Dissertação de Mestrado

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIODIVERSIDADE, EVOLUÇÃO E MEIO AMBIENTE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DE BIOMAS TROPICAIS Dissertação de Mestrado Riqueza e composição de espécies em comunidades de girinos em lagoas permanentes e temporárias e comparação entre metodologias de identificação dessas formas de vida Ceres Olívia Leão Ouro Preto, setembro de 2017

2 Riqueza e composição de espécies em comunidades de girinos em lagoas permanentes e temporárias e comparação entre metodologias de identificação dessas formas de vida Autora: Ceres Olívia Leão Orientação: Prof.ª Dra. Maria Rita Silvério Pires Coorientação: Prof. Dr. Danon Clemes Cardoso Coorientação: Prof.ª Dra. Eneida Maria Eskinazi Sant anna Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia de Biomas Tropicais, do Instituto de Ciências Exatas e Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ecologia. Ouro Preto, setembro de 2017

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5 AGRADECIMENTOS Com toda certeza alguns poucos fios me seguraram e fizeram-me seguir em frente nessa saga! Cada fio significa uma pessoa maravilhosa que me acompanhou durante este tempo. Agradeço à minha mãe, exemplo de mulher forte que, além de me aguentar a vida inteira, sempre me apoiou e me ensinou a engolir o choro e tocar a vida. Agradeço à professora Maria Rita pelas oportunidades, pelos ensinamentos, parceria durante todos esses anos, pela paciência, bom humor e amizade! Agradeço imensamente aos meus coorientadores, Danon e Eneida. Principalmente ao Danon que chegou ao final, mas fez acontecer este trabalho. Muito obrigada! Aos funcionários do setor de transporte da UFOP, que nunca deixou de nos atender, mesmo tendo que enfrentar chuvas e atoleiros. Em especial ao querido Reinaldo, que além de motorista, nos apresentou várias lagoas, dava dicas de campo, e ainda era o melhor caçador de girinos da equipe. Ao Alberto do IEF, por ter nos ajudado com as lagoas e informações das localidades. Ao Tiago Pezzuti e a Dani Fonseca da UFMG, que me ajudaram demais a conhecer esse mundo novo dos girinólogos. Ao Dr. Gunther Köhler, do Instituto de Pesquisa Senckenberg, pelo sequenciamento das amostras. Às IC s lindas Shay, Débora e Gabi pela animação, interesse e compromisso em ajudar no que foi preciso. Ao Cláudio, pelas ajudas em campo e análises estatísticas. Aos demais colegas de laboratório, à Paula Maria por ter abraçado o LZV com seu maravilhoso e essencial trabalho, e por ter se tornado uma grande amiga! Aos amigos queridos! Aos companheiros de casa, em especial Alice, Virgínia e Cortiço! À UFOP e ao programa de pós-graduação em Ecologia de Biomas Tropicais. Ao Rubens maravilhoso, sempre solícito, ajudando em todas as burocracias. E aos membros da banca pela disponibilidade, leitura e considerações. Obrigada!

6 ÍNDICE RESUMO... 3 INTRODUÇÃO... 4 METODOLOGIA... 7 Sítios amostrais... 7 Lagoas permanentes... 7 Lagoas temporárias:... 8 Métodos de coleta Métodos de Identificação de espécies e validação taxonômica RESULTADOS I - Estudo da comunidade de girinos em lagoas permanentes e temporárias Riqueza e composição de espécies Guildas tróficas em comunidades de girinos II- Validação taxonômica Identificação com base em morfologia Identificação por análise de similaridade molecular Análise de divergência intraespecífica DISCUSSÃO REFERÊNCIAS Anexo 1: Lagoas localizadas no Quadrilátero Ferrífero, onde foram realizadas coletas de girinos para estudo de identificação taxonômica e composição de comunidades... 32

7 Lista de tabelas Tabela 1. Composição de espécies de anuros, coletados durante fase larval, em lagoas temporárias e permanentes, na porção sul da Cadeia do Espinhaço Tabela 2. Comparação entre as identificações de girinos por meio de morfologia com as obtidas por análise de similaridade molecular

8 Lista de figuras Figura 1. Padrão de distribuição de guildas entre lagoas permanentes e temporárias em comunidades de girinos ao sul da Cadeia do Espinhaço Figura 2. Espécimes de girinos coletados em lagoas na porção sul da Cadeia do Espinhaço, para os quais não foi possível a identificação por meio de chaves taxonômicas baseadas em morfologia Figura 3. Representação gráfica das distâncias genéticas, obtidas pela análise do gene 16S, para girinos coletados em lagoas localizadas na porção sul da Cadeia do Espinhaço Figura 4. Indivíduos agrupados pela análise de divergência intraespecífica Figura 5. Indivíduos que apresentaram valor de divergência nucleotídica maior que o valor limiar intraespecífico Figura 6. Indivíduos identificados como Scinax fuscovarius pela análise de similaridade molecular

