CURSO DE AGRONOMIA ANTAGONISMO in vitro DE ISOLADOS DE Trichoderma sp. AO FITOPATÓGENO Stromatinia cepivora BERK In vitro ANTAGONISM OF ISOLATES OF Trichoderma sp. TO THE PHYTOPATHOGEN Stromatinia cepivora BERK Como citar esse artigo: Valadares KHA, Maximiano CV, Silva JBT. ANTAGONISMO in vitro DE ISOLADOS DE Trichoderma sp. AO FITOPATÓGENO Stromatinia cepivora BERK. Anais do 14 Simpósio de TCC e 7 Seminário de IC da Faculdade ICESP. 2018(14); 201-206 Kellvin Hansen Alves Valadares Christian Viterbo Maximiano João Batista Tavares da Silva Resumo O alho é uma cultura de grande importância para o agronegócio mundial. No entanto, sua produção tem sido altamente afetada pela ocorrência da doença conhecida como podridão-branca. Essa doença é causada pelo fungo de solo Stromatinia cepivora Berk, que é capaz de produzir microescleródios e, assim, sobreviver por vários anos no solo, dificultando o manejo da doença. O sintoma inicial da podridão-branca no alho é caracterizado pelo amarelecimento foliar. Já no bulbo, o sintoma é representado pela podridão-mole nos tecidos e crescimento micelial cotonoso de coloração branca, seguido de microescleródios negros. Estudos recentes vêm confirmando o potencial de fungos do gênero Trichoderma no controle de fungos fitopatogênicos habitantes do solo, devido aos seus diversos mecanismos de ação, entre os quais, hiperparasitismo e antibiose. Esse trabalho tem por objetivo avaliar o antagonismo de sete isolados de Trichoderma contra S. cepivora (CEN1357). Os isolados de Trichoderma sp. (CEN1465; CEN1471; CEN1467; CEN1466; CEN1468; CEN1470; CEN1469), provenientes de amostras de alho das regiões de Minas Gerais e Santa Catarina, foram avaliados pelos métodos de pareamento de culturas e produção de compostos orgânicos voláteis (COVs). Utilizou-se delineamento inteiramente ao acaso, com três repetições por tratamento, em câmara BOD, à temperatura de 20 C. Após ambos os experimentos verificou-se a inibição do crescimento micelial de S. cepivora. O tratamento CEN1468 foi o que apresentou maior potencial de inibição, no teste de pareamento (71,8% de inibição). Porém, não teve o mesmo desempenho no experimento de COVs. Os tratamentos CEN1465 e CEN1467 foram constantes nos dois experimentos com, respectivamente, 58,4% e 66,0% no teste de pareamento e 62,3% e 52,4% na exposição aos COVs. Dessa forma, os isolados CEN1465 e CEN1467 foram os que mostraram os resultados mais promissores para supressão de S. cepivora CEN1357 in vitro. Palavras-Chave: Controle Biológico; Podridão-branca; Fungos Antagonistas. Abstract Garlic is a culture of great importance for world agribusiness. However, its production has been highly affected by the occurrence of the disease known as white rot. This disease is caused by the soil fungus Stromatinia cepivora Berk, which is able to produce microsclerodes and thus survive for several years in the soil, making it difficult to manage the disease. The initial symptom of white rot in garlic is characterized by leaf yellowing. In the bulb, the symptom is represented by soft rot in the tissues and cotonous mycelial growth of white coloration, followed by black microsclerodes. Recent studies have confirmed the potential of fungi of the genus Trichoderma in the control of phytopathogenic fungi living in the soil, due to its diverse mechanisms of action, among them, hyperparasitism and antibiosis. This work aims to evaluate the antagonism of seven Trichoderma isolates against S. cepivora (CEN1357). The isolates of Trichoderma sp. (CEN1465; CEN1471; CEN1467; CEN1466; CEN1468; CEN1470; CEN1469) from garlic samples from the regions of Minas Gerais and Santa Catarina were evaluated