DESCOBERTA E GENOTIPAGEM POR SEQUENCIAMENTO DE SNPs EM Coffea canephora E APLICAÇÕES EM ESTUDOS DE DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA

Transcrição

1 Pró-Reitoria Acadêmica Escola de Saúde e Medicina Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia DESCOBERTA E GENOTIPAGEM POR SEQUENCIAMENTO DE SNPs EM Coffea canephora E APLICAÇÕES EM ESTUDOS DE DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA Fernanda de Araújo Carneiro Orientador: Dario Grattapaglia Coorientador: Alan Carvalho Andrade Brasília - DF 2014

2 FERNANDA DE ARAÚJO CARNEIRO DESCOBERTA E GENOTIPAGEM DE SNPs EM Coffea canephora E APLICAÇÕES EM ESTUDOS DE DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia. Orientador: Dario Grattapaglia, PhD. Coorientador: Alan Carvalho Andrade, PhD. Brasília - DF 2014

3 C289d Carneiro, Fernanda de Araújo. Descoberta e genotipagem por sequenciamento de SNPs em Coffea canephora e aplicações em estudos de diversidade e estrutura genética / Fernanda de Araújo Carneiro f. : il.; 30 cm Dissertação (Mestrado) Universidade Católica de Brasília, Orientação: Prof. Dr. Dario Grattapaglia Co-orientação: Prof. Dr. Alan Carvalho Andrade 1. Coffea canephora. 2. Diversidade genética. 3. SNPs. 4. Genotipagem nextrad. I. Grattapaglia, Dario, orient. II. Andrade, Alan Carvalho, coorient. III. Título. CDU 606 Ficha elaborada pela Biblioteca Pós-Graduação da UCB

4

5 AGRADECIMENTO Agradeço a Deus! Por guiar meus caminhos e escolhas e, principalmente, por permitir que eu tenha vindo em uma família com pessoas que são tudo na minha vida. Aos meus pais, Osvaldo e Luzia, todo agradecimento é pouco por tudo que fizeram e fazem por mim. Esse trabalho é uma pequena parte de tudo que me ofereceram durante toda a vida. As minhas irmãs, Juliana e Renata, que sempre estiveram comigo, me apoiando. Vocês são meu alicerce!!! Amo vocês!!! Não poderia deixar de agradecer a pessoinha que deixa minha vida muito mais doce e feliz, o meu marmotinha favorito...marcos Neto. Amo tamanho do céu vezes um milhão de dólares!!! Como sou daquelas que cachorro faz parte da família, a Erê e a Nina merecem também estarem aqui. Nada melhor que chegar em casa e ter um amigo quatro patas para te receber...dois então, sorriso na certa. Ao Dr. Alan, que aceitou que eu trabalhasse em seu laboratório sem me conhecer. Agradeço pela confiança depositada, por todos os ensinamentos, auxílio, idas ao campo, por consertar o despolpador, broncas, brincadeiras e descontração. Por não deixar eu esquecer nunca que a ignorância é uma coisa muito triste. Muito obrigada! Quero agradecer também ao francês mais brasileiro que eu conheço, Dr. Pierre, que juntamente com o Alan, me ensinou muito, ajudou, proporcionou muitos momentos bons, de aprendizado, e com uma alegria e humildade incrível. Merci beaucoup! A todos os professores do curso de Ciências Genômicas e Biotecnologia, mas especialmente ao Dr. Dario Grattapaglia, que aceitou me orientar e por estar sempre disponível para esclarecimentos e ensinamentos. Essa dissertação é uma parte de um trabalho muito maior, que jamais seria possível sem a ajuda e participação de muuuuiiiiiitas pessoas. Quero agradecer, de coração, a todas essas pessoas, mas a lista seria muito extensa colocando cada nome aqui. Então, de maneira mais simples, mas não menos importante, quero agrader a todos do CPAC, em especial ao Amiltinho, que me ajudaram na colheita, despolpa, classificação... e por ai vai. Ao Gustavo e a Milene, que embarcaram também nesse trabalho e mais ainda, aceitaram participar da aventura de medir potencial de antemanhã de mais de 400 plantas em uma semana (só quem já fez isso sabe a aventura que é!). Durante nossa caminhada, muitas pessoas cruzam nosso caminho, comigo não foi diferente. Na UCB tive a oportunidade de conhecer algumas pessoas mas quero muito agradecer a duas em especial: Flávia e Dielle. E entre as pessoas que Deus coloca em nossa vida, existem aquelas que são mais que especiais...tati, você é uma dessas pessoas, uma irmã. A todas as pessoas do LGM (Jean, Naty, Michelle, Karol, Edriana, Sinara, Tati, Erica) que foram amigos, companheiros e parceiros para que esse trabalho fosse realizado e claro, muitos momentos agradáveis passamos juntos. Quero agradecer a todos, especialmente a Erica, meu braço direito nessa caminhada. Além das pessoas que me ajudaram muito nesse trabalho, quero agradecer as pessoas que tive o imenso prazer de conhecer e conviver nesse tempo de LGM; Felipe, Gabriel, Rafa, Patricia, Paula, Jorge...e me desculpe se não citei o nome de alguém. Meu eterno agradecimento a todas as pessoas que fizeram parte desse trabalho!

