AVALIAÇÃO ANTIBIOFILME DO ÓLEO ESSENCIAL Cymbopogon flexuosos FRENTE AO BIOFILME DE Staphylococcus aureus V. Schuh 1, A. F. Milezzi 2, T. A. Penno 1, S.M. Da Silveira 1, Janaina Schuh 1 1-Centro de Ciência e Tecnologia de Alimentos - CCTA Instituto Federal Catarinense, Rodovia SC 283, km 08 CEP:89703-720 Concórdia SC Brasil, Fone (55-49)3441-4819 e-mails: (vanessa_pzo@hotmail.com/ pennotaci@gmail.com/ sheila.silveira@ifc-concordia.edu.br/ janaschuh96@gmail.com) 2 - Instituto Federal Catarinense, Rodovia SC 283, km 08 CEP:89703-720 Concórdia SC Brasil, Fone (55-49)3441-4800 e-mail: (alessandra.millezi@ifc-concordia.edu.br) RESUMO Os óleos essenciais apresentam-se como alternativas seguras para remover biofilmes formados em superfícies de processamento de alimentos. Os biofilmes apresentam-se como um mecanismo de resistência das bactérias, que são de difícil remoção quando aderidas à superfície. A ação antibiofilme foi testada usando óleo essencial de Cymbopogon flexuosos na concentração de 0,78% na formação de biofilme pela bactéria Staphylococcus aureus. Os resultados obtidos mostram que o óleo essencial foi eficiente na minimização das células viáveis (UFC), apresentando redução significativa (P<0,05), sendo esta de 1,3 log10 UFC.cm -2. Isso mostra que o óleo essencial pode ser usado no controle de biofilmes e suas potencialidades devem ser estudadas frente a outras concentrações e microrganismos. ABSTRACT Essential oils are presented as safe alternatives to remove biofilms on food processing surfaces. Biofilms are shown as a resistance mechanism of bacteria that are difficult to remove when adhered to the surface. The antibiofilm action was tested using essential oil of Cymbopogon flexuosos at a concentration of 0.78% in biofilm formation by Staphylococcus aureus. The results show that the essential oil was effective in minimizing the viable cells (CFU), with a significant reduction (P <0.05), which is 1,3 log10 UFC.cm -2. This shows that the essential oil can be used for controlling biofilms and their potential should be studied against other concentrations and microorganisms. PALAVRAS-CHAVE: biofilme, Staphylococcus aureus, óleo essencial. KEYWORDS: biofilm, Staphylococcus aureus, essential oil. 1. INTRODUÇÃO Um biofilme pode ser definido como comunidade de microrganismos que ao se aderirem a uma superfície, são capazes de produzir substâncias poliméricas extracelulares, ou seja, exopolissacarídeo, que protege as bactérias contra agentes antimicrobianos, permitindo sua sobrevivência em ambientes hostis (GEORGE et al.,2005). A habilidade das bactérias em
formar biofilme é uma importante característica de virulência (DONELLI; GUAGLIANONE, 2004). O biofilme pode ser formado por bactérias deteriorantes ou patogênicas, sendo que algumas possuem maior tendência para formá-los, dentre elas citam se os gêneros Staphylococcus, Pseudomonas, Alcaligenes, Enterobacter e Bacillus (LINDAY; HOLAY, 2006). Deste modo, a detecção de cepas produtoras de biofilme é de grande importância para o estabelecimento de medidas de controle, pois falhas no processo de higienização permitem que resíduos aderidos aos equipamentos e superfícies sejam transformados em possíveis fontes de contaminação na indústria de alimentos (PARIZZI et al., 2004; MACEDO, 2016). Vários tipos de microrganismos patogênicos podem ser encontrados em alimentos, dentre eles destaca-se a espécie S. aureus, cuja importância epidemiológica nas DTA s decorre em virtude de sua alta prevalência e do risco da produção de toxinas pré-formadas (ZECCONI; HANG, 2000), que após serem produzidas e liberadas pela bactéria, quando presentes no alimento, são multiplicadas, representando um fator de risco para a saúde pública. De acordo com a Internacional Standard Organization (ISO), os óleos essenciais são definidos como produtos obtidos de partes de plantas mediante destilação por arraste com vapor de água. De maneira geral, são misturas complexas de substâncias voláteis lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas (SANTOS, 2007). O óleo essencial do gênero Cymbopogon, pertence a família Poaceae (MING et al. 1996). Dentro do gênero Cymbopogon spp. podemos destacar as espécies C. citratus, C. flexuosus e C. martinii. O representante C. flexuosus, comercialmente é conhecido como lemongrass e popularmente como capim-limão da Índia Oriental (MAY et al. 2008), possui atividade antimicrobiana e antibiofilme relatado no estudo de Adukwu et al.(2012), frente a diferentes cepas de Staphylococcus aureus. O uso de óleos essências em alimentos vem ganhando importância por apresentar componentes naturais, evitando assim, o uso de aditivos sintéticos, deterioração, oxidações e o ataque de microrganismos (OUSSALAH et al., 2006) sendo uma nova alternativa para aplicação na indústria no controle de crescimento de biofilmes. Entretanto, seu uso é não muito comum pois o óleo essencial possui um valor comercial elevado, devido ao baixo rendimento na extração. É preciso também cuidado ao utilizá-lo, pois concentrações elevadas podem influenciar no sabor e odor dos produtos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a ação antibiofilme do óleo essencial de Cymbopogon flexuosos contra a formação de biofilme simples de Staphylococcus aureus. 2. MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram realizados no Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Instituto Federal Catarinense- Campus Concórdia, nos meses de fevereiro a março de 2016. A bactéria utilizada neste estudo foi Staphylococcus aureus ATCC 29213. Os inóculos foram preparados a partir da cultura ativa da bactéria, e posteriormente inoculados em caldo TSB com Tween 80. A concentração de óleo essencial utilizado foi de 0,78%, baseando-se em estudos anteriores (MILLEZI, 2013). Para a formação de biofilme foi realizada a padronização dos inóculos em aproximadamente 10 7 UFC/mL, por meio da curva de calibração. Os biofilmes foram inoculados em microplacas de polipropileno de 96 cavidades e incubados em shaker orbital (Tecnal, Brasil) a 37 ºC, agitação de 80 rpm, contendo os tratamentos com óleo a 0,78 % e o controle positivo contendo apenas a suspensão bacteriana em meio TSB, sem o óleo essencial (MILLEZI et al., 2012).