by dual culture and volatile organic compound (COVs) methods. A completely randomized design was used, with three replicates per treatment, in a BOD chamber at a temperature of 20 C. After both experiments the inhibition of the mycelial growth of S. cepivora was verified. The CEN1468 treatment presented the highest inhibition potential in the dual culture test (71.8% inhibition). However, this did not have the same performance in the COVs experiment. The treatments CEN1465 and CEN1467 were constant in the two experiments with, respectively, 58.4% and 66.0% in the dual culture test and 62.3% and 52.4% in the exposure to VOCs. Thus, isolates CEN1465 and CEN1467 showed the most promising results for suppression of S. cepivora CEN1357 in vitro. Keywords: Biological Control; White-rot; Antagonistic Fungi. Contato: kellvinvaladares@gmail.com Introdução O alho é uma olerícola originária da Ásia. É largamente cultivada, graças às suas peculiaridades de aroma e sabor, tornando-se um dos indispensáveis condimentos gastronômicos da culinária brasileira (JUSTINO NETO, 2018). A área de plantio no Brasil em 2016/17, foi cerca de 11.334 hectares e uma produção de 136.000 toneladas. Dessa produção, 80% foi destinado ao consumo e os 20% restantes são direcionados ao plantio e/ou não chegam ao mercado consumidor in natura. Estima-se o aumento em 2017/18, em área plantada e produção, no entanto, o Brasil ainda não consegue suprir seu mercado interno, recorrendo a importação de outros países, por exemplo, da China, Argentina e Espanha. Esses países representam 96,32% das importações do Brasil entre janeiro e agosto de 2017 (ANAPA, 2017). O alho é uma planta herbácea, de propagação vegetativa, pertencente à família Alliaceae, possuindo folhas pontiagudas, alongadas e modificadas para armazenamento de reservas. O seu bulbo é dividido em bulbilhos, sendo cultivado geralmente em baixas temperaturas (PUIATTI et al., 2013). 201
A podridão branca causa sérios danos na cultura do alho, sendo causada pelo fungo filamentoso Stromatinia cepivora. Este fungo pertence a classe Deuteromycota. São conhecidos por suas estruturas de reprodução chamados escleródios, que são originados do micélio. A disseminação é dada por bulbos contaminados, água de chuva, irrigação, implementos agrícolas e fontes de inóculo (KIMATI et al., 1997). O conhecimento sobre os mecanismos de ação do patógeno e os métodos de controle no manejo são essências para evitar danos no campo (DOMINGOS et al., 2015). Os sintomas da podridão-branca são bem característicos, tais como: amarelecimento e dieback das folhas, ocasionando a morte das folhas infectadas; como o patógeno danifica o sistema radicular, as plantas são facilmente arrancadas do solo; já no bulbo, os sintomas são de podridão-mole nos tecidos e crescimento micelial de cor branca no eixo estrutural da planta, avançando para a produção de escleródios negros nos bulbos (DOMINGOS e LOPES, 2014). A proteção de plantas, que compreende o controle de doenças, plantas daninhas e pragas, possui a finalidade de reduzir os danos provocados por esses problemas fitossanitários às culturas agrícolas. Essas medidas de controle de plantas podem ser caracterizadas em práticas genéticas, físicas, químicas, culturais e biológicas (GHINI e BETTIOL, 2000). O controle biológico com espécies do gênero Trichoderma Persoon tem tido sucesso no combate aos fitopatógenos, por serem capazes de proteger as plantas com seus mecanismos de ação, tais como, parasitismo, antibiose, indução à resistência, competição por nutrientes e substratos, além de promoverem o crescimento vegetativo de inúmeras espécies de plantas e combate às doenças de