P Helicobacter pylori IgG Princípio do Teste O teste ImmunoComb Helicobacter pylori IgG é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com 12 projeções ( dentes ). Cada dente está sensibilizado em duas posições: Ponto superior anticorpos de cabra para imunoglobulina humana (Controle Interno) Ponto inferior antígenos de H. pylori inativados A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são prédiluídas 1:11 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da fileira A. Os anticorpos para H. pylori, se presentes na amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos H. pylori no ponto inferior dos dentes do Pente (figura 1). Simultaneamente, as imunoglobulinas presentes nas amostras serão capturadas pela imunoglobulina anti-humana no ponto superior (Controle Interno). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, os IgG anti-h. pylori capturados nos dentes reagirão com anti-igg humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com o substrato cromogênico. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. Código: 60425002 Formato: 3 x 12 testes O kit ImmunoComb II Helicobacter pylori IgG é um teste para a detecção quantitativa de anticorpos IgG para Helicobacter pylori, em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit. Introdução O Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa, flagelada, curva em espiral, encontrada na mucosa gástrica e nas criptas gástricas do estômago. A bactéria é caracterizada por uma alta atividade de urease. É um patógeno primata com distribuição mundial, afetando mais de 60% da população humana em países industrializados e porcentagens mais altas em países subdesenvolvidos. O aumento na freqüência de infecções que ocorrem entre familiares, com gerações e com multidões, indica que o H. pylori é transmitido por contato direto. Atualmente é geralmente aceito que a infecção pelo H. pylori é a principal causa de gastrite tipo B ativa e crônica, e dispepsia nãoulcerosa. A bactéria tem sido também fortemente associada com úlceras pépticas gastroduodenais e com adenocarcinoma gástrico, uma das formas mais comuns de câncer em humanos. Evidências recentes têm mostrado uma ligação preferencial do H. pylori ao ácido siálico no muco de glicoproteínas e a fucose no antígeno do grupo sanguíneo Lewisb, expresso na superfície das células epiteliais gástricas do estômago. Os métodos atuais para o diagnóstico da infecção por H. pylori incluem métodos invasivos (endoscopia e biópsia gástrica), o teste não invasivo mas radioativo, teste de sopro de uréia e a detecção sorológica. Na biópsias, os organismos podem ser detectados microscopicamente pela produção de urease e pelo isolamento através da cultura celular. Os métodos invasivos são dolorosos e necessitam de várias amostras para sensibilidade adequada, devido à distribuição desigual das colônias de H. Recentemente foram desenvolvidos testes sorológicos confiáveis. Os principais determinantes antigênicos foram detectados na urease, assim como a proteína externa imunodominante de 128kDa (CagA) e citotoxina (VacA) de cepas patogênicas de H. Estudos comparativos têm mostrado correlações positivas entre as respostas de anticorpos IgG às preparações antigênicas de H. pylori, a gravidade da gastrite, a densidade da colonização de H. pylori ou a eficácia da sua erradicação. O kit ImmunoComb II Helicobacter pylori IgG permite o monitoramento sorológico confiável da infecção por H. pylori ou a resposta à terapia. Figura 1. Princípio do Teste O kit inclui um Controle Positivo (IgG anti-h. pylori) e um Controle Negativo, para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum outro ponto inferior ou um ponto inferior bem claro. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se a amostra foi adicionada. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente é sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior anticorpos de cabra para imunoglobulina humana (Controle Interno) Ponto inferior antígenos H. pylori inativados Figura 2. Pente Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. 425/P7 1
Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Fileira F Diluente de amostra Anticorpos de cabra anti-igg humana, marcados com fosfatase alcalina Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo- 4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) Figura 3. Placa Reveladora Controles Controle Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 ml de plasma humano inativado pelo calor, diluído para um cutoff de 20 U/mL para IgG anti- H. Controle Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,2 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anti-h. Diluente de amostra 1 frasco (tampa transparente) de 5 ml. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. CombScale TM para leitura dos resultados dos testes. Segurança e Precauções Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro. Todos os materiais de fonte humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para o vírus da hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos de laboratório aceitos para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes e Placas Reveladoras utilizadas e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. Armazemamento do Kit Armazenar o kit em sua embalagem original de 2 8ºC. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit. Manipulação das amostras Tanto o soro como o plasma podem ser testados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2 8ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a 20ºC ou temperatura inferior. Centrifugar as amostras após o descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão com ponteiras descartáveis para dispensar 10 µl, 25 µl e 100 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Microtubos ou tiras de microtitulação. Preparando o Teste Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 20 minutos; ou deixar à temperatura ambiente (22 26ºC) por 3 horas. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio utilizando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas instruções do Teste. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente o Pente e a Placa Reveladora. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 25 do código do kit para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes + 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para o saco de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 8ºC para uso posterior. Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Pré-diluição das Amostras e Controles 1. Para cada amostra e controle, dispensar 100 µl de diluente de amostra em um microtubo ou cavidade de microtitulação. 2. Para cada microtubo ou cavidade, adicionar 10 µl da amostra ou do Controle Positivo ou Controle Negativo fornecido com o kit. Misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 3. Pipetar 25 µl de uma amostra pré-diluída. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira. 4. Repetir o passo 3 para as outras amostras e para os dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 5. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Agitar: inserir e retirar o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 30 minutos exatos. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final dos 30 minutos, perfurar a cobertura da fileira B utilizando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 30 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes. 425/P7 2