9 RESUMO A documentação do declínio de populações de anfíbios vem crescendo e muitas espécies foram e estão sendo extintas antes de serem conhecidas. O estudo das formas larvais de anuros acrescenta informações sobre distribuição geográfica e biologia para muitas espécies. Contudo, são frequentes os problemas de identificação para essa fase. O presente trabalho teve como objetivos fazer um levantamento da anurofauna de lagoas montanas, e comparar o uso de metodologias de identificações dos espécimes na fase larval. Para tanto, foram realizadas coletas em dez lagoas temporárias e permanentes, entre os meses de novembro de 2016 e fevereiro de Para as identificações dos espécimes utilizaram-se três métodos, chaves taxonômicas baseadas em morfologia externa, análise de similaridade molecular, e DNA Barcode, usando o marcador molecular 16S. Os girinos coletados foram agrupados em 90 lotes, correspondentes a cada morfotipo de cada localidade, em cada evento de coleta. Dentre os 90 lotes foram encontrados 33 morfotipos, posteriormente identificados. Foram registradas 17 espécies de anuros, pertencentes a cinco famílias. Para guildas bentônicas, 9 espécies foram coletadas e 6 foram registradas exclusivamente em lagoas permanentes. De 8 espécies nectônicas encontradas, quatro foram registradas exclusivamente em lagoas temporárias. As identificações por meio de chave taxonômica resultaram em 15 espécies, sendo que 6 indivíduos não puderam ser identificados com segurança. Vinte e nove amostras foram sequenciadas e, as análises por similaridade molecular indicaram 15 espécies, sendo que, 13 confirmaram as identificações por morfologia, e 10 foram atribuídas a outro táxon. O DNA Barcode indicou a existência de 16 espécies entre as amostras. O estudo apontou e discutiu possíveis inconsistências para métodos de identificação de girinos. O DNA Barcode acrescentou informações sobre a biodiversidade local. Dessa forma, reforçamos a importância da taxonomia integrativa para fornecer informações mais consistentes para avaliarmos as espécies e contribuirmos para estudos de conservação. Palavras-chave: Identificação de girinos, 16S, DNA Barcode, taxonomia integrativa. 3

10 INTRODUÇÃO A documentação do declínio de populações de anfíbios e o aumento do número de espécies em categorias de risco vêm crescendo nas últimas décadas (Stuart et al., 2004; IUCN, 2017). Estima-se que muitas espécies foram e estão sendo extintas antes de serem conhecidas, principalmente nos trópicos, onde a diversidade é alta e as informações são escassas para muitos grupos (Stuart et al., 2008). Uma espécie com ampla distribuição, por exemplo, que apresenta variações populacionais, pode representar, na verdade, um complexo de espécies crípticas (Hebert, 2004a). Dessa forma, a diversidade real pode estar sendo subestimada e, muitas espécies negligenciadas, não sendo adotadas medidas conservacionistas quando elas são necessárias (Collen et al., 2009; Köhler et al., 2005) e obscurecendo padrões históricos, biogeográficos e filogenéticos (e. g,: Vacher et al., 2017). Ainda existem lacunas quanto ao conhecimento da taxonomia e ecologia de muitos táxons de anfíbios anuros. No Brasil, por exemplo, mais de 14% das espécies de anfíbios descritas até o momento são classificadas na categoria Dados Insuficientes (ICMBio, 2014; Segalla et al., 2016). Nesse cenário, é possível também que existam espécies desconhecidas devido a identificações taxonômicas equivocadas e dificuldades de delimitações de espécies amplamente distribuídas. A maioria das espécies de anuros apresenta modo reprodutivo com girinos exotróficos, ou seja, dependem exclusivamente do corpo d água até sua completa metamorfose (Duellman & Trueb 1994). Sendo assim, diversas variáveis desses ambientes tem efeito direto na riqueza de espécies que os colonizam, tais como, a complexidade estrutural do ambiente (Altig & McDiarmid 1999), a presença de predadores (Buskirk & Yurewicz 1998) e as características físicas e químicas da água, pois exercem influência sobre o desenvolvimento e a sobrevivência dos girinos (Babbitt 2005; Both et al. 2009). Além disso, a quantidade de vegetação influencia a ocorrência de girinos com modos alimentares diferenciados, ou guildas tróficas (Rossa-Feres et al. 2004) e o hidroperíodo, ou seja, o risco de dessecação em ambientes temporários, acelera o tempo de desenvolvimento das larvas (Crump 1989; Buskirk & Yurewicz 1998). Registros de espécies de anfíbios anuros são realizados, em sua maioria, por meio de coletas e acompanhamentos de machos adultos que vocalizam no período reprodutivo. No entanto, dificuldades de acesso aos nichos de vocalização, ou períodos reprodutivos 4

11 explosivos, podem tornar as amostragens insuficientes (Madalozzo et al., 2017), contribuindo para a inflação de espécies em categoria de dados deficientes. Dessa forma, o estudo das formas larvais constitui uma alternativa para a complementação das informações sobre distribuição geográfica e biologia para muitas espécies. Os girinos permanecem no ambiente aquático por um período longo, são numerosos, em geral, e fácil de serem coletados. O estudo dessa fase da vida dos anuros amplia as possibilidades para compreender as variáveis que influenciam a ecologia das espécies e padrões de ocorrência (Altig & McDiarmid, 1999). McDiarmid e Altig (1999) concentraram esforços para levantar as principais informações sobre ecologia, morfologia, fisiologia e comportamento exclusivos da fase larval dos anuros. Esses autores ressaltam que o aumento das pesquisas relativas à diversidade de girinos vem acompanhado dos problemas de identificação de espécies nessa fase. Esses problemas são decorrentes de publicações de descrições pouco detalhadas, espécimes mal armazenados em coleções, poucos pesquisadores na área e a alta plasticidade fenotípica apresentada por muitas espécies (e.g.: Relyea & Auld, 2005). Além disso, a falta de uniformidade dos termos utilizados para caracterizar os girinos é também um fator que dificulta o trabalho comparativo (Altig, 2007). As dificuldades de identificação das larvas de anuros são reconhecidas desde os primeiros trabalhos na década de 1950 (Orton, 1953). Apesar de grandes avanços relativos à padronização da nomenclatura (e.g.: Altig, 2007), definição de fases (e.g.: Gosner 1960) e uso de tecnologias modernas para descrições morfológicas (e. g.: Alcalde et al., 2011), as referências ainda são escassas quando comparadas com a diversidade de espécies conhecida a partir da fase adulta. Ou seja, é ainda muito difícil reunir informações sobre girinos mesmo para regiões relativamente bem estudadas, como o sudeste brasileiro (Andrade et al., 2007). Para a fauna brasileira, são disponíveis na literatura três chaves taxonômicas para girinos (Hero, 1990; Rossa-Feres & Nomura, 2006; Machado & Maltchik, 2007) e duas dissertações sobre taxonomia das formas larvais (Pezzuti, 2011; Gonçalves, 2014). Dentre essas referências, duas são focadas para a fauna da região sudeste, Rossa-Feres & Nomura (2006) e Pezzuti (2011). Descrições exclusivamente baseadas em dados morfológicos podem gerar incertezas taxonômicas (Bueno-Silva, 2012) e a tendência atual aponta para um grande número de trabalhos, nos quais são empregadas técnicas moleculares para esse fim 5