Após 18-24 horas, a biomassa dos biofilmes foi quantificada pela análise de Cristal Violeta (CV), de acordo com STEPANOVIC et al., (2000). O conteúdo da microplaca foi descartado, e em seguida na mesma foi inserido 200 µl de água destilada estéril nos poços para remover o excesso de células. Posteriormente, as células aderidas foram fixadas com metanol 99% (15 min), coradas com cristal violeta (5 min), lavadas em água e, por último, foi adicionado ácido acético 33% para realizar a leitura em 630 nm em espectofotômetro Elisa (Biotek, USA). Na quantificação das células viáveis (UFC), o conteúdo da microplaca foi descartado, e nestes poços inseriu-se 200 µl de água destilada estéril. A microplaca foi colocada por 6 minutos ao banho ultrasson (Unique, Brasil). Após, foi realizada a diluição seriada das amostras e plaqueamento em superfície pela técnica de microgota (10 µl) em Ágar Triptona de Soja TSA. Após 24 horas de incubação foi realizada a contagem das células viáveis em biofilmes e o cálculo da microgota. Para análise estatística utilizou-se ANOVA (Bonferroni), considerando significativo P<0,05. Os dados foram analisados usando o software Prisma (GrafPad Software, San Diego, CA). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO A verificação da composição microbiana de biofilmes, presentes em indústrias de alimentos, tem sido averiguada em diversos estudos. Os estudos revelam que os biofilmes formados são constituídos por várias espécies de microrganismos, as quais podem variar dependendo, dos fatores intrínsecos e extrínsecos do ambiente em que se encontram. (MAROUANI-GADRI et al., 2009). Segundo Andrade et al. (1998), para se considerar um biofilme, é necessário um número mínimo de 10 7 UFC/cm 2, enquanto Ronner, Wong (1993) e Wirtanen et al. (1996) consideram como biofilme um número de células aderidas de 10 5 e 10 3 UFC/cm 2, respectivamente. É importante mencionar que, mesmo que o número de células microbianas aderidas à superfície seja baixo, a formação do biofilme maduro implica em risco de contaminação microbiológica do alimento a partir de microrganismos sésseis presentes na superfície. No experimento realizado, isso demostra que houve um bom desenvolvimento do biofilme, sendo este de 10 7 UFC/cm 2. Ao utilizar o óleo essencial, a Figura 1 demonstra que houve redução significativa P<0,05), na quantificação das células viáveis, sendo esta de 1,3 log10 UFC.cm -2, quando comparado com o controle positivo. Figura 1- Quantificação de células viáveis (UFC)
Os valores são referentes à média de três repetições e as barras indicam o desvio padrão. *P < 0,001 de acordo com ANOVA. Estudos realizados por Millezi et al.(2012), demonstram também uma baixa redução do S.aureus, quando em co-cultivo com E.coli, de 1,52 e 1,75 log UFC/cm 2 através dos óleos essenciais de Citrus limonia Osbeck e Cymbopogon nardus (citronela), respectivamente. Entretanto, em estudo realizado por Knowles et al. (2005) ao realizarem uma avaliação da ação antimicrobiana do carvacol (um componente ativo do orégano) em diferentes estágios do biofilme multiespécie desenvolvido por S. aureus e S. Thyphimurium, estes observaram uma redução de 2 Log UFC para o biofilme de S. aureus e 3 Log UFC do biofilme de S. Typhimurium, quando comparado com o controle. Com relação a biomassa formada, não houve redução significativa, de acordo com a Figura 2. Figura 2 Quantificação de biomassa Os valores são referentes à média de três repetições e as barras indicam o desvio padrão. De acordo com Millezi et al. (2016), ao avaliar a ação de óleos essenciais no controle de Escherichia coli e Staphylococcus aureus, utilizaram óleo essencial de Palmarosa (Cymbopogonon martini) e de canela (Cinnamomum zeylanicum) bem como os seus principais compostos, mostraram uma maior capacidade de inibir a formação de biomassa superior a 62%, enquanto que ao aplicar o óleo de Palmarosa na concentração de 0,96% apresentaram a maior redução (86,04%). 