Primeira Lavagem (Fileira B) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: retirar e inserir o Pente vigorosamente nas cavidades pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 5c. Ligação do Conjugado (Fileira C) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no passo 5a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira D) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 6. Neste intervalo perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Terceira Lavagem (Fileira E) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Agitar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do lixo Descartar as Placas Reveladoras utilizadas, ponteiras de pipetas, cavidades de microtitulação ou microtubos, papel absorvente e luvas, como lixo bioinfectante. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar de 2 8ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o correto funcionamento do teste e para demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5). 1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do Pente. 2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, sem afetar a interpretação dos resultados. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle interno). Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Figura 6. Resultados dos Testes Leitura Visual dos Resultados O nível de IgG anti-h. pylori em cada amostra pode ser avaliado pela comparação entre a intensidade de cor do ponto inferior de cada dente, com a escala de cor do CombScale fornecido com o kit. Esta comparação se dá como a seguir: (Figura 7) 1. Calibrar o CombScale. Colocar o ponto inferior do dente do Controle Positivo sob a intensidade de cor mais semelhante ao da escala. Ajustar a régua de modo que 20; C+ apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada. 2. Ler os resultados sem alterar a posição calibrada da régua. Comparar a intensidade de cor de cada ponto inferior com a intensidade mais semelhante da escala de cor. Marcar o valor que aparecer acima da janela como sendo o título aproximado de anticorpos IgG para H. pylori para a amostra correspondente. Figura 7. CombScale Leitura no Equipamento O refletômetro CombScan TM (ver o Manual do Usuário do CombScan para instruções detalhadas) permite uma leitura rápida e objetiva da intensidade da cor dos pontos do ImmunoComb. Ler os resultados dos testes como absorbância relativa usando o programa # 92 do CombScan, determinando a leitura do ponto inferior digitando 1 quando aparecer a mensagem pontos: 1,2,3 na tela. Converter as unidades de absorbância relativa obtidas em valores de título para anti-h. pylori IgG de acordo com a Tabela 1. Tabela 1. Conversão de leituras de absorbâncias relativas em títulos de IgG Absorbância Relativa Título (U/mL) < 779 Negativo 780 1400 Baixo (20) 1401 2200 Médio (60) 2201 Alto (120) Controle Positivo Figura 5. Validação dos testes Controle Negativo Resultados Inválidos Interpretação dos resultados Os valores de títulos maiores ou iguais que o menor título, indicam infecção por H. Leitura e Interpretação dos Resultados Triagem Comparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada amostra com o ponto inferior do dente do controle positivo (Figura 6). Um ponto com coloração mais intensa ou igual a do controle positivo indica a presença de anticorpos IgG para H. Um ponto com coloração menos intensa que o controle positivo é considerado como resultado negativo. Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior. Limitações Como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros testes laboratoriais realizados para o paciente. 425/P7 3
Bibliografia Blaser MJ. 1993. Helicobacter pylori: Microbiology of a slow bacterial infection. Trends Microbiol 1:255-260. Borén T, Falk P, Roth KA, et l. 1993. Attachment of Helicobacter pylori to human gastric epithelium mediated by blood group antigens. Science 262:1892-1895. Covacci A, Censini S, Bugnoli M, et al. 1993. Molecular characterization of the 128-kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer. Proc Nati Ac Sc, USA 90:5791-5795. De Giacomo C, Lisato L, Negrini R, et al. 1991. Serum immune response to Helicobacter pylori in children: Epidemiologic and clinical applications. J. Pediatrics 119:205-210. Halter F, Hurlimann S. Inauen W. 1992. Pathophysiology and clinical relevance of Helicobacter Yale J Biol Méd 65:625-638. Kosunen TU, Seppälä K, Sarna S, Sipponen P. 1992. Diagnostic value of decreasing IgG, IgA, and IgM antibody titres after eradication of Helicobacter Pylori. Lancet 339:893.895. Kreuning J, Lindeman, Biemond I, Lamers CBHW. 1994. Relation between IgG and IgA antibody titres against Helicobacter pylori in serum and severity of gastritis in asymptomatic subjects. J Clin Pathol 47:227-231. Parsonnet J. Friedman GD, Vandersteen DP, et al. 1991. Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 325:1127-1136. Talley NJ, Newell DG, Ormand JE, et al. 1991. Seriodiagnosis of Helicobacter Comparison of enzyme-linked immunosorbent assays. J Clin Microbiol 29:1635-1639. Telford JL, Covacci A, Ghiara P, Montecucco C, Rappuoli R. 1994. Unravelling the pathogenic role of Helicobacter pylori in peptic ulcer; potential new therapies and vaccines. Trends Biotechnol 12:420-4267. The Eurogast Study Group (D. Forman, et al). 1993. An international association between elicobacter pylori infection and gastric cancer. Lancet 341:1359-1362. Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne 70650 - ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA Alameda dos Ubiatans, 257 - Planalto Paulista 04070-030 São Paulo - SP CNPJ : 01.767.606/0001-10 Atendimento ao consumidor SAC: (11) 5589-4622 FAX: (11) 5581-3279 e-mail: orgenics@uol.com.br Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº 10348680005 Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva CRF-SP 13020 CONSERVAR ENTRE 2-8ºC P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel h t t p : / / w w w. o r g e n i c s. c o m 425/P7 4
Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb Helicobacter pylori IgG. (Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo). 1. Trazer todos os reagntes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26º C. 2. Pré-diluir 10 µl de cada amostra e controle com 100 µl de diluente de amostra. 3. Dispensar 25 µl de cada amostra e controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar. 4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1. Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misturar; incubar por 30 minutos; absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação do conjugado C Misturar; incubar por 20 minutos; absorver. Lavagem D Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar por 10 minutos. Reação de parada E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre. 425/P7 5