I Simpósio Internacional de Hemostasia e Trombose Curso Educacional Teórico Prático ISTH - CLAHT International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH) VI Simpósio sobre Trombose e Hemostasia Curso AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA Tania Rubia Flores da Rocha Farmacêutica Bioquímica Laboratório de Hemostasia Serviço de Hematologia Hospital das Clínicas SP
GLICOPROTEÍNAS PLAQUETÁRIAS ADESÃO E AGREGAÇÃO Gp IIbIIIa Gp IaIIa (α2β1) Gp VI αiibβ3 Gp Ib
Plaquetas Funções
HEMOSTASIA MANUTENÇÃO E REGULAÇÃO DO TONUS VASCULAR (SOB ATIVAÇÃO) Liberação de Serotonina;Tromboxano A2 e PGs INFLAMAÇÃO Aterosclerose Alergia Quimiotaxia Interação com leucócitos FUNÇÃO PLAQUETÁRIA DEFESA Fagocitose Liberação de proteínas microbicidas Produção de superóxido BIOLOGIA TUMORAL Crescimento Morte Metástase do tumor Harrison, P. Blood 2005 19:111
Fatores de coagulação GPIb GPIIb-IIIa GPIa-IIa GPVI FVW Endotélio Íntegro
Lesão Endotelial Fib; FP4; βtg; FVW ATP; Ca ++ ; ADP; Serotonina Y GPIIb-IIIa GPIa-IIa GPIb GPVI Adesão Mudança de forma Secreção Agregação
Plaquetas Metabolismo
Receptores específicos de alguns agonistas plaquetários ADP ADP ADP P2X1 P2Y1 P2Y12 TXA2 TP α- adrenérgico PLAQUETA α2β1 ADR PAR-1 Trombina PAR-4 Trombina GPVI Colágeno GPIa/IIa Colágeno
Colágeno endotélio FVW AMPLIFICAÇÃO Trombina PAR1/4 ADP P2Y1 PGq GPIb-V-IX FLCβ2 GPIa-IIa GPVI FLCу2 PGI2 IP AC P2Y12 PGi ADP TXA2 TP DAG PI3 AMPc AA Ca ++ FLA2 CO PKC degranulação Ca ++ DAG-GEFI talina Ca ++ quindilina 3 GPIIb-IIIa P3I r Orai 1 STIM1 STIM1 Ca++ STD Fibrinogênio Ca ++ GPIIb-IIIa Thromb Res 2012 129: 245
Hereditárias 1 - Defeitos de adesão Alteração da função plaquetária Síndrome de Bernard Soulier; DVW; pseudo-dvw 2 - Defeitos na agregação plaquetária Trombastenia de Glanzmann 3 - Defeitos de receptores dos agonistas e na via de sinalização Defeitos de receptor: TXA2; ADP; Colágeno; defeito de sinalização via Prot G; anormalidade das vias do araquidonato e TXA2; defeito do metabolismo do fosfatidilinositol; defeito da mobilização de cálcio 4 - Defeitos de grânulos plaquetários Deficiência no pool de estoque (α-grânulos, δ-grânulos, ou ambos ex: síndrome da plaqueta cinza; síndrome de Hermansky-Pudlak, síndrome Wiskott-Aldrich), Doença de Quebec 5 - Defeitos atividade pró-coagulante Síndrome de Scott
Alteração da função plaquetária Adquiridas Drogas Uremia Doença mieloproliferativa Hepatopatia Disproteinemia Circulação extra-corpórea
Teste laboratorial Agregação plaquetária PPP autólogo Sistema óptico -1962 ADP (padrão ouro) PRP Máxima densidade óptica Fonte de Luz Célula fotoelétrica Detector de luz e Amplificador de sinal
Cinética da agregação plaquetária sistema óptico 1 Plaquetas sem estímulo Receptor específico Mensageiros primários GIIb-IIIa ADP,ATP, serotonina, TXA2 2 Adição do agente agregante 3 Mudança de forma e agregação primária 4 Agregação secundária secreção plaquetária Am J Clin Pathol 2005;123:172-183
Agregação Plaquetária Agonista Forte Agonista Fraco Trombina Colágeno Ca ++ Agregação + Síntese detxa2 + ADP Epinefrina Secreção + + ATP ADP ATP Semin Thromb Hemost 35(2):158, 2009
Técnica Agregação plaquetária (método turbidimétrico) Sempre em temperatura ambiente - Coleta em citrato de sódio 3,2 ou 3,8% (1:9) (Ht N) - Centrifugação 1000 rpm /10 minutos - PRP - Centrifugação 2500 rpm/15 minutos - PPP (Branco) - Repouso do PRP (30 60 minutos)* - Tempo entre coleta e execução do teste : até 3-4 h
Aplicações clínicas Diagnóstico de disfunções plaquetárias hereditárias e/ ou adquiridas relacionadas a doenças hemorrágicas Cattaneo M. Semin Thromb Hemost 35(2) 2009 A monitoração de drogas anti-plaquetárias (AAS ou clopidogrel) deve ser desencorajada FALTA DE PADRONIZAÇÃO -Variáveis pré analíticas -Variáveis analíticas (doses dos agonistas)
