Transformação Genética de Plantas e suas Aplicações em Pesquisa e Biotecnologia Profa. Dra. Magdalena Rossi FINANCIAL SUPPORT
Que é um organismo geneticamente modificado (OGM)? São aqueles que recebem um ou mais genes de outro organismo e passam assim a expressar uma nova característica de interesse. OGMs = melhoramento genético clássico. -cruzamentos naturais ou forçados com seleção humana (milho/teosinte?) -introgressão de genes de espécies selvagens em S. lycopersicum. OGMs= tão antigos quanto a agricultura.
Melhoramento genético: CLÁSSICO TRANSFORMAÇÃO DIRETA Característica de interesse Planta de interesse Estabilidade da informação transferida Gene de interesse Planta de interesse Estabilidade da informação transferida Ambos dependem da seleção das cultivares para uso comercial em etapas subsequentes.
Que é um transgênico?
Agrobacterium: Angiospermas (eudicotiledôneas, mono) e Gimnospermas) Rhizobiaceae (Rhizobium, Bradyrhizobium) A. tumefaciens (galha-da-coroa) A. tumefaciens A. rhizogenes
Histórico 1907; descreve-se a doença 1930; caracteriza-se o agente: Agrobacterium 1970; constata-se a correlação entre a doença e um plasmídeo 1979; transferência de um fragmento de DNA da bactéria para a célula vegetal
A. tumefaciens pti Porque forma o tumor?
A. rhizogenes pri porque surgem raizes?
Uma interação peculiar...
Agrobacterium - Transfere um fragmento de DNA, o T-DNA, do plasmídio Ti no genoma vegetal. - Inserção em posição aleatória dentro do genoma. - Induz a proliferação celular originando tumores ou raízes a partir da célula transformada. - As células vegetais transformadas sintetizam substâncias chamadas opinas que são a fonte de C e N das bactérias.
Organização de pti ou pri síntese de opinas e oncogenes (síntese de citocininas, auxinas ou sensibilidade para auxinas) Região transferida Borda direita Borda esquerda (transferência do T-DNA: genes de virulência) 200Kb (conjugação entre agrobactérias do solo) (catabolismo de opinas) (origem de replicação e região de incompatibilidade)
Transferência do T-DNA Vir Gene expression Phenolics induced detected by the VirA/VirG two component sensor system. T-DNA Vir D1 & D2 cut T-DNA at right and left borders and starts T-DNA synthesis (VirC) VirE2 Formation of T-complex AGROBACTERIUM VirD2 attaches to exposed 5 I end VirA VirG Bacterial Plasmid Formation of T-Pilus (VirB and VirD4 PLANT CELL Phenolics Produced by Wounded Plant cell Gall Formation! T-DNA integrates into plant DNA and gall production is initiated. VIP1 associates with the complex to target it to the nucleus VIP2 associates the complex to transcriptionally active DNA
Transformação via Agrobacterium -Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção. -Introdução da construção na bactéria. -Introdução da construção na célula vegetal pela bactéria. -Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
Organização de pti ou pri GENE DE INTERESSE + MARCADOR DE SELEÇÃO Região transferida Borda direita Borda esquerda (transferência do T-DNA: genes de virulência) 200Kb (conjugação entre agrobactérias do solo) (catabolismo de opinas) (origem de replicação e região de incompatibilidade)
Transformação de explantes T-DNA: Gene de interesse + Gene de resistência para seleção de transformantes SEM GENES DE OPINAS E SEM ONCOGENES
Transformação de células Células 3-4 dias em cultura liquido Meio + antibióticos para seleção 4 ml 3 dias de cocultivo Replaqueamento em meio seletivo Após 7 dias 50 100 ul 1 2 Bactérias de 1-2 dias em cultura 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Transformação de células e seleção Replaqueamento em meio seletivo Células que não cresceram em meio seletivo Células crescendo em meio seletivo Meio MS30 sólido Carb + Vanc + Higro U3B::GUS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 U3A3MR::GUS U3A2MR::GUS Controle -
O processo de regeneração Seleção de linhagens portadoras do gene de interesse.