solo (SOUZA PEDRO et al., 2012). O presente trabalho teve como objetivo avaliar o antagonismo de isolados do gênero Trichoderma visando o controle do fitopatógeno Stromatinia cepivora BERK. Materiais e Métodos Este trabalho foi conduzido no Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen), localizado no Prédio de Controle Biológico (PCB I), em Brasília DF, 2018. Obtenção dos isolados Nesse estudo, foram utilizados sete isolados de Trichoderma sp.: CEN1465, da região de Bueno Brandão-MG; CEN1471, de São Gotardo-MG; CEN1467, de Curitibanos-SC; CEN1466, de Capim Branco-MG; CEN1468, de Gouveia-MG; CEN1470, de Gouveia-MG e CEN1469, também da região de Gouveia-MG; além de um isolado apenas do Patógeno Stromatinia cepivora: CEN1357. Todos os isolados utilizados no presente trabalho foram cedidos pela Coleção de microrganismos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, coletados nas regiões de Minas Gerais (MG) e Santa Catarina (SC), em ecossistemas da família Alliaceae. Os dois experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado (DIC) em B.O.D. (Demanda Bioquímica de Oxigênio), com três repetições por tratamento. A padronização experimental do teste de Cultura Pareada (CP) e Compostos Orgânicos Voláteis (COVs) foi dada pelo cultivo do material biológico em Placas de Petri, contendo 20 ml de meio BDA (Batata- Dextrose-Ágar), armazenadas sob refrigeração de câmara B.O.D., à temperatura de 20ºC para os experimentos de CP e COVs. Teste de cultura pareada Utilizou-se discos de 5 mm de diâmetro contendo o meio BDA incluindo o micélio de Stromatinia cepivora (CEN1357) e dos antagonistas de Trichoderma sp. (CEN1465, CEN1471, CEN1467, CEN1466, CEN1468, CEN1470 e CEN1469), foram retirados das bordas periféricas ao final de cinco dias para o antagonista e oito dias para o patógeno, depositados em posições opostas. Foram incubados em B.O.D., à temperatura de 20ºC. As avaliações foram feitas com o auxílio de um paquímetro, ao oitavo dia e, utilizando-se da fórmula para calcular o percentual de inibição do crescimento micelial: I= ((C T) /C) x 100, onde: I = Taxa de inibição (%); C = Diâmetro das colônias na placa controle (Testemunha); T = Diâmetro das colônias na placa tratada com os discos pareados (LOUZADA et al., 2016; BELL et al., 1982). Compostos orgânicos voláteis A Stromatinia cepivora (CEN1357) foi exposta aos COVs de Trichoderma sp. (CEN1465, CEN1471, CEN1467, CEN1466, CEN1468, CEN1470 e CEN1469). Duas placas de Petri (9,0 x 1,5 cm), com 20 ml de meio BDA, contendo em uma delas um disco de ágar (5 mm de diâmetro) do patógeno; na outra, outro disco de ágar (5 mm de diâmetro) com seu antagonista. As placas foram sobrepostas e envolvidas com parafilme e filme plástico transparente, de forma que as bases superiores sejam aquelas que contenham o patógeno; e as bases inferiores os antagonistas de Trichoderma sp. (CARVALHO et al., 2011). Incubadas em B.O.D, à temperatura de 20ºC. As avaliações foram realizadas diariamente, com o auxílio de um paquímetro, interrompendo o experimento ao final de oito dias, que é o tempo em que a Testemunha ocupa toda a placa de Petri 202