12 (Inger et al., 2006; Vieites et al., 2009; Wiens et al., 2010; Thomé et al., 2012; Brusquetti et al., 2014; Dias et al., 2017). Essa tendência é impulsionada pelo fato de que o uso dessas técnicas vem se tornando mais acessível e, assim, elas vem sendo amplamente utilizadas na sistemática e filogenia de anuros (Faivovich et al., 2005; de Sá, 2014; Pyron & Wiens, 2011). A análise molecular facilita e acelera o processo de delimitação de espécies (Köhler, 2007). Além disso, permite a identificação de entidades distintas muito similares em áreas de ocorrência próximas, o que demandaria estudos ecológicos detalhados e de longo prazo para serem detectadas (Herbert, 2004b). Entre indivíduos de uma mesma espécie existe um limiar de conservação genética maior do que entre indivíduos de espécies diferentes (Hebert, 2004b). Essa abordagem incentivou o uso do sequenciamento genético como um código de barras, o DNA barcode, para análises taxonômicas por meio da similaridade de sequências nucleotídicas (Hebert, 2003). O método de sequenciamento de fragmentos do DNA oferece boa resolução para caracterizar geneticamente os indivíduos (Dang et al., 2015; Schulze et al., 2015; Chambers & Hebert, 2016). O fragmento mais utilizado atualmente é o citocromo oxidase I (COI). No entanto, devido às dificuldades de se encontrar os primers adequados para diversos grupos, alguns marcadores alternativos são também utilizados (Coleman, 2009; Vences et al., 2005a). Em anfíbios o gene 16S é o marcador molecular com maior sucesso de amplificação e é amplamente utilizado para trabalhos taxonômicos e filogenéticos (Frost et al., 2006; Faivovich et al., 2005), havendo uma maior quantidade de dados disponíveis para comparações. O presente trabalho teve dois objetivos distintos e complementares, que foram: (I) analisar riqueza, composição e guildas tróficas em comunidades de girinos que ocupam ambientes lacustres lênticos, permanentes e temporários; e, (II) considerando a importância de integrar métodos taxonômicos para aproximar ao máximo da identificação correta das espécies por meio de suas formas larvais, comparar as identificações dos espécimes por meio dos três método mais utilizados, ou seja, o uso de chaves taxonômicas baseadas em morfologia externa, a análise de similaridade molecular, e o DNA Barcode, usando o marcador molecular 16S. 6

13 METODOLOGIA Sítios amostrais As amostragens foram realizadas em dez lagoas, cinco temporárias e cinco permanentes (Anexo 1), incluídas na região do Quadrilátero Ferrífero, em Minas Gerais, extremo sul da Serra do Espinhaço. O Quadrilátero Ferrífero está inserido na transição dos dois hotspots brasileiros, a Mata Atlântica e o Cerrado (sensu Ab Saber, 1977). Essa região abriga uma ampla gama de fitofisionomias e corpos d água, incluindo as cabeceiras de importantes rios (Jacobi & Carmo, 2008). Lagoas permanentes Lagoa do Virgílio: Lagoa natural, localizada no distrito de Santa Rita, em Ouro Preto - MG. A lagoa ocorre em uma área de vegetação preservada ilhada em meio às inúmeras plantações de eucalipto, que é uma atividade econômica importante do distrito. Não existem registros de estudos ecológicos anteriores nessa área. Lagoa do Gorila: Lagoa natural, formada pela exposição do lençol freático. Localizada entre os municípios de Ouro Preto e Ouro Branco (20º28 11 S 43º36 0 W). A Lagoa do Gorila pode abrigar uma riqueza de espécies subestimada. Estudos já realizados na lagoa encontraram 11 espécies de anfíbios (São Pedro & Feio, 2011), e 35 espécies de zooplâncton (Brito, 2016). Durante os trabalhos de campo encontramos pequenos roedores que usavam as margens alagadas para se abrigarem, mas não existem outros registros da fauna ou flora local. Uma das margens da lagoa está localizada aos pés de uma das elevações da Serra de Itatiaia, conhecida como Gorila. Nas outras margens, a lagoa está limitada pela estrada que liga os municípios de Ouro Branco e Ouro Preto, por uma grande área de erosões e, ainda, uma recente moradia foi construída em suas proximidades. Assim, a lagoa sofre efeito de diferentes tipos de pressões que podem afetar negativamente a biodiversidade do local. Uma das formas de auxiliar a conservação da Lagoa do Gorila pode ser a conclusão do Plano de Manejo e Zoneamento do Monumento Natural Estadual de Itatiaia 7

