INUMO-HEMATOLOGIA DOADOR E RECEPTOR VITÓRIA 2014

INUMO-HEMATOLOGIA DOADOR E RECEPTOR VITÓRIA 2014

Imuno-Hematologia Conceito: é o estudo relacionado com imunologia de grupos sanguíneos presentes nas hemácias, e imunologia de plaquetas e leucócitos. É o laboratório que que realiza os testes que determinam os grupos sanguíneos e os anticorpos contra grupos sanguíneos, e as provas de compatibilidade pré-transfusionais.

Esta relacionado com: Imuno-Hematologia Presença de antígenos nos glóbulos vermelhos e anticorpos no sangue. Interação entre estes antígenos e anticorpos. Determinação de Grupos sangüíneos. Seleção de sangue de doadores. Transfusão sangüínea. Incompatibilidade sanguínea e materno fetal e Reação transfusional.

Importância na Transfusão: Imuno-hematologia Definir o fenótipo, sobretudo ABO e RhD dos doadores e receptores de sangue. Pesquisar a presença de anticorpos no plasma do receptor contra antígeno presente nas hemácias do doador. Evitar reação transfusional que pode ser leve a grave, inclusive com morte do receptor.

Antígeno Substância que induz uma resposta imune quando introduzida num indivíduo imunocompetente para o qual ela é estranha e é capaz de reagir com o produto desta resposta. Os Grupos Sanguíneos são antígenos presentes na parte externa da membrana das hemácias. Podem induzir a formação de anticorpos quando transfundidos em indivíduos que não apresentam o antígeno.

Antígeno Grupo sanguíneo: São estruturas (proteínas e açucares) que estão presentes na parte externa da membrana das hemácias. São antígenos definidos sorologicamente por anticorpos imunes. Tem que ser herdado dos pais.

Hemácia

Corte da membrana da Hemácia

Aumento do corte da membrana da Hemácia

Proteína transmembrana

A e B Matriz de Fosfolipídios Representação esquemática dos Antígenos A e B

Esquema da Membrana com os antígenos de Grupo Sanguineo

fluido fluido Dupla Camada de Fosfolipídios Membrana Exterior da Célula Cadeias Glicídicas Proteínas de Transporte (Canais) Proteína de Transporte Citoplasma Sistema de Proteínas de Transporte Proteína de Reconhecimento Proteína Receptora Fosfolipídios Colesterol Estrutura e Função dos Grupos Sanguíneos na Membrana da Hemácia

ANTICORPO É uma proteína produzida em reposta a um estímulo não próprio. Os anticorpos contra Grupo Sanguíneo são específicos. São moléculas de imunoglobulinas (Ig) produzidas por linfócitos B e secretadas para o plasma. Funções: Ligar-se ao antígeno Funções Efetoras: > fixar complemento > ligar-se a vários tipos celulares

QUANTO A OCORRÊNCIA NATURAIS: Anticorpos produzidos naturalmente, sem contato prévio com Grupo Sanguíneo. Surjem em resposta a antígenos presentes em bactérias ou alimentos com estrutura semelhante a dos grupos sangüíneos. Em geral da classe IgM. ADQUIRIDOS: Anticorpos adquiridos por resposta imune a transfusão e/ou gravidez. Em geral da classe IgG.

IgG

Testes de Aglutinação Hemaglutinação: é a Técnica empregada nos testes de imuno-hematologia. Porém os testes moleculares são cada vez mais usados, para genotipagem de grupos sanguíneos, sobretudo na investigação de casos complexos e quando não há reagente comercial no mercado.