6 RESUMO CARNEIRO, F. A DESCOBERTA E GENOTIPAGEM POR SEQUENCIAMENTO DE SNPs EM Coffea canephora E APLICAÇÕES EM ESTUDOS DE DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA p. Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, Brasília - DF, Dentre as diferentes atividades ligadas ao negócio agrícola em nível mundial, o agronegócio cafeeiro está entre as de maior importância econômica e social, sendo o principal meio de subsistência para mais de 125 milhões de pessoas e produzido em mais de 60 países. A produção cafeeira comercial baseia-se principalmente em duas espécies: Coffea arabica e Coffea canephora. A grande variabilidade genética do C. canephora devido sua alogamia, é um fator de grande importância para os programas de melhoramento do cafeeiro, pois fornece uma fonte de novos genes. O estudo molecular da diversidade genética vem se demonstrando cada vez mais eficiente, necessário e refinado, uma vez que as técnicas moleculares estão evoluindo e os descritores morfológicos estão se tornando insuficientes para a descrição de um indivíduo. Uma ferramenta muito importante no estudo da diversidade genética é o uso dos marcadores moleculares SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), estes consistem na variação de sequência de DNA, podendo ser identificados em praticamente todos os genes. No caso de C. canephora, estudos de diversidade podem facilitar a orientação dos programas de melhoramento na escolha de genitores para cruzamentos ou de genótipos para composição de variedades clonais. Este trabalho objetivou (i) avaliar e caracterizar, por meio da técnica de genotipagem nextrad (Nextera-tagmented reductively-amplified DNA), a diversidade e a estrutura genética de indivíduos de C. canephora Conilon, pertencentes a uma população localizada na Embrapa Cerrados; (ii) identificar os possíveis genitores desses mesmos indivíduos e (iii) validar a técnica de genotipagem em escala genômica utilizada nesse estudo. Um total de SNPs foram identificados em indivíduos de C. canephora Conilon por meio da técnica de genotipagem nextrad, destes, 573 marcadores foram selecionados para as análises de diversidade, parentesco e estrutura genética utilizando os software Cervus, adegenet e Structure. A diversidade genética (0.405) e a média da heterozigosidade observada (0.41) foram altas considerando marcadores bialélicos e mais de 64% dos SNPs apresentaram valores de PIC superiores a 0.3. Em termos de população foi possível verificar que as duas metodologias utilizadas (método Bayesiano e DAPC) identificaram números diferentes de grupos formados para o mesmo conjunto de dados. Na análise de parentesco foi possível identificar alguns genitores bastante frequentes na população. Os dados gerados para a população serão úteis em estudos futuros de associação e no desenvolvimento de modelos de predição genômica. Palavras-chaves: Coffea canephora. Diversidade genética. SNPs. Genotipagem nextrad.