14 que, provavelmente, incluirá a área como parte da zona de amortecimento da unidade de conservação. Lagoa do Tesoureiro: Lagoa natural, localizada no Parque Estadual do Itacolomi/PEIT, município de Ouro Preto MG. A lagoa é formada pelo represamento das águas de um córrego. A jusante do córrego existe mais dois represamentos, sendo que, um deles, está em uma das entradas do PEIT, conhecida como casa do Tesoureiro. Lagoa do Nonô: Lagoa artificial, localizada no distrito de Santa Rita, município de Ouro Preto MG. A lagoa fica em uma pequena propriedade particular e é usada para uso de dessedentação animal. Lagoa da Caveira: pequena lagoa natural formada na base de um afloramento rochoso, adjacente a uma área de solo permanentemente encharcado. A lagoa está localizada no município de Ouro Branco MG, no entorno do Parque Estadual Serra do Ouro Branco. Lagoas temporárias: Lagoa dos Coutos: Lagoa natural, localizada em uma área de afloramento ferruginoso na Serra do Gandarela. A lagoa está situada no município de Barão de Cocais-MG, e faz parte da Bacia do Rio Doce (19 59'6.54"S 43 33'4.75"W). Por ser uma lagoa rasa, temporária, de altitude e ocorrer em campos ferruginosos, a Lagoa dos Coutos é um ambiente raro e de potencial relevância para a biodiversidade (Brito, 2016; Moreira et al., 2015). Em 2015, foi descoberta uma espécie de cladócero que ocorria, até então, apenas no Cerrado brasileiro, sendo o terceiro registro da espécie no país (Moreira et al., 2015). Apesar disso, os estudos nessa lagoa ainda são recentes e escassos. Outro fator que faz da Lagoa dos Coutos um ambiente especial, é sua inserção na Serra do Gandarela. A Serra do Gandarela está entre duas importantes bacias de Minas Gerais, a Bacia do Rio Doce/Rio Piracicaba e a do São Francisco/Rio das Velhas. A topografia e o tipo de solo da serra permite a reserva de grande volume de água, o que transforma a região em 8

15 um aquífero, sendo o manancial mais significativo para o abastecimento de água da região metropolitana de BH (ICMBio, 2010). Além da relevância hídrica, as paisagens de campo rupestre sobre cangas ferruginosas abriga uma rica e endêmica biodiversidade e apresenta um potencial turístico para a região (ICMBio, 2010). Recentemente, por força de ação popular foi proposta a criação do Parque Nacional da Serra do Gandarela e uma Reserva de Desenvolvimento Sustentável, pelo ICMBio. No entanto, a criação do Parque foi dificultada por força de interesses de exploração de grandes empresas de mineração. O projeto inicial do Parque da Gandarela teve seu contorno redefinido por influência de empresas mineradoras. Dessa forma, importantes áreas para a conservação de recursos naturais ficaram fora da área de proteção da unidade. Um dos projetos de mineração na região é a Mina Apolo, da Vale S.A. projetada para a retirada de minério de uma extensa área da serra, onde está situada uma das duas maiores áreas de canga ferruginosa e um complexo de lagoas naturais, entre elas, a Lagoa dos Coutos. Além da lagoa, parte do Ribeirão da Prata também ficou fora dos limites de proteção do parque, o que pode comprometer o abastecimento de água de milhares de pessoas da região. Poça do Gorila: Poça natural, adjacente, mas não conectada, à lagoa do Gorila. Localizada entre os municípios de Ouro Preto e Ouro Branco ( S W). Poça da Caveira: Pequeno represamento natural da água da chuva na cavidade de um afloramento rochoso. Localizada no município de Ouro Branco-MG. A região está próxima dos limites do Parque Estadual da Serra do Ouro Branco. Lagoa do Walace: Lagoa natural, localizada no distrito de Itatiaia, Ouro Branco - MG em área particular, próxima à Cachoeira de Itatiaia. A região é protegida pelo Monumento Natural Estadual de Itatiaia e a propriedade abriga uma pousada destinada ao turismo ecológico. Estudos na lagoa podem incentivar ainda mais o turismo local e gerar dados que justificam e confirmam a importância de conservação da área. Lagoa Seca: Lagoa natural, localizada no Parque Estadual do Itacolomi, município de Ouro Preto ( S W). Essa lagoa ocorre em meio à paisagem de campo rupestre a uma altitude de aproximadamente 1600m, e abriga muitas espécies de 9

16 anuros (Drummond et al., In press), além de uma fauna singular de invertebrados aquáticos (Sant anna et al. 2011). É localidade tipo da espécie Physalaemus erythros, classificada na categoria Dados Insuficientes pela Lista Vermelha de espécie ameaçadas da União Internacional para Conservação da Natureza IUCN (Caramaschi, 2004). A lagoa também abriga outras espécies ameaçadas como Physalaemus evangelistai, classificada como Dados Insuficientes pela IUCN (Nascimento et al., 2010), e Pithecopus ayeaye classificada como Criticamente em Perigo pela IUCN (Caramaschi et al., 2016). Métodos de coleta As coletas de dados foram realizadas entre os meses de novembro de 2016 e fevereiro de 2017, na estação chuvosa. Os girinos foram coletados com puçás e peneiras, no período diurno, pelo método de varredura (e.g.: Both, 2009). Os espécimes foram agrupados em lotes por data, local e morfotipos, e, sacrificados com xilocaína. Cada morfotipo foi fotografado, ainda vivo, para que as cores e os formatos fossem documentados. Os demais indivíduos foram armazenados em formol 10% e tombados como espécimes testemunho na coleção herpetológica do Laboratório de Zoologia dos Vertebrados da Universidade Federal de Ouro Preto, LZV-UFOP. Os espécimes foram identificados e classificados por guildas, considerando a posição de forrageamento na coluna d água. As classificações foram baseadas em literatura (Dias, 2008; Pezzuti, 2011). Métodos de Identificação de espécies e validação taxonômica Todos os girinos foram identificados por meio de características morfológicas, por meio de chaves de identificação regionais (Rossa-Feres & Nomura 2006; Pezzuti 2011) e com base em comparação com material de coleções científicas e descrições disponíveis na literatura (Rossa-Feres & Jim, 1993; Pugliese & Bastos, 2001; Lourenço et al. 2010; Pinheiro et al., 2012). Os girinos coletados foram agrupados em lotes correspondentes a cada morfotipo de cada localidade, em cada evento de coleta. Foram encontrados e, posteriormente identificados, 33 morfotipos, distribuídos em 90 lotes. 10