Hemaglutinação: reação antígeno x anticorpo Anticorpo Antígeno (Hemácia) Aglutinação

Sensibilização e Aglutinação por IgG

Técnicas: Rotina IH de doador de sangue Microplaca: Mais utilizada para doadores, pode ser para sistemas automatizados ou pipetarem manual. Tubo: mais difundida. Muito utilizada para resolver problemas nos resultados. Realizada em pipetagem manual e de rotinas pequenas. Colunas de aglutinação: gel centrifugação, pipetagem manual ou sistema automatizado. para

Hemaglutinação na Investigação imunológica eritrocitária Pesquisa: Antígenos eritrocitário Anticorpos antieritrocitários Autoanticorpos Aloanticorpos Definir a especificidade do Anticorpo

Investigação imunológica eritrocitária Placas opalinas Antissoro + hemácias Hemácias (reagentes) + soro Homogeneizar e ler Tubos Antissoro + hemácias Hemácias(reagentes ) + soro Potencialização da reação: Incubação 37 C, centrifugação, leitura Meios potencializadores Macrotécnicas / Manuais (Rouger & Salmon, 1981)

Investigação imunológica eritrocitária Microplacas Antissoro + hemácias Hemácias (reagentes) + soro Potencialização da reação: Incubação 37, agitação, centrifugação, agitação meios potencializadores Microtécnica / Automação

Investigação imunológica eritrocitária Colunas de aglutinação Microtubos com meio específico que permite a separação das diferentes populações de células Meios potencializadores Anti Ig GV + amostra Incubação Microtécnicas /Automação centrifugação (Lapierre, 1990; Reis et al., 1993)

Principais Variações das técnicas suporte tubos microplaca coluna tubos microplaca coluna Vidro ou descartável Poliestireno 96 cavidades Cartão plástico 6 a 8 micro tubos Centrífuga Sorológica ou tubos de hemólise Com rotor de microplaca Específica de cartão

Principais Variações das técnicas Tempo médio de centrifugação tubos microplaca 15 segundos 1 a 2 mim. coluna 9 a 10 mim. De acordo com o fabricante Concentração da suspensão de hemácias tubos 2,5 a 5% microplaca 1 a 3% coluna 0,8 a 1,2% ou 2,5 a 5%

Principais Variações das técnicas Volume da suspensão de hemácias tubos microplaca 1 gota (50µl) 1 gota (50µl) coluna 10 µl, 25 µl ou 50 µl Volume do soro ou plasma tubos 100 µl microplaca 50 µl coluna 25 µl a 50 µl de acordo com teste

Principais Variações das técnicas Diluição Reagentes tubos Reagente sem diluir microplaca coluna de aglutinação Pré dispensado, puro ou diluído de acordo com a validação Em geral pré dispensado ou diluído de acordo com a validação Potencializador de reação tubos Salina, enzimas, LISS, PEG, albumina bovina 22% microplaca coluna de aglutinação Salina, enzimas, LISS ou albumina bovina Enzimas ou LISS

Rotina de doador de sangue No Brasil a legislação (Portaria 2.712, de 12 de novembro DE 2013 e Resolução RDC 57 de 16 de fevereiro de 2010) Regulamento Sanitário para Serviços que desenvolvem atividades relacionadas ao ciclo produtivo do sangue, determinam para exames Imuno-Hematológicos de amostra de doadores de sangue: Fenotipagem ABO: Direta e Reversa. Fenotipagem RhD: com pesquisa de D fraco. Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI).

Rotina de doador de sangue Fenotipagem ABO: O grupo ABO deve ser determinado testando-se os glóbulos vermelhos com reagentes anti-a, anti-b e anti-a,b. Caso sejam usados anti-soros monoclonais, a utilização do soro anti-a,b não é obrigatória. A tipagem reversa deve ser sempre realizada, testando-se o soro ou plasma com suspensão de glóbulos vermelhos conhecidos A1 e B e, opcionalmente, A2 e O.

Rotina IH de doador de sangue Fenotipagem ABO: Uma unidade de sangue não deve ser liberada para utilização até que qualquer discrepância entre a tipagem direta e reversa tenha sido resolvida.

Rotina IH de doador de sangue Fenotipagem RhD: com pesquisa de D fraco. O antígeno Rh(D) deve ser determinado colocandose os eritrócitos do paciente em contato com soro anti-rh (Anti-D); deve ser sempre efetuado um controle da tipagem Rh, utilizando-se para isto sorocontrole de Rh do mesmo fabricante do soro anti-d. Se a reação for negativa para a presença do antígeno D, deve ser efetuada técnica para a exclusão de D fraco.

Rotina IH de doador de sangue Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI): Deve ser realizada nos doadores a pesquisa de anticorpos séricos irregulares, empregando-se métodos que evidenciem a presença de anticorpos clinicamente significativos.