e, também, dispondo-se da mesma fórmula do teste de pareamento, para calcular o percentual de inibição do crescimento micelial do patógeno: I= ((C T) /C) x 100, onde: C representa os valores em centímetros (cm) do tratamento controle (sem o antagonista) e T os valores em centímetros (cm) do tratamento com a presença do antagonista. Análise Estatística Todos os resultados foram submetidos à análise de variância, com suas médias comparadas pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade. Em todas as análises estatísticas utilizouse o software estatístico SISVAR 5.6 (FERREIRA, 2011). Resultados e Discussão De acordo com os resultados apresentados na Tabela 1, após ambos os experimentos, verificou-se a inibição do crescimento micelial de Stromatinia cepivora (CEN1357) em relação ao controle (placa sem o antagonista). Os tratamentos (CEN1465 e CEN1467) diferiram significativamente dos demais, apresentando regularidade nos dois experimentos com, respectivamente, 58,4% e 66,0% no teste de cultura pareada (CP) e, 62,3% e 52,4% na exposição aos compostos orgânicos voláteis (COVs). No experimento de CP, os tratamentos (CEN1470 e CEN1468) inibiram o patógeno em índices variando entre 55,5% e 71,8%, respectivamente. Já no experimento de COVs, os tratamentos (CEN1471 e CEN1470) variaram de 11,6% a 44,7%, respectivamente (Tabela 1). Tabela 1: Inibição in vitro do crescimento micelial de Stromatinia cepivora mediado pelo teste de cultura pareada e compostos orgânicos voláteis das linhagens de Trichoderma sp. em placas de Petri 9,0x1,5 cm (Brasília, Distrito Federal, 2018). Inibição Micelial Linhagens 1 (%) Pareamento COVs 2 CEN1357 3 xcen1468 4 71,8% a 40,1% c CEN1467 5 66,0% b 52,4% b CEN1465 6 58,4% c 62,3% a CEN1471 7 57,9% c 11,6% d CEN1469 8 55,6% c 41,0% c 55,5% c 44,7% c CEN1470 9-43,3% c CEN1466 10 Média Geral 60,8 42,2 Coeficiente de Variação (%) 4,4 10,0 (1) Valores seguidos pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si, segundo o teste de Scott-Knott (P 0,05). (2) Compostos Orgânicos Voláteis. (3) Stromatinia cepivora CEN1357; (4) Trichoderma sp. CEN1468; (5) Trichoderma sp. CEN1467; (6) Trichoderma sp. CEN1465; (7) Trichoderma sp. CEN1471; (8) Trichoderma sp. CEN1469; (9) Trichoderma sp. CEN1470; (10) Trichoderma sp. CEN1466. No estudo de Silva et al. (2018), foi observado que a supressão micelial dos patógenos (Stromatinia cepivora, Sclerotinia sclerotiorum e Sclerotium rolfsii) variaram, mesmo sendo espécies do mesmo gênero, como o Trichoderma. Resultados obtidos por Castillo et al. (2011), também confirmam que o potencial antagônico do gênero Trichoderma pode variar até mesmo em isolados ou linhagens da mesma espécie. Para Santos et al. (2014), a capacidade antagônica de Trichoderma em inibir o crescimento de fitopatógenos, possibilita a seleção de agentes biológicos eficientes para controlar doenças de plantas. Ainda de acordo com o mesmo autor, é necessário a condução de testes in vivo para confirmar o potencial de inibição obtidos in vitro. Segundo O brien (2017), um dos maiores problemas enfrentados com o biocontrole é a falta de consistência na supressão da doença em nível de campo, devido às diferenças no genótipo dos organismos-alvo e, também, às condições ambientais que podem ser divergentes em relação ao local onde o agente de biocontrole foi isolado e onde é utilizado. Após oito dias de CP entre Stromatinia cepivora e isolados de Trichoderma sp., foi observado diferença no crescimento micelial do patógeno em relação ao controle (Figura 1). De acordo com Louzada et al. (2016) e Machado et al. (2012), os resultados com CP estão relacionados com o hiperparasitismo, que é um mecanismo de ação decorrente da competição do antagonista por nutrientes e/ou espaço com o patógeno, o qual degrada a parede celular do patógeno pela secreção de enzimas líticas, como, quitinases, proteases, glucanases e lipases. Figura 1. Diferentes níveis de interação entre 203