7 ABSTRACT Of all the different activities related to agricultural industry worldwide, coffee agribusiness is among the most important ones, both economically and socially, being the main livelihood for more than 125 million people in more than 60 countries. Commercial coffee production is mostly based on two species, Coffea arabica and C. canephora. The high genetic variability of C. canephora, due to its level of allogamy, is of great importance for breeding programs of coffee as a source of novel alleles and co-evolved genetic combinations. The molecular analysis of genetic diversity has become increasingly efficient, necessary and refined, as molecular techniques have evolved and morphological traits do not supply sufficient information to fully describe an individual. An important tool in the study of genetic diversity is the use of SNP (Single Nucleotide Polymorphism) based molecular markers. In the case of C. canephora diversity studies may benefit breeding programs in selecting individuals to optimize mating schemes or assess the diversity and relatedness of clonal varieties. This study aimed to (i) evaluate and characterize the diversity and the genetic structure of C. canephora Conilon individuals belonging to a population located at Embrapa Cerrados, by nextrad genotyping (reductively-amplified Nextera tagmented-dna); (ii) identify potential parents of these individuals and (iii) validate genotyping technique in genomic scale. A total of 11,230 SNPs were obtained for C. canephora Conilon individuals by technique nextrad, of these, 573 markers were selected for the diversity analysis, kinship and genetic structure using the Cervus, adegenet and Structure. The genetic diversity (0.405) and the mean observed heterozygosity (0:41) were high considering the bi-allelic markers and more than 64% of the SNPs showed PIC values higher than 0.3. In terms of population, the two methodologies used (Bayesian method and DAPC) identified different numbers of groups formed for the same set of data. In kinship analysis some parents are more frequent in the population. The data generated for the population will be useful in upcoming association studies the development of genomic prediction models. Keywords: Coffea canephora. Genetic diversity. SNPs. Genotyping nextrad.

8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 História evolutiva do alotetraplóide C. arabica. Origem de C. arabica: os genomas dos progenitores estão representados pelos diplóides C. eugenioides e C. canephora. C. arabica surgiu cerca de 1 milhão de anos atrás (m.a.a) a partir do cruzamento de C. canephora (ou espécies relacionadas) e C. eugenioides Figura 2 Produção total, em milhões de sacas (60 Kg), para Brasil, Vietnã, Colômbia e Indonésia, no período de 2010 a Figura 3 Evolução da produção brasileira de café beneficiado para o período de 2001 a Terceiro levantamento da safra agrícola cafeeira de Figura 4 Origem geográfica dos principais grupos genéticos de Coffea canephora. Em vermelho, origem geográfica do pool guineano. Em verde, origem geográfica dos grupos genéticos (circulados) do pool congolês. O grupo formado por cafeeiros selvagens de Angola (?) ainda está em estudo. As áreas hachuradas correspondem às zonas de refúgio durante o período de glaciação, ocorrido há anos Figura 5 Tecnologia RAD. (A) DNA genômico digerido com enzimas de restrição e ligação do adaptador P1. O adaptador P1 contém o sítio de amplificação do primer forward, sítio do primer utilizado no sequenciamento Illumina e código de barras. (B) Adaptador ligado aos fragmentos são combinados (multiplex) e cortados. (C) Ligação do segundo adaptador (P2). O P2 é um adaptador em Y, contendo o complemento reverso do sítio de amplificação do primer reverse, evitando a amplificação de fragmentos genômicos que não possuem o adaptador P1. (D) RAD tags que possuem o adaptador P1 serão selecionados e enriquecidos Figura 6 Etapas da genotipagem por sequenciamento. Extração de DNA das amostras, digestão com enzimas de restrição, montagem de multiplex de amostras após a ligação de adaptadores (comuns e com código de barras), amplificação por PCR, sequenciamento utilizando tecnologia de próxima geração, remoção do código de barras, mapeamento de sequências no genoma de referência e identificação de polimorfismos em cada amostra Figura 7 Preparação de biblioteca Nextera. O DNA é fragmentado aleatoriamente (indicado pela seta vermelha) pelas transposases que inserem transposons (indicado em cinza)