Concentrações dos agonistas plaquetários utilizadas em laboratório NASCOLA NEQAS QAP ADP µm 5,0 (0,5 1000) 20(0,16-40) 5,0(0,5-50) Colágeno µg/ml 5,0 (0,19 125) NR(0,2-10) 4,0(0,5-190) Epinefrina µm 18 (0,1 100.000) NR(1,0-1000) 10(2-300) Ristocetina mg/ml Dose baixa 0,5(0,25-1,50) NR NR (0,25-2,0) Dose alta 1,2(0,25-1,50) NR 1,5 (1,0-2,0) Ácido araquidônico mm 0,5(0,0005-1,7) NR(0,5-1,0) 1,6(NR) Favaloro EJ Clin Chem Lab Med 2010; 48(5):579-598
Concentrações dos agonistas plaquetários utilizadas em laboratório CLSI Agonista ADP µm LTA WB Concentração final (variação) 0,5-10 5-20 Colágeno µg/ml Epinefrina µm Ristocetina mg/ml Baixa dose Alta dose Ácido araquidônico mm Tipo 1 1-5 0,5-10 0,6 0,8 1,5 0,5 e 1,6 Tipo 1 1-5 Não recomendado 0,25 1,0 0,5-1 Favaloro EJ Clin Chem Lab Med 2010; 48(5):579-598
Resultados Qualitativo - normoagregante - hipoagregante - hiperagregante Amplitude de agregação ou Porcentagem de agregação A B (A /B) x 100 B
Perfil de agregação plaquetária (sistema óptico) 5 Mm µm 5µM 5µg/ml 5µM 0.5µM 0,5mM 5 µm 7,5 7.5 µm ADP ADP Adrenalina Colágeno AA 0.7 µm 0.7 mm 0.7 mm µm 0,5 µg/ml SPA (-) SPA (+) 7,5µM 7.5µM 7.5 7,5 µm 7.5µM 7,5µM colágeno Normal Hipoagregante Hiperagregante Hiperagregante Agregação espontânea ADP ADP ADP Colágeno
Investigação e Interpretação de plaquetopatia com o teste de agregação plaquetária Receptores específicos Ausência/D ADP; Adrenalina; Colágeno (mudança de forma normal) Trombastenia de Glanzmann Ausência/D ADP; Adrenalina; Colágeno Secreção (doença de estoque) Ausência de segunda onda ADP; Adrenalina; Colágeno Doença de von Willebrand (sub-tipo 2A e 2B) Hipo Ristocetina (>1,2 mg/ml) Hiper Ristocetina (<0,6 mg/ml) Síndrome de Bernard Soulier Hipo Ristocetina (> 1,2 mg/ml) DvW x S. Bernard Soulier Normal Plasma bovino Hipo/ausente Plasma bovino/normal
Agregação plaquetária por sistema óptico gold standard Desvantagens Centrifugação para separar plaquetas de outros elementos celulares Centrifugação recupera 60 a 90% do número total de plaquetas Perda de macro/gigantes plaquetas (hipo ou hiper reativas) Não detecta microagregados hiper agregação Volume de sangue (pediatria) Plasma lipêmico Número de plaquetas
Agregação plaquetária sistema óptico Especificidade e sensibilidade Estudados 229 indivíduos com queixas de sangramento (exclusão de plaquetopenia e DVW) 105 controles saudáveis 173 pacientes apresentaram Doença hemorrágica definida 96 doença plaquetária hereditária (DPH) e adquirida(dpa) A incidência de falsos positivos foi semelhante entre o controles saudáveis e pacientes excluídos de doença hemorrágica Agregação plaquetária anormal foi mais frequente em indivíduos com distúrbios hemorrágicos E com maior probabilidade de um distúrbio de sangramento quando a agregação plaquetária foi reduzida com dois ou mais agonistas A agregação plaquetária é valiosa para a detecção de anormalidades da função plaquetária em indivíduos encaminhados para problemas de sangramento, especialmente quando o teste indica respostas anormais a múltiplos agonistas. Hayward CP et al J Thromb Haemost 2009; 7:676
Alterações de função plaquetária Drogas Doença de von Willebrand Doença de estoque dos grânulos
Hayward CP et al J Thromb Haemost 2009; 7:676 Sensibilidade? 50 dos indivíduos estudados Defeito de secreção plaquetária (28 apresentaram agregação plaquetária NORMAL) Nieuwenhuis HK et al Blood 1987 106 pacientes doença plaquetária de estoque 33% agregação plaquetária Normal Clínica do paciente!!!!!!!