17 Dois ou três indivíduos de cada lote foram usados para extrair amostras para análise molecular. Para tanto, foram retirados tecidos de membros em desenvolvimento, da extremidade da cauda, ou, dependendo da fase, todo o indivíduo foi usado como amostra. Esses procedimentos foram realizados em laboratório com material esterilizado e os tecidos foram preservados em álcool 99%, seguindo método utilizado em Schulze et al. (2015). As análises moleculares foram realizadas com o gene 16S, que foi amplificado e sequenciado em parceria com o Dr. Gunther Köhler, curador do setor de Herpetologia do Instituto de Pesquisa Senckenberg, em Frankfurt, na Alemanha. Posteriormente, as sequências geradas pelas amostras foram alinhadas utilizando o Muscle, pelo programa Mega 7. A análise de similaridade molecular para identificação dos girinos foi realizada em duas etapas: primeiramente utilizou-se o algoritmo BLASTN - versão 2.6.1(Altschul et al., 1997), para encontrar similaridades entre as sequências obtidas (query) e as depositadas no banco de dados do GenBank. As amostras foram também analisadas pela abordagem do código de barras do DNA (DNA barcode), que agrupa as sequências nucleotídicas, baseado em um limiar pré-definido para o grupo pesquisado, de acordo com o grau de divergência intraespecífico. Para os dados do GenBank usados para comparação, foram consideradas apenas os pares de bases relativos ao fragmento 16S. Dentre os resultados encontrados pelo BLAST, consideramos as sequências de maior similaridade, maior score, e também as informações de localidade, para inferirmos a identificação mais assertiva para cada espécie. A partir disso, calculamos a porcentagem de insucesso das identificações com base em chaves taxonômicas comparando com os resultados de análise molecular, considerando os espécimes que não conseguimos identificar ou que apresentou resultados diferentes. O grau de divergência entre as sequências, DNA Barcode, foi analisado pelo programa ABGD (Automatic Barcoding Gap Discovering) (Puillandre et al., 2011), considerando o limiar intraespecífico proposto por Vences e colaboradores (2005b), de 5%, e testado por outros autores para o grupo dos anfíbios (Batista et al., 2014; Grosjean et al., 2015; Lyra et al., 2017). O ABGD divide um conjunto de dados de alinhamento de sequências em espécies hipotéticas com base no gap do código de barras, que pode ser observado sempre que a divergência entre os organismos pertencentes à mesma espécie 11

18 é menor do que a divergência entre os organismos de espécies diferentes, a partir de um limite pré-definido (Puillandre et al., 2011). Dessa forma pudemos identificar os espécimes pertencentes a possíveis complexos de espécies, ou seja, aqueles cuja sequência divergiu mais que o limiar quando comparadas com as possíveis conspecíficas. Uma vez que não se objetivou inferir relações evolutivas entre as espécies incluídas neste estudo, uma árvore filogenética foi construída apenas para visualizar graficamente as distâncias genéticas das amostras e comparar os agrupamentos com as filogenias publicadas. Uma árvore de distâncias neighbour-joining (Saitou & Nei, 1987) foi criada usando o modelo de distâncias K2P (Kimura, 1980). 12

19 RESULTADOS I - Estudo da comunidade de girinos em lagoas permanentes e temporárias Riqueza e composição de espécies Os nomes atribuídos às espécies apresentadas no presente trabalho seguem as identificações encontradas por similaridade molecular, conforme apresentado na tabela 1. Foram registradas 17 espécies de anuros, pertencentes a cinco famílias: Leptodactylidae: 4 espécies; Hylidae: 10 espécies; Phyllomedusidae: 1 espécie; Microhylidae: 1 espécie; Bufonidae; 1 espécie. Nove espécies coletadas pertencem à guilda bentônica e 8 à guilda nectônica. Para guildas bentônicas, 6 espécies foram registradas apenas em lagoas permanentes e nenhuma foi registrada exclusivamente em ambiente temporário. Por outro lado, quatro espécies nectônicas foram registradas exclusivamente em lagoas temporárias e apenas uma foi encontrada apenas em lagoa permanente (Figura 1). As lagoas com maior número de espécies foram Virgílio, Gorila Permanente e Nonô, com 6 espécies cada; seguidas por Walace e Poça do Gorila, com 5 espécies cada. A Lagoa dos Coutos apresentou uma riqueza de 4 espécies, Tesoureiro e Lagoa Seca, 3 espécies, e Poça da Caveira e Lagoa da Caveira, 1 espécie cada. Seis espécies foram encontradas em apenas um corpo d água, Rhinella rubescens, Bokermannohyla circumdata, Dendropsophus seniculus, Hypsiboas polytaenius, Leptodactylus jolyi e Pithecopus ayeaye. Physalaemus cuvieri foi a espécie com maior número de observações, ocorrendo em 6 das 10 lagoas amostradas (Tabela 1). Nos ambientes permanentes foram registradas 13 espécies e nos temporários, 10 espécies. Physalaemus cuvieri, Scinax fuscovarius, S. squalirostris, S. hayii, Hypsiboas faber e Elachistocleis cesarii ocorreram nos dois tipos de lagoas. Rhinella rubescens, Leptodactylus latrans, L. jolyi, Bokermannohyla circumdata, Hypsiboas albopunctatus, H. polytaenius e Leptodactylus furnarius foram exclusivas de lagoas permanentes. Pithecopus ayeaye e as três espécies do gênero Dendropsophus, D. elegans, D. minutus e D. seniculus, foram registradas somente em lagoas temporárias (Tabela 1). 13