4. CONCLUSÃO Com a utilização do óleo essencial de Cymbopogon flexusos 0,78% foi possível reduzir a população de células viáveis do biofilme de Staphylococcus aureus, sendo uma alternativa aos sanificantes químicos. AGRADECIMENTOS Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento do projeto.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adukwu, E. C.; Allen, S. C. H.; Phillips, C. A. (2012). The anti-biofilm activity of lemongrass (Cymbopogon flexuosus) and grapefruit (Citrus paradisi) essential oils against five strains of Staphylococcus aureus. Journal Applied Microbiology. [Epub ahead of print]. Andrade, N. J.; Bridgeman, T. A.; Zottola, E. A. ( 1998). Bacteriocidal activity of sanitizers against Enterococcus faeciumattached to stainless steel as determined by plate count and impedance methods. J Food Prot. 1998; 61: 833-8. Donelli, G.; Guaglianone, E. (2004). Emerging role of Enterococcus spp. in catheter related infections: biofilm formation and novel mechanisms of antibiotic resistance. J. Vasc. Access 5:3-9. George, S.; Kishen, A.; Song, K.P. (2005). The role of environmental changes on monospecies biofilm formation on root canal wall by Enterococcus faecalis. J. Endod. 31:867-72. Knowles, J. R.; Roller, S.; Murray, D. B.; Naidu, A.S. Antimicrobial action of carvacrol at different stages of dual-species biofilm development by Sthaphylococcus aureus and Salmonella eterica sorovar Typhimurium. Applied and Environmental microbiology, Washington, v. 71, n. 2, p. 797 803, Feb. 2005. Macedo, J. A. B. MILKNET. Biofilmes Bacterianos: Uma Preocupação Para a Indústria de Alimentos. 18 de julho de 2006. Disponível em: <www.milknet.com.br>. Acesso em: 29 de agosto de 2016. Marouani-gadri, N.; Augier, G.; Carpentier, B. (2009). Characterization of bacterial strains isolated from a beef-processing plant following cleaning and disinfection - Influence of isolated strains on biofilm formation by Sakaï and EDL 933 E. coli O157:H7. Int J Food Microbiol, 133 (1/2): 62-7. May, A.; Bovi, A. O.; Maia, N. B.; Moraes, A. R. A.; Pinheiro, M. Q.; Mario, M. (2008). Influência do intervalo entre cortes sobre a produção de biomassa de duas espécies de capim limão. Horticultura Brasileira, v. 26, p. 379-382. Millezi, A. F., Cardoso, M. G., Alves, E., Piccoli, R. H. (2013). Reduction of Aeromonas hidrophyla biofilm on stainless stell surface by essential oils. Brazillian Journal of Microbiology, São Paulo, (in press). Millezi, F. M.; Pereira, M. O.; Batista, N. N.; Camargos, N.; Auad, I.; Cardoso, M. D. G.; Piccoli, R. H.(2012). Susceptibility of monospecies and dual-species biofilms of Staphylococcus aureus and Escherichia coli to essential oils. Journal of Food Safety, v. 32,n. 3, p. 351 359. Millezi, F. M.; Picolli, R. H.; Oliveira, J. M.; Pereira, M. O. (2016). Anti-biofim and antibacterial effect of essential oils and their major compounds, Journal of Essential Oil Bearing Plants, v. 19 (3), p. 624 631. Ming, L. C. (1996). Yield of essential oil and citral content in different parts of lemongrass leaves Cymbopogon citratus (DC.) Stapf - Poaceae. Acta Horticulturae, v. 426, n.1, p. 555-9. Oussalah, M.; Caillet, S.; Saucier, L.; Lacroix, M. (2006). Inhibitory effects of selected plant essential oils on the growth of four pathogenic bacteria: E. coli O157:H7, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus andlisteria monocytogenes. Food Control, Oxford, 18: 414 420. Parizzi, S. Q. F.; Andrade, N. J. A.; Silva, C. A. S.; Soares, N. F. F.; Silva, E. A. M. (2004). Bacterial adherence to different inert surfaces evaluated by epifluorescence microscopy and plate count method. Brazilian Archives of Biology Technology, vol.47, no.1, p.77-83. ISSN 1516-8913. 2004. Ronner, A. B.; Wong, A. C. L. (1993). Biofilm development and sanitizer inactivation of Listeria monocytogenes andsalmonella typhimurium on stainless-steel and buna -N rubber. J Food Prot., 56: 750 8.
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