Transformação via bombardeamento (canhão gênico) -Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção. -Introdução da construção de interesse por um mecanismo físico. -Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
Transformação genética de plantas: bombardeamento Prom Gene de interesse VETOR Gene de interesse + Gene de resistência para seleção de transformantes Bombardeador Partículas de tungstênio carregando DNA Bombardment
Transformação via eletroporação -Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção. -Introdução da construção de interesse por um método físico. -Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
Transformação genética de plantas por eletroporação Prom Gene de interesse VETOR Gene de interesse + Gene de resistência para seleção de transformantes D E F
Acompanhar a expressão do transgene nos órgãos Plantas cultivadas in vitro Prom Gene reporter VETOR Estudo de Promotor do gene de interesse
Acompanhar a expressão do transgene nos tecidos A 0.5cm B Prom Gene reporter VETOR C
Acompanhar a expressão frente a diferentes condições fisiológicas Prom Gene reporter VETOR Quantificação U3A3MR:: GUS tecido intacto tecido lesado U3A2MR:: GUS tecido lesado tecido intacto 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 MU pmol/?g proteina/hora
Sobreexpressão de uma proteína de interesse Prom Forte Gene de interesse VETOR Plantas maiores
Sobreexpressão de uma proteína de interesse Prom Forte Gene de interesse VETOR Metabólitos novos: carotenóides
Silenciamento de um gene de interesse: função? Prom Forte Gene de interesse VETOR Silenciamento (RNA de interferência)de gene de desenvolvimento: Daysleeper
Silenciamento de um gene de interesse: função? Prom Forte Gene de interesse VETOR Silenciamento (RNA de interferência)de envolvido na cascata de sinalização das citocininas
Expressão de uma variante diferente de uma proteína de interesse Prom fruto Variante génica de interesse VETOR Variante selvagem da invertase: Aumenta o conteúdo de sólidos solúveis que é um caracter de importância industrial.
Histórico sobre as plantas transgênicas (12 anos depois de descobrir o plasmídio..) 1983 - Criada a primeira planta transgênica (fumo resistente a antibiótico) 1985 - Testes em campo com plantas transgênicas resistente a vírus, bactéria e insetos 1986 - EPA (EUA) aprova a liberação da cultura da primeira planta transgênica (fumo resistente à herbicida) 1990 - Cultura de algodão (resistência à herbicida) obtida com sucesso em campo aberto 1992 - FDA (EUA) decide que alimentos transgênicos seriam regulados como alimentos convencionais 1994 - Tomate FlavrSavr é o primeiro alimento transgênico aprovado para venda 1995 a 2000 - Canola, milho, algodão, soja e beterraba resistente à herbicida bem como milho, algodão, mamão, batata, abobrinha, tomate resistentes a vírus ou inseto foram aprovados nos EUA. 2001 - "Golden rice que deve prevenir milhões de casos de cegueira e morte causadas por deficiência de vitamina A e ferro está sob testes
Culturas trangênicas comerciais (23) RI resistência a inseto; RH resistência a herbicida; RV resistência a vírus; MO modificação de óleo; EM esterilidade masculina; ReS retardo de senescência; ReM retardo de maturação
Resistência a insetos: algodão Bt (?) Variedade de algodão Produção (kg/ha) Custo total de produção/kg algodão (US$) Uso de pesticida/ha No aplicações Quantidade (kg) Custo (US$) selvagem 3186 2.23 19.8 60.7 762 Bt 3371 1.61 6.6 11.8 136
Tolerância à salinidade Canola transgênica tolerante à salinidade Canola selvagem
Inibição de Senescência Tomate FLAVR SAVR TM (Calgene)
Aumento do Valor Nutricional Arroz selvagem Arroz dourado E o excesso de vitamina A?????
Resistência a herbicidas E.coli Campo experimental de soja (Roundup Ready TM, Monsanto) Planta Gene EPSP presente nos mais diversos organismos inclusive em plantas com grau de similaridade > 65%. Monsanto vende a soja e o herbicida (glifosato)=monopólio ECONÔMICO Há abuso na aplicação do herbicida por falta de informação dos agricultores.
Mamão resistente ao vírus da mancha anelar (EMBRAPA) Mamoeiro selvagem sensível pelo vírus Mamoeiro transgênico resistente ao vírus
Feijão resistente ao vírus do mosaico dourado (EMBRAPA)
Novas cores Cravos série Moon TM (Florigene Flowers)
Produção de medicamentos Vincristina (anticancerígeno): US$ 12 milhões/kg Catharanthus roseus
Bibliografia e sites - Manual de Transformação Genética de Plantas. Brasileiro A.C.M. e Carneiro V.T.C. EMBRAPA, 1998. - Biochemistry and Molecular Biology of Plants. Buchanan B.B., Gruissem W. e Jones R.L. American Society of Plant Physiologists, 2000. Site do CIB: http://www.cib.org.br Revista Biotecnologia: http://www.biotecnologia.com.br Greenpeace: http://www.greenpeace.org.br CTNBio: http://www.ctnbio.gov.br ISAAA: http://www.isaaa.org Agbios Inc: http://www.agbios.com/default.asp