9 com extremidades de DNA livres (indicado em alaranjado e roxo) que permitirão a amplificação e sequenciamento dos fragmentos Figura 8 Primers seletivos permitem amplificar fragmentos com apenas a sequência específica no final. O sequenciamento posterior da biblioteca permite a determinação da variação genética nesses locos Figura 9 Indivíduos de C. canephora Conilon estabelecidos em um campo experimental localizado na Emprapa Cerrados em Planaltina/DF Figura 10 A - Acondicionamento da folha de C. canephora em sílicagel. B - Amostras, em etapa posterior, em tira de mini-tubos com tampão de extração e esferas de aço inox. C - Equipamento Mini-BeadBeater 96 (Biospec) utilizado para pulverizar as amostras de C. canephora. D - Espectrofotômetro de microplaca Multiskan Go (Thermo Scientific) Figura 11 Esquema ilustrativo para compreensão dos dados fornecidos pela SNPsaurus Figura 12 Correlação entre número de marcadores SNPs mapeados e tamanho dos cromossomos de C. canephora (Mbp) Figura 13 Decaimento do desequilíbrio de ligação, estimado com r 2, para o cromossomo 0 (Chr 0), cromossomo 1 (Chr 1) e cromossomo 2 (Chr 2) de C. canephora Figura 14 Decaimento do desequilíbrio de ligação, estimado com r 2, para o cromossomo 3 (Chr 3), cromossomo 4 (Chr 4) e cromossomo 5 (Chr 5) de C. canephora Figura 15 Decaimento do desequilíbrio de ligação, estimado com r 2, para o cromossomo 6 (Chr 6), cromossomo 7 (Chr 7) e cromossomo 8 (Chr 8) de C. canephora Figura 16 Decaimento do desequilíbrio de ligação, estimado com r 2, para o cromossomo 9 (Chr 9), cromossomo 10 (Chr 10) e cromossomo 11 (Chr 11) de C. canephora Figura 17 Possíveis 43 descendentes originados do cruzamento entre os parentais 148 e Figura 18 Possíveis 39 descendentes originados do cruzamento entre os parentais 29 e

10 Figura 19 Possíveis 35 descendentes originados do cruzamento entre os parentais 148 e Figura 20 Possíveis 34 descendentes originados do cruzamento entre os parentais 31 e Figura 21 Possíveis cruzamentos que deram origem aos clones 14, 22, 73 e 120 de C. canephora. A Parentais 19 e 28 originando clone 14. B PAR 17 e PAR 18 originando o clone 120. C PAR 1 e PAR 70 originando o clone 73 e a planta L18P88. D Cinco descendentes (clone 22, L9P23, L10P66, L14P2 e L18P22) do cruzamento entre os parentais 1 e Figura 22 Resultado da atribuição dos 436 indivíduos de C. canephora em três grupos majoritários definidos pelo software Structure. As cores vermelha, verde e azul representam os grupos 1, 2 e 3, respectivamente Figura 23 Inferência do número de grupos obtidos na DAPC com 573 SNPs. A seta vermelha indica o melhor valor de K (menor valor de BIC) Figura 24 Gráfico de dispersão DAPC com base na análise de 436 indivíduos de C. canephora utilizando 573 marcadores SNPs. Os grupos estão representados por cores e números diferentes (grupo 1 azul escuro; grupo 2 lilás; grupo 3 verde claro; grupo 4 amarelo escuro; grupo 5 amarelo claro; grupo 6 azul claro; grupo 7 marrom; grupo 8 vermelho; grupo 9 verde escuro e grupo 10 preto) Figura 25 Inferência do número de grupos obtidos na DAPC com SNPs. A seta vermelha indica o melhor valor de K (menor valor de BIC) Figura 26 Inferência do número de grupos obtidos na DAPC com SNPs. A seta vermelha indica o melhor valor de K (menor valor de BIC)