20 Guilda Virgílio Gorila Tesoureiro Nonô Caveira Coutos Poça Gorila Poça Caveira Walace Seca Tabela 1. Composição de espécies de anuros, coletados durante fase larval, em lagoas temporárias e permanentes, na porção sul da Cadeia do Espinhaço. B: bentônica, N: nectônica. Lagoas Permanentes Lagoas Temporárias Famílias/ Espécies Bufonidae Hylidae Rhinella rubescens B x Bokermannohyla circumdata B x Dendropsophus elegans N x x Dendropsophus minutus N x x Dendropsophus seniculus N x Hypsiboas albopunctatus B x x x Hypsiboas faber B x x x x Hypsiboas polytaenius B x Scinax fuscovarius N x x x x Scinax hayii N x x x Scinax squalirostris N x x x Leptodactylidae Leptodactylus furnarius B x x Leptodactylus jolyi B x Leptodactylus latrans N x x Physalaemus cuvieri B x x x x x x Microhylidae Elachistocleis cesarii B x x x x Phyllomedusidae Pithecopus ayeaye N x Total

21 Guildas tróficas em comunidades de girinos Figura 1. Padrão de distribuição de guildas entre lagoas permanentes e temporárias em comunidades de girinos ao sul da Cadeia do Espinhaço. As letras representam a: lagoas permanentes, b: lagoas permanentes e temporárias, c: lagoas temporárias II- Validação taxonômica Identificação com base em morfologia Os girinos coletados foram agrupados em 90 lotes e 33 morfotipos. As identificações por meio de chave taxonômica resultaram em 17 espécies (Tabela 1). Os lotes de P. ayeaye e E. cesarii foram identificados exclusivamente por morfologia pois as características eram inequívocas e outras evidências, como avistamento dos adultos no local de coleta, foram observadas. Seis indivíduos não puderam ser identificados com segurança (Figura 2). O indivíduo CL79, que foi identificado como Dendropsophus sp. com o uso da chave, representa um lote com poucos espécimes, o que dificultou a caracterização de aspectos como formato do corpo e narinas. Os indivíduos CL77 e CC40 foram identificados até gênero, Physalaemus, os caracteres que dificultaram a identificação foram posição de abertura do espiráculo, formato do focinho e padrão de manchas no corpo. Os demais indivíduos foram identificados como Scinax, mas devido ao formato do corpo, formato da nadadeira dorsal, posição das narinas e coloração e padrão de manchas pouco evidentes, não foi possível concluir a identificação da espécie. Esses espécimes foram identificados exclusivamente por meio de análise molecular, como Dendropsophus seniculus, Physalaemus cuvieri, Physalaemus cuvieri, respectivamente, e as três Scinax como Scinax fuscovarius (Figura 2). 15

22 Indivíduo CL77 - Physalaemus cuvieri Indivíduo CL83 - Scinax fuscovarius Indivíduo CL79 - Dendropsophus seniculus Indivíduo CC5 - Scinax fuscovarius Indivíduo CL80 - Scinax fuscovarius Indivíduo CC40 - Physalaemus cuvieri Figura 2. Espécimes de girinos coletados em lagoas na porção sul da Cadeia do Espinhaço, para os quais não foi possível a identificação por meio de chaves taxonômicas baseadas em morfologia. Identificações por análise molecular. Identificação por análise de similaridade molecular Das 33 amostras, 29 puderam ser sequenciadas. O tamanho das sequências variou de 543 a 620 pares de bases. A porcentagem mínima de similaridade entre as sequências analisadas (sequências query) e as encontradas no banco de dados variou de 95 a 99%, apenas um resultado ficou abaixo desse valor, o individuo CC63. Para o individuo CC10, só o gênero pôde ser identificado, pois a sequência do banco de dados de maior similaridade com a amostra não apresentava identificação da espécie. As identificações encontradas por meio de morfologia foram comparadas com aquelas obtidas pelo BLAST a partir dos dados do GenBank (Tabela 1). Dentre as identificações morfológicas de um total de 29 girinos, 13 foram confirmadas por meio do BLAST. Dez identificações foram atribuídas a outro táxon (gênero ou espécie) e seis foram identificados apenas pela análise molecular. Com isso, calculamos a proporção de insucesso que a identificação por meio da chave apresentou em relação à análise molecular, que foi de 16/29, ou, 55%. 16

23 A árvore filogenética das sequências corroborou com as identificações (Figura 3). Como esperado, devido à pequena representatividade para cada espécie, a árvore apresenta uma grande politomia em sua base, mas todos os gêneros foram aninhados em linhagens monofiléticas ou proximamente relacionadas. O gênero Bokermannohyla, para o qual foi encontrado apenas um espécime, ficou mais proximamente relacionado com o grupo das Hypsiboas em relação a outros gêneros. O indivíduo CC10, identificado como Hypsiboas sp. foi relacionado com H. polytaenius (Figura 3). 17

24 Tabela 2. Comparação entre as identificações de girinos por meio de morfologia com as obtidas por análise de similaridade molecular. A porcentagem de similaridade e o score de cada análise são apresentados. (*) Espécimes que mudaram de táxon. Espécime CC27 Identificação por Morfologia Bokermannohyla circumdata Identificação por BLAST Bokermannohyla circumdata % Similaridade Score CC29 Dendropsophus minutus Dendropsophus minutus CC42 Dendropsophus minutus Dendropsophus minutus CL79? Dendropsophus seniculus CC30 Dendropsophus elegans Dendropsophus elegans CC48* Hypsiboas polytaenius Hypsiboas albopunctatus CC11 Hypsiboas faber Hypsiboas faber CC26 Hypsiboas faber Hypsiboas faber CC58* Hypsiboas albopunctatus Hypsiboas polytaenius CC10* Hypsiboas lundii Hypsiboas sp CC16* Leptodactylus furnarius Leptodactylus jolyi CC50 Leptodactylus latrans Leptodactylus latrans CC13 Physalaemus cuvieri Physalaemus cuvieri CC40? Physalaemus cuvieri CL77? Physalaemus cuvieri CC9 Rhinella rubescens Rhinella rubescens CC5? Scinax fuscovarius CC28* Scinax perereca Scinax fuscovarius CL80? Scinax fuscovarius CL83? Scinax fuscovarius CC52* Scinax perereca Scinax hayii CC63* Scinax perereca Scinax hayii CC12* Scinax carnevalli Scinax squalirostris CT19* Dendropsophus seniculus Dendropsophus elegans CT28 Scinax squalirostris Scinax squalirostris CT15* Bokermannohyla aff. circumdata Physalaemus cuvieri CT27 Physalaemus cuvieri Physalaemus cuvieri CT31 Dendropsophus minutus Dendropsophus minutus CT33 Hypsiboas albopunctatus Hypsiboas albopunctatus