linhagens de Trichoderma sp. (parte inferior da placa) e o fitopatógeno Stromatinia cepivora (parte superior da placa) CEN1357 pelo teste de cultura pareada. A: Trichoderma sp. CEN1465; B: Trichoderma sp. CEN1467; C: Trichoderma sp. CEN1468; D: Trichoderma sp. CEN1470; E: Trichoderma sp. CEN1469; F: Tratamento controle. O experimento de COVs ocorre de modo similar, após oito dias de exposição de S. cepivora aos COVs de isolados de Trichoderma sp., também foi observado diferença no crescimento micelial do patógeno em comparação ao controle (Figura 2). Segundo Benítez et al. (2004), a antibiose relaciona-se durante interações envolvendo baixo peso molecular de compostos difusíveis ou antibióticos produzidos por cepas de Trichoderma que inibem o crescimento de outros microrganismos. Machado et al. (2012) também confirmam que os COVs são correlacionados com a antibiose, que é outro mecanismo de ação do Trichoderma e, é relacionada com a interação onde um ou mais metabólitos produzidos por um microrganismo possuem efeito deletério sobre o outro. Figura 2. Colônias de Stromatinia cepivora CEN1357 após exposição aos Compostos Orgânicos Voláteis de Trichoderma sp. A: Trichoderma sp. CEN1465; B: Trichoderma sp. CEN1471; C: Trichoderma sp. CEN1467; D: Trichoderma sp. CEN1466; E: Trichoderma sp. CEN1468; F: Trichoderma sp. CEN1470; G: Trichoderma sp. CEN1469; H: Tratamento controle. Conclusão O tratamento CEN1468 foi o que apresentou maior potencial de inibição. Porém, não apresentou o mesmo desempenho nos COVs. Os isolados CEN1465 e CEN1467 foram os que mostraram os resultados mais promissores para supressão de Stromatinia cepivora CEN1357 in vitro. Agradecimentos Agradeço, primeiramente, a Deus, pela dádiva da vida. À minha mãe, por nunca ter medido esforços. À minha avó, pelas puxadas de orelha. Ao pai, por toda a contribuição durante todos esses anos. Ao meu irmão, Lincoln Valadares, por ter me ajudado em diversos trabalhos acadêmicos. Ao padrasto, também, por toda ajuda em minha formação. A todos os familiares e amigos que contribuíram no meu caminhar. Em especial, ao orientador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, o Dr. João Batista Tavares da Silva, pelo aprendizado adquirido, por sua paciência e sabedoria; e a todos da Embrapa que contribuíram para que esse trabalho fosse desenvolvido. Ao orientador da Faculdade ICESP, Christian Viterbo, pelo comprometimento em relação à orientação e disposição em ensinar. Referências 1 - ANAPA. Acompanhamento Conjuntural do Alho De janeiro a agosto de 2017 Excesso de oferta em agosto derruba o preço do alho. Disponível em: http://anapa.com.br/wpcontent/uploads/2017/09/acompanhamento-conjuntural-do-alho-2017-agosto.pdf. Acesso em: 13 set. 2018. 2 - BELL, D. K., WELLS, H. D. MARKHAM, C. R. 1982. In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal plant pathogens. Phytopathology, v. 72, n. 4, p. 379-382, 1982. Disponível em: https://www.apsnet.org/publications/phytopathology/backissues/documents/1982articles/phyto72n04_379.p DF. Acesso em: 27 set. 2018. 3 - BENÍTEZ, T., RINCÓN, A. M., LIMÓN, M. C.; CODÓN, A. C. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains. International Microbiology, Sevilha v. 7, p. 249-260, Setembro, 2004. Disponível em: http://www.im.microbios.org/0704/0704249.pdf. Acesso em: 7 nov. 2018. 4 - CARVALHO, D. D. C.; MELLO, S. C. M.; LOBO JUNIOR, M.; GERALDINE, A. M. Biocontrol of seed pathogens and growth promotion of common bean seedlings by Trichoderma harzianum. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 46, n. 8, p. 822-828, Agosto, 2011. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/pab/v46n8/06.pdf. Acesso em: 27 set. 2018. 5 - CASTILLO, F. D. H.; PADILLA, A. M. B.; MORALES, G. G.; SILLER, M. C.; HERRERA, R. R.; GONZALES, C. N. A.; REYES, F. C. In Vitro Antagonist Action of Trichoderma Strains Against Sclerotinia 204
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