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Diferentes marcadores moleculares e informações como: dependem de PCR (sim ou não), nível de detecção de polimorfismo (baixo, médio, alto ou muito alto) e natureza do marcador (dominante-não identifica heterozigotos ou codominante-identifica heterozigotos) Tabela 2 Características avaliadas para os indivíduos selecionados na população da Embrapa Cerrados. Média da produção (apresentada em intervalo), em litros, obtida nas safras 2011/2012 e 2012/2013. Escala para suscetibilidade à ferrugem (0 imune; 1 baixa; 2 média e 3 alta). Intervalo de potencial hídrico foliar de antemanhã Tabela 3 Tamanho aproximado dos cromossomos de C. canephora, em Mbp, e número de marcadores SNPs mapeados por cromossomo Tabela 4 Distribuição dos 436 indivíduos pelos 3 grupos estabelecidos no Structure analisando 573 marcadores SNPs. Em azul estão destacados os indivíduos do INCAPER (parentais) e em rosa, os clones de C. canephora Tabela 5 Distribuição dos 436 indivíduos pelos 10 grupos estabelecidos na DAPC analisando 573 marcadores SNPs Tabela 6 Distribuição dos 432 indivíduos pelos 3 grupos estabelecidos na DAPC analisando marcadores SNPs Tabela 7 Distribuição dos 432 indivíduos pelos 3 grupos estabelecidos na DAPC analisando marcadores SNPs

12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REFERENCIAL TEÓRICO O CAFEEIRO Caracterização, importância e economia Coffea canephora MELHORAMENTO GENÉTICO MARCADORES MOLECULARES SNPs DESEQUILÍBRIO DE LIGAÇÃO GENOTIPAGEM POR SEQUENCIAMENTO Metodologia de genotipagem nextrad OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAL E MÉTODOS MATERIAL VEGETAL EXTRAÇÃO DE DNA FOLIAR GENOTIPAGEM POR SEQUENCIAMENTO SELEÇÃO DOS SNPs GENOTIPAGEM DOS CLONES 14, 22, 73 E 120 DE C. canephora ÍNDICE DE DIVERSIDADE E ANÁLISE DE PARENTESCO DESEQUILÍBRIO DE LIGAÇÃO ESTRUTURA GENÉTICA Structure Adegenet RESULTADOS SELEÇÃO DOS INDIVÍDUOS GENOTIPAGEM nextrad DIVERSIDADE GENÉTICA... 45

13 5.4 DESEQUILÍBRIO DE LIGAÇÃO ANÁLISE DE PARENTESCO ESTRUTURA GENÉTICA DE C. canephora Análises com 573 marcadores SNPs Análise com e marcadores SNPs DISCUSSÃO DIVERSIDADE GENÉTICA DESEQUILÍBRIO DE LIGAÇÃO ANÁLISE DE PARENTESCO ESTRUTURA DA POPULAÇÃO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS APÊNDICES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 96

14 12 1 INTRODUÇÃO O café é uma das commodities agrícolas mais importantes mundialmente e é o principal meio de subsistência para mais de 125 milhões de pessoas, sendo produzido em mais de 60 países (BAKER et al., 2001). Com mais de 120 espécies dos gêneros Coffea e Psilanthus conhecidas atualmente (DAVIS et al., 2011), a produção cafeeira comercial baseia-se principalmente em duas espécies: Coffea arabica e Coffea canephora, cada uma representando, respectivamente, 65% e 35% da produção mundial, com o Brasil liderando a produção e exportação desse produto (INTERNATIONAL COFFEE ORGANIZATION - ICO 1, 2015). C. canephora é uma espécie diploide (2n = 2X = 22 cromossomos), alógama, que possui autoincompatibilidade genética e normalmente cultivada em baixas e médias altitudes nas regiões intertropicais da África, América e Ásia (CUBRY et al., 2012). Devido à fecundação cruzada, apresenta uma variabilidade genética maior em relação a C. arabica, sendo mais resistente a doenças e pragas, e capaz de adaptar-se às diversas condições climáticas (BERTRAND et al., 2003). O melhoramento convencional, utilizado para o cafeeiro, é um processo longo, necessitando de, no mínimo, 30 anos até a obtenção de uma nova cultivar. A identificação de cultivares mais produtivas baseia-se no processo de seleção e recombinação apoiando-se em características fenotípicas cujas herdabilidades e correlações são variáveis, fazendo com que sempre exista um nível de incerteza associado à seleção direcional (MISHRA e SLATER, 2012). Na condução de qualquer programa de melhoramento genético, um dos pré-requisitos é a existência e o conhecimento da diversidade genética da espécie, desta forma, são realizados os planejamentos e definidas as estratégias de trabalho, como a identificação e seleção fenotípica de indivíduos superiores em populações naturais, avaliações de indivíduos de interesse para a obtenção de variedades clonais, seleção recorrente intrapopulacional, hibridação intraespecífica, entre outras (BERED et al., 1997; FERRÃO et al., 2000; FONSECA et al., 2001). A diversidade genética de C. canephora foi descrita em diversos trabalhos, iniciando com Berthaud (1986), utilizando isoenzimas, onde foram identificados dois grupos de 1 Disponível em:

15 13 diversidade: o Congolês e o Guineano. Com o mesmo tipo de marcador, Montagnon et al. (1992) propuseram a existência de dois subgrupos, SG1 e SG2, dentro do grupo Congolês. Já em 2003, em estudo com RFLP, Dussert et al. identificaram mais dois subgrupos, B e C, dentro do grupo Congolês, totalizando cinco grupos de diversidade. Em estudo com microssatélites, Musoli et al. (2009) acrescentaram ao grupo Congolês um novo grupo de diversidade, formado por indivíduos selvagens de Uganda. O estudo da diversidade genética fundamentado em caracteres morfológicos pode não ser confiável, devido à influência que sofrem pelo ambiente, já a análise da diversidade genética utilizando marcadores moleculares é independente de fatores ambientais, pois esses não variam de acordo com o ambiente. Devido a essa relevante característica, há um aumento de interesse na identificação de um grande número de marcadores moleculares para uma rápida aplicação na avaliação da diversidade genética e seleção de genótipos desejados (GUPTA et al., 2012). O desenvolvimento de métodos eficazes para a detecção de polimorfismos de base única (Single Nucleotide Polymorphism-SNPs) e pequenos eventos de inserção e deleção (Indels) levou a uma revolução no seu uso como marcadores moleculares (BATLEY et al., 2003). Considerado o tipo mais comum de polimorfismo de DNA, sua ocorrência e distribuição ao longo do genoma varia entre as espécies em função de diversos aspectos relacionados com o sistema preferencial de reprodução, história evolutiva da espécie e da população alvo do estudo. Podendo ser identificados em regiões gênicas ou não, geralmente o maior nível de polimorfismo é observado em regiões não codantes, por serem menos sujeitas à pressão de seleção (SOLEIMANI et al., 2003; LANNES et al., 2007; LI et al., 2009). Um estudo recente foi realizado por Dereeper et al. (2015) em que mais de SNPs foram identificados para sete genótipos de C. canephora fornecendo um sistema integrado de informações do genoma e facilitando o acesso aos dados e ferramentas de análise em café. Outro trabalho com SNPs foi realizado com o intuito de desenvolver marcadores de DNA para identificação de híbridos formados entre Coffea congensis e C. canephora, importante na propagação clonal e preparação de sementes (BHARATHA NANDHINI et al., 2013). A disponibilidade das tecnologias de sequenciamento de nova geração (Next Generation Sequencing-NGS) abriram as portas para estratégias inovadoras de descoberta e genotipagem de SNPs (GRATTAPAGLIA et al., 2011). A produtividade das plataformas de sequenciamento em larga escala continuam a crescer com a otimização de hardware e