Imuno-Hematologia Rotina do doador de sangue Recebimento da amostra; Preparo da amostra; Colocar os reagentes nas placas; Colocar as amostras nas placas; Centrifugar as placas; Leitura dos resultados; Liberação dos resultados;

Imuno-Hematologia Rotina transfusional prova cruzada Recebimento da amostra e o pedido; Preparo da amostra; Classificação ABO, Rh e PAI do paciente; Selecionar e reclassificar a bolsa de CH; Fazer a prova cruzada; Liberar os resultados e a bolsa para transfusão.

Testes pré transfusionais Objetivos: Compatibilizar a amostra de sangue do receptor com o sangue do doador a ser transfundido. Detectar anticorpos clinicamente significantes. Otimizar o aproveitamento do sangue transfundido. Evitar reação transfusional.

Testes pré transfusionais Como é realizado? Através de testes laboratoriais realizados nas Agencias Transfusionais. Testes de Imuno-Hematologia. Método: Testes de aglutinação. Técnica: Em tubo, microplaca ou gel centrifugação.

ABO Direta RhD ABO Reversa Reagentes utilizados na Classificação Sanguínea ABO/RhD

Tubo 1+

Tubo 3+

Tubo 4+

Aglutinação em micro tubos de GEL Sefadex

Micro tubos em gel de sefadex

TESTES PRÉ TRANSFUSIONAIS: Classificação e triagem do doador Classificação ABO e Rh do receptor. Pesquisa de anticorpo irregular no receptor (PAI) no caso de positivo deve ser seguido de identificação do anticorpo. Checar os registros anteriores (manual ou computador). Seleção da bolsa Classificação ABO,RhD e PAI do doador (prévio) Reclassificação ABO/RhD da bolsa Prova cruzada. HEMOSC

6. Procedimentos realizados Nível 6.1 POP atualizado e disponível II Deve ter um sistema de atualização periódica. Deve estar disponível (cópia física ou eletrônica) a todos os colaboradores que utilizam a técnica, que devem ser treinados para cada POP. Deve ter nome de quem escreveu e de quem aprovou o POP.

6. Procedimentos realizados Nível 6.1 POP atualizado e disponível II 6.1.1 Procedimentos executados conforme POP III Procedimento Operacional Padrão POP São manuais escritos para cada procedimento utilizado e a técnica realizada no laboratório. Deve conter os detalhes de cada técnica e a maneira de fazer, incluindo os princípios e objetivos, o material, equipamentos e reagentes necessários, a identificação e preparo da amostra, a dispensação dos reagentes, a interpretação dos resultados, a liberação e as formas de registros. No caso de problemas encontrados deve também dar orientações de como resolver ou como encaminhar.

6.2 Realiza/registra tipagem ABO direta a cada doação Método: 6.3 Realiza/registra tipagem ABO reversa a cada doação Método: III III Fenotipagem ABO: Direta ou dos Glóbulos: testa as hemácias diretamente contra reagentes anti-a, anti-b e/ou anti-ab. Reversa ou do plasma: Testa o plasma contra hemácias reagentesa1 e B. No sistema ABO existe o antígeno ABO na membrana da Hemácia e anticorpos naturais no plasma.

Classificação Direta Classificação Reversa

Fenotipagem ABO em placa

Fenotipagem ABO em placa Anti A B AB Direta

Fenotipagem ABO em placa A1 B Reversa Anti A B AB Direta

6.5 Realiza/registra procedimento de resolução de discrepância ABO / Rh III As discrepâncias tem que ser resolvidas antes da liberação das bolsas. No sistema ABO é quando a classificação Direta e a Reversa não combinam.