25 Figura 3. Representação gráfica das distâncias genéticas, obtidas pela análise do gene 16S, para girinos coletados em lagoas localizadas na porção sul da Cadeia do Espinhaço. 19

26 Análise de divergência intraespecífica A análise de divergência intraespecífica reuniu as amostras em 16 grupos, da seguinte forma: Grupo [ 1 ] n = 1: Bokermannohyla circumdata CC27 Grupo [ 2 ] n = 2: Dendropsophus elegans CT19; D. elegans CC30 Grupo [ 3 ] n = 3: Dendropsophus minutus CC29; D. minutus CC42; D. minutus CT31 Grupo [ 4 ] n = 1: Dendropsophus seniculus CL79 Grupo [ 5 ] n = 2: Hypsiboas albopunctatus CC48; H. albopunctatus CT33 Grupo [ 6 ] n = 2: Hypsiboas faber CC11; H. faber CC26 Grupo [ 7 ] n = 2: Hypsiboas polytaenius CC58; Hypsiboas sp. CC10 Grupo [ 8 ] n = 1: Leptodactylus jolyi CC16 Grupo [ 9 ] n = 1: Leptodactylus latrans CC50 Grupo [ 10 ] n = 5: Physalaemus cuvieri CC13; P. cuvieri CC40; P. cuvieri CL77; P. cuvieri CT15; P. cuvieri CT27 Grupo [ 11 ] n = 1: Rhinella rubescens CC9 Grupo [ 12 ] n = 3: Scinax fuscovarius CC5; S. fuscovarius CL80; S. fuscovarius CL83 Grupo [ 13 ] n = 1: Scinax hayii CC52 Grupo [ 14 ] n = 1: Scinax hayii CC63 Grupo [ 15 ] n = 2: Scinax squalirostris CC12; S. squalirostris CT28 Grupo [ 16 ] n = 1: Scinax fuscovarius CC28 O individuo CC10, identificado como Hypsiboas sp. foi agrupado com H. polytaenius, CC58, indicando que as diferenças entre as sequências desses dois indivíduos não é suficiente para que possam ser considerados espécies diferentes (Figura 4). Figura 4. Indivíduos agrupados pela análise de divergência intraespecífica. Indivíduo CC10 à esquerda, e indivíduo CC58, à direita. Os indivíduos CC52 e CC63 (Figura 5) foram identificados como Scinax hayii pela análise molecular, no entanto, o valor de divergência entre as sequências desses 20

27 indivíduos é maior que o limiar intraespecífico proposto para o grupo dos anfíbios, o que, supostamente, indica que são indivíduos de espécies diferentes. Figura 5. Indivíduos que apresentaram valor de divergência nucleotídica maior que o valor limiar intraespecífico. Resultado diferente do encontrado pelo BLAST. Indivíduo CC52 à esquerda, e indivíduo CC63 à direita. Para a espécie Scinax fuscovarius, quatro indivíduos foram analisados, e um deles apresentou divergência suficiente para ser considerada uma espécie diferente dos demais (Figura 6). A B C D Figura 6. Indivíduos identificados como Scinax fuscovarius pela análise de similaridade molecular. O resultado da análise de divergência intraespecífica apresentou divergência para o espécime CC28. Indivíduos A: CC5; B: CL80; C: CL83; D: CC28. 21

28 DISCUSSÃO O presente trabalho constata as dificuldades encontradas quando se objetiva o estudo dos anuros durante a fase larval. Dentre os 33 morfotipos encontrados, 29 foram identificados por 3 diferentes metodologias, sendo que, 13 resultados foram concordantes para todas as metodologias utilizadas, e 16 apresentaram divergências quanto às identificações. A riqueza de espécies registrada na fase larval para as 10 lagoas estudadas correspondeu a aproximadamente 16% do total estimado para toda Serra do Espinhaço, comparando com o trabalho de Leite et al. 2008, que relatou a ocorrência de 105 espécies para essa cordilheira. Dados disponíveis para Unidades de Conservação localizadas na mesma região deste estudo, obtidos a partir do registro de formas adultas e contemplando ambientes diversificados, confirmam que a região abriga uma alta biodiversidade de anuros. Pirani et al. (2013) registraram 36 espécies para a FLOE-Uaimií, 24 espécies foram encontradas no P.E. Itacolomi e 21 na E. E. Tripuí (Pedralli et al., 2001), 47 no P.E. Serra do Ouro Branco (São Pedro & Feio, 2011) e 43 na RPPN Santuário do Caraça (Canelas & Bertoluci, 2007). A exclusividade de ocorrência de girinos de guildas bentônicas em ambientes permanentes pode estar relacionada à presença de predadores, principalmente peixes, que os impede de ocupar todos os níveis da coluna d água. Assim como visto por Both et al. (2009), o hidroperíodo dos corpos d água constitui um importante fator estruturador de comunidades de girinos, sendo os bentônicos exclusivos de ambientes permanentes e os nectônicos ocorreram em ambientes permanentes e semipermanentes. O uso de chaves taxonômicas de identificação baseadas em morfologia externa é uma metodologia visual simples que auxilia os trabalhos de amostragem de forma rápida, sem depender de condições de laboratório e técnicas especializadas, nem sempre disponíveis em estudos de levantamento de fauna. Entretanto, devido à subjetividade de alguns caracteres (Altig & McDiarmid, 1999), sua utilização está condicionada ao grande conhecimento morfológico e taxonômico do grupo por parte do pesquisador. Como apontado por Altig (2007), o uso de medidas e termos não padronizados dificulta o trabalho de comparação e confunde o reconhecimento de caracteres. Como aconteceu com os indivíduos que foram identificados até gênero, por meio da análise 22