Ativação plaquetária e Secreção do conteúdo dos grânulos Grânulo alfa Grânulo ADP, Serotonina, ATP, FC,FVW... denso Grânulo lisossomal Serotonina ATP
Avaliação da liberação dos grânulos densos Reação de Luminescência (1984 Ingerman-Wojenski e Silver) luciferina- luciferase ATP PPi Luciferina Luciferil:AMP O 2 Luminescência Oxyluciferina + AMP
Avaliação da Liberação de ATP intra-plaquetário no PRP ADP 10 µm ADP 10 µm ADP 10 µm ATP ATP ATP Agregação normal Secreção de ATP normal Agregação anormal Secreção de ATP anormal Agregação normal Secreção de ATP anormal
ADP Adenosina Óxido nítrico (NO)
Cardinal e Flower em 1980 introduziram um método baseado na resistência elétrica entre dois eletrodos imersos no SANGUE TOTAL para medir a agregação plaquetária. IMPEDÂNCIA
Teste laboratorial Agregação plaquetária Sistema de Impedância em Sangue total Eletrodo é colocado no tubo contendo a amostra A passagem de corrente elétrica leva a formação de uma camada de plaquetas no eletrodo A resistência elétrica (impedância) é proporcional ao recrutamento de outras plaquetas e outras células e a agregação Cardinal & Flower-1980
Impedância em Sangue total TXA2 Agente agregante ADP, serotonina
Agregação plaquetária por Impedância Impedância Sistema Óptico Chrono-log Primeira onda Segunda onda Multiplate
Agregação plaquetária em sangue total por Impedância Vantagens Ausência de centrifugação e consequentemente as plaquetas não se ativam Inclusão de plaquetas gigantes (Síndrome de Bernard Soulier / outras plaquetopatias) Tempo reduzido do teste, além de ocorrer em condições fisiológicas (plaquetas, eritrócitos, leucócitos) Pequeno volume de sangue (crianças e pacientes com veias de difícil acesso) (4,5 ml de sangue / 4 agentes em duas concentrações) Plaquetopenia (50.000/mm3) Amostras lipêmicas e ictéricas
Agregação plaquetária em sangue total por Impedância Mais sensível a drogas anti-plaquetárias, principalmente para o Clopidogrel, em relação ao sistema óptico de agregação McGlasson D. Semin Thromb Hemost 2009;35:168-80
Metabólitos da Tienopiridinas ADP P2Y 12 Gi ATP AC camp PKA VASP VASP-P Michelson AD. Hematol Am Soc Hematol 2011; 2011:62-9.
Agonistas utilizados para monitoração de AAS com agregação plaquetária por Impedância AGONISTAS Concentrações recomendadas Colágeno 1 µg/ml 5 µg/ml (dose não inibida por AAS) Ácido araquidônico 0,5 mm 1,6 mm
Definição de Resistência ao AAS em pacientes com doença a de artéria ria coronariana (CAD) Agregação plaquetária por Sistema Óptico Ácido araquidônico 20% ADP 70% Agregação plaquetária por Impedância em sangue total Ácido araquidônico 3 Ω Lordkipanidzé M. Eur Heart J 2007; 28:1702-8
Definição de Resistência ao Clopidogrel em pacientes com doença a arterial coronariana (CAD) Agregação plaquetária por Sistema Óptico ADP 10 mm Diferença de porcentagem de agregação antes e após o Clopidogrel não respondedor < 10% semi-respondedor 10 30% respondedor > 30% Gurbel PA. Circulation 2003;107:2908-2913 Agregação plaquetária por Impedância em sangue total ADP >5 Ω Ivandic B T. Clinical Chem 2006; 52(3):383-388
Impedância em sangue total X PRP Óptico CLOPIDOGREL Indivíduo saudável 75 mg clopidogrel/10 dias 11 dia (teste de agregação) ADP 20 10 5 2,5 µm Impedância ( Ω ) 3 2 0 0 Sistema óptico (%) 71 81 69 68 Dyszkiewicz-Korpanty AM. Clin Appl Throm Hemost 2005;11:25-35
Conclusão Os testes de função de plaquetas têm demonstrado variabilidade de resposta (também referido como 'resistência') para a aspirina e clopidogrel O tratamento correto ainda é desconhecida, porque não há estudos publicados que relatem a eficácia clínica da terapia baseada em testes laboratoriais. Monitorar terapia antiplaquetária por métodos point-of-care (fácil de usar, sem habilidades especiais, sem o processamento da amostra, não pipetagem e leitura rápida) parece ser clinicamente vantajosa (Michelson, in PLATELETS 2nd ed, 2007)
Obrigada taniarfr@gmail.com