O A Discrepância de classificação

6.4 Realiza/registra a determinação do tipo RhD a cada doação. Método: III 6.4.1 Realiza/registra pesquisa de D fraco e/ou categoria, quando necessário III 6.4.2 Utilizam na rotina os soros para anti-d e controle de Rh do mesmo fabricante Método: III Anti soro anti- Rh(D) Controle Rh

Rh(D) Normal Rh(D) Fraco Rh(D) parcial Rh(D) parcial fraco Normal Normal Variante Variante Normal Reduzido Normal Reduzido Legenda: Epítopo Antígeno Variantes do Antígeno D

Pesquisa de D fraco é realizado quando o teste de RhD der resultado negativo na fase de TA. Deve ser realizado através de incubação a 37 C. O controle Rh deve ser realizado junto, e deve ser sempre negativo. Controle Positivo é discrepância e neste caso o fenótipo D é indeterminado. D parcial ou categoria é uma variante de D que apresenta uma alteração na expressão do antígeno D. O resultado para definir pode ser por anti-soros anti-d monoclonais. O uso de dois reagente anti-d, de dois clones diferentes é importante para se fazer a suspeita de D parcial. Resultado de certeza é por biologia molecular.

6.6 Realiza/registra pesquisa anticorpos irregulares a cada doação Método: III 6.6.1 Identificação e registro de anticorpos irregulares (caso se aplique) Método: INF Anticorpos irregulares são todos os anticorpos outros que não os anti-a e anti-b, naturais, encontrados no plasma. Podem ter significado clinico Podem causar reação transfusional imediata ou tardia Diminuem a sobrevida da hemácia transfundida Devem ser realizados no doador e no receptor de sangue, antes da transfusão. O teste deve incluir uma fase de AGH.

Princípio do teste PAI realizado em três fases: 1 - Temperatura Ambiente (TA) 2 - Fase de incubação a 37 C 3 - Fase de AGH

Soros Anti Globulina Humana AGH Soro de Coombs Hemácias Reagentes para PAI

Regentes de coombs e controle de coombs

Controle Interno da PAI

Controle PAI positivo

6.7 Protocolos dos testes imuno-hematológicos com nome do fabricante e reagente, número do lote e prazo de validade III

6.8 Insumos utilizados registrados e/ou autorizados pelo órgão de saúde competente, dentro do prazo de validade e armazenados de acordo com a especificação do fabricante III Bula, instrução de uso e validade

6.10 Utiliza anti-soros monoclonais INF 6.11 Utiliza anti-soros policlonais INF Monoclonais: a partir de um único clone de linfócito B - Produzidos por processo industrial, com células humanas e de animais fusionadas. - Mais potentes, mais específicos, altos títulos. Policlonais: a partir de vários clones de linfócitos B - Produzidos a partir de sensibilização de humanos. - Precisa de voluntários para produzir o anticorpo. - Deve ser coletado, processado e purificado industrialmente - Difícil de encontrar comercialmente.

Reagentes: Monoclonal X Policlonal Ag Ag Antígeno cels B Anticorpos Monoclonal Policlonal

6.13 Controle de qualidade lote a lote dos reagentes utilizados, antes do uso, a fim de comprovar se os mesmos estão dentro do padrão estabelecido pelo fabricante. III

6.14 Resultados dos testes imuno-hematológicos arquivados de forma a manter a sua integridade pelo período proposto na legislação vigente III Pode ser arquivo eletrônico.

Período mínimo de 20 anos. Pode ser arquivo com cópia física.

6.15 Realiza/registra CQI Controle de Qualidade Interno III 6.15.1 Adota/registra medidas corretivas quando identificadas não conformidades. III Registro dos controles de qualidade interno diário dos reagentes

6.16 Participa / registra de AEQ Avaliação Externa da Qualidade Programa: II

6.16.1 Adota/registra medidas corretivas quando identificadas não conformidades. III

6.17 Resultados dos testes imuno-hematológicos interfaciados ao sistema informatizado do serviço INF 6.17.1 Na ausência do interfaciamento, ou outra forma eletrônica devidamente validada, ao liberar os resultados estes são conferidos por mais de uma pessoa. III

6.17 Resultados dos testes imuno-hematológicos interfaciados ao sistema informatizado do serviço INF 6.17.1 Na ausência do interfaciamento, ou outra forma eletrônica devidamente validada, ao liberar os resultados estes são conferidos por mais de uma pessoa. III

6.18 Calibração de pipetas e termômetros dentro do prazo de validade II Pipetas automáticas Monocanal

OBRIGADO rodolfo@fns.hemosc.org.br

OBRIGADO! imunohematologia@fns.hemosc.org.br