29 morfológica, Dendropsophus (CL79), Physalaemus (CL77 e CC40) e Scinax (CC5, CL80 e CL83). Além disso, o fato de que a morfologia externa dos girinos pode variar com fatores ambientais, como documentado por Relyea & Auld (2005), aumenta a variabilidade morfológica entre conspecíficos, comprometendo a identificação. Esses fatores podem explicar o índice de insucesso da identificação morfológica, de 55%, quando comparado à identificação obtida por meio de similaridade molecular. A análise molecular usada como ferramenta de identificação de espécies fornece vantagens em termos de rapidez e eficiência (Blaxter, 2004) e o custo para realizar sequenciamentos vem se tornando mais acessível atualmente (Köhler, 2007). No entanto, o método apresenta limitações, principalmente em relação aos bancos de dados usados para comparar as sequências (Tautz, 2002). Isso pode explicar os resultados encontrados para os indivíduos CC10 e CC63. A máxima similaridade encontrada no banco dados para o indivíduo CC10, foi com uma sequência identificada apenas até gênero, Hypsiboas sp., ou seja, a limitação da identificação do dado depositado no GenBank impossibilitou a identificação da espécie. Por outro lado, para o indivíduo CC63, a máxima similaridade obtida foi de apenas 91%, o que pode ter ocorrido por uma limitação de sequências variadas para comparação e identificação mais precisa. Nesse caso, somente a comparação com os adultos coletados nos mesmos sítios de amostragem poderia aumentar a eficiência da metodologia. A árvore filogenética que representa as distâncias genéticas das amostras do estudo concordou com as identificações, uma vez que aninhou as espécies pertencentes ao mesmo gênero. O gênero Bokermanohyla, para o qual foi encontrado apenas um espécime, ficou mais proximamente relacionado com o grupo das Hypsiboas em relação a outros gêneros. Essa mesma relação foi encontrada por Pyron & Wiens (2011) em revisão envolvendo mais de 2800 espécies de anfíbios utilizando análise molecular. A complementação da análise de similaridade molecular com o estudo do código de barras de DNA, além de certificar os resultados, acrescenta informações sobre a biodiversidade local, como foi visto em Madagascar (Vieites et al., 2009), Ásia (Grosjean et al., 2015) e localidades da América do Sul (Guarnizo et al., 2015; Estupiñán et al., 2016), revelando espécies crípticas (Vacher et al., 2017). Um exemplo encontrado no presente trabalho foi a identificação do espécime CC63, que foi identificado como Scinax hayii com pouca similaridade pelo BLAST e foi separado do segundo indivíduo da mesma 23

30 espécie pelo DNA Barcode. As espécies do grupo ruber, que inclui S. hayii, apresentam taxonomia complexa (Alves & Carvalho e Silva, 1999; Fouquet, 2007), o que pode ter contribuído para a incompatibilidade dos resultados na comparação com o banco de dados. Diversos aspectos podem ofuscar os resultados das análises por barcode, como por exemplo, casos de hibridização, como descrito por Grosjean e colaboradores (2015), e comparações de espécimes de populações muito distantes podem provocar mudanças nucleotídicas populacionais maiores que o limiar intraespecífico considerado para o grupo, como discutido por Hebert (2004b). Os resultados do barcode para a espécie Scinax fuscovarius apresentou concordância para três indivíduos. O espécime CC28, que apresentou alto valor de divergência nucleotídica, foi coletado no mesmo corpo d água que o indivíduo CC5, que teve a identificação confirmada, o que descarta a possibilidade da divergência ser explicada por diferenças populacionais, como discutido por Hebert, 2004b. Os resultados do barcode podem ser considerados apenas indicativos preliminares de espécies candidatas (Vences et al. 2005b), e evidências ecológicas são necessárias para corroborar a hipótese de complexo de espécies. Ademais, poucas sequências foram analisadas para um resultado de comparação melhor pelo barcode. O presente estudo aponta e discute possíveis inconsistências para três métodos de identificação de girinos, reforçando a importância da valorização do trabalho taxonômico. Além disso, é visto que as novas técnicas, como as moleculares, facilitam os processos de identificação e os tornam mais consistentes, principalmente para organismos complexos como as larvas de anuros (Lyra et al., 2007). O uso de banco de dados, como o GenBank, pode ser limitado para regiões megadiversas, como os trópicos, mas eles tendem a melhorar com o aumento de pesquisadores que contribuem com a deposição de materiais bem identificados, como proposto por Tautz (2002). Dessa forma, vimos que o uso exclusivo de uma metodologia de identificação não fornece evidências suficientes para testar ou descobrir espécies, assim como visto por Padial et al. (2009) e defendido por Köhler (2007) e o uso da taxonomia integrativa irá fornecer resultados mais consistentes para avaliarmos as espécies e, consequentemente, fornecer informações para as áreas da biologia da conservação. 24

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38 Anexo 1: Lagoas localizadas no Quadrilátero Ferrífero, onde foram realizadas coletas de girinos para estudo de identificação taxonômica e composição de comunidades. B C A E D F G H I J Legenda: Lagoas Permanentes - (A) Lagoa do Virgílio, (B) Lagoa do Tesoureiro, (D) Lagoa do Nonô, (G) Lagoa da Caveira, (H) Lagoa do Gorila, Lagoas Temporárias - (C) Poça da Caveira, (E) Lagoa Seca, (F) Poça do Gorila, (I) Lagoa dos Coutos, (J) Lagoa do Walace. 32