linhagens com crescimento á 45 C, permitindo até o momento a seleção de três principais linhagens com potencial para produção de xilanase e CMCase. A linhagem fúngica termofílica IP-2 B1 demonstrou boa atividade xilanase (120,0 U g -1 de substrato) quando cultivado em sob fermentação em estado sólido usando o sabugo de milho e boa atividade CMCase, quando cultivado em serragem (19,0 U g -1 de substrato). Todas as linhagens estudadas, nos diferentes substratos apresentaram potencial de atividade de xilanase, quando cultivadas em serragem. Referências ALVES-PRADO, H. F.; PAVEZZI, F. C.; LEITE, R. S. R.; OLIVEIRA, V. M.; SETTE, L. D.; DaSILVA, R. Screening and production study of microbial xylanase producers from Brazilian Cerrado. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 161, p. 333-346, 2010. BEG, Q. K.; KAPOOR, M.; MAHAJAN, L.; HOONDAL, G. S. (2001) Microbial xylanases and their industrial applications: a review.microbiol Biotechnol., v. 56, p. 326 338. BENNET, J.W. (1998) Mycothecnology: the role of fungi in biotechnology. J. Biotechnol., v.66, p. 101-107. BISWAS, R.; SAHAI, V.; MISHRA, S.; BISARIA, V. S. (2010) Bioprocess strategies for enhanced production of xylanase by Melanocarpus albomyces IITD3A on agro-residual extract. Journal of Bioscience and Bioengineering, CAMASSOLA, M.; DILLON, A. J. P. (2007) Production of cellulases and hemicellulases by Penicillium echimulatum grow on pretreated sugar cane bagasse and wheat bran in solidstate fermentation. J. Applied Microbiol. 103, 2196-2204. DAMIANO, V.B.; BOCCHINI, D.A.; GOMES, E. e DA SILVA, R. (2003) Aplication of crude xylanase from Bacillus licheniformis 77-2 to the bleaching of eukalyptus Kraft polp. Wourld J Microbiol. Biotechnol., v.19, p. 139-144.
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