16 14 software, e a dificuldade se encontra na produção das bibliotecas de sequenciamento e na análise e interpretação dos dados gerados (ADEY et al., 2010). Para a construção das bibliotecas genômicas, fragmentos de DNA flanqueados pelos adaptadores específicos de cada plataforma de sequenciamento, o procedimento padrão inclui a fragmentação do DNA, podendo este ser mecânico ou com enzimas de restrição, reparação de terminais, ligação dos adaptadores, seleção do tamanho dos fragmentos e amplificação via PCR (SYED et al., 2009; ADEY et al., 2010). Recentemente, um novo método de genotipagem por sequenciamento (Genotyping by Sequencing-GbS) denominado nextrad (Nextera-tagmented reductively-amplified DNA) foi lançado pela empresa SNPsaurus. Esta nova técnica de GbS difere das demais por utilizar um método rápido de preparação de bibliotecas de sequenciamento e não utilizar enzimas de restrição para a redução da complexidade genômica, mas sim se basear em PCR seletiva. O método alternativo para a construção da biblioteca, denominado Nextera, utiliza uma reação de transposição modificada, chamada tagmentação (tagmentation), em que transposases inserem uma alta densidade de oligonucleotídeos sintéticos (transposons) no DNA alvo (ADEY et al., 2010). O complexo de transposase e transposon, denominado "transposomo" têm extremidades de DNA livres, que se inserem aleatoriamente no DNA em uma reação de "cortar e colar (SYED et al., 2009). Uma vez que as extremidades de DNA são livres, este processo fragmenta eficazmente o DNA e ao mesmo tempo adiciona as sequências necessárias para a amplificação por PCR e sequenciamento em uma etapa única. A redução da complexidade genômica do nextrad é realizada por meio de um iniciador de sequência arbitrária que amplifica somente os locos que apresentam sequências complementares. Este iniciador é utilizado na etapa de amplificação da biblioteca produzida via tagmentação, minimizando assim o número de etapas e reduzindo a perda de DNA durante a criação da biblioteca, permitindo a utilização de quantidades muito menores de DNA inicial em comparação a outros métodos GbS. Todos estes métodos de genotipagem baseados em NGS implicam em uma mudança na capacidade de genotipar, com alta densidade, alto rendimento e baixo custo, um grande número de amostras, abrindo oportunidades incríveis no melhoramento de plantas na atualidade (GRATTAPAGLIA et al., 2011). O objetivo deste trabalho foi realizar estudos de diversidade e estrutura genética em uma população de C. canephora Conilon utilizando marcadores SNPs identificados pela metodologia nextrad.

17 15 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 O CAFEEIRO O cafeeiro chegou ao Brasil em 1723 através de mudas oriundas da Guiana Francesa e no ano seguinte, foi introduzido no Maranhão propagando-se, para os estados vizinhos, em pequenas plantações, atingindo a Bahia em Algumas sementes de café foram transportadas do Maranhão para o Rio de Janeiro onde se fomentou a ampliação da cultura na Serra do Mar (ALONSO-SALCES et al., 2009). Em 1825, as plantações alcançaram o Vale da Paraíba e os estados de São Paulo e Minas Gerais. Posteriormente, a produção se estendeu para o centro-sul cujas condições climáticas eram altamente favoráveis, atingindo o norte do Rio de Janeiro e o Espírito Santo em Caracterização, importância e economia Nativo da África, Madagascar e Mascarenhas (MUSOLI et al., 2009; DE KOCHKO et al., 2010), o cafeeiro pertence à família Rubiacea, subfamília Ixoroideae, tribo Coffeae e ao gênero Coffea, compreendendo mais de 120 espécies (DAVIS et al., 2006; HENDRE et al., 2008). Ao nível botânico, as plantas de Coffea são dicotiledôneas, de folhas persistentes e flores hermafroditas, de porte arbustivo ou arbóreo e caule lenhoso (FAZUOLI et al., 2000). Evolutivamente, o início da diversificação deste gênero ocorreu entre 5 e 25 milhões de anos atrás (CUBRY et al., 2008). De todas as espécies pertencentes ao gênero, somente duas são comumente utilizadas para fins comerciais: C. canephora e C. arabica. C. canephora é uma espécie diploide (2n = 2X = 22 cromossomos), cultivada em baixas e médias altitudes nas regiões intertropicais da África, América e Ásia, alógama apresentando autoincompatibilidade genética (CUBRY et al., 2012). Devido à alogamia, apresenta uma variabilidade genética maior quando comparado ao C. arabica, sendo mais resistente a doenças e pragas, e capaz de adaptar-se às diversas condições climáticas (BERTRAND et al., 2003). C. arabica é autógama alotetraploide (2n = 4X = 44 cromossomos) que se originou de um cruzamento entre C. canephora e Coffea eugenioides (Figura 1) ocorrido nos planaltos da Etiópia Central (LASHERMES et al., 1999). Por ser considerada superior, devido às suas propriedades organolépticas, como menor amargor e teor de cafeína, o C. arabica alcança um

18 16 maior valor de mercado e representa 65% da produção mundial (ALONSO-SALCES et al., 2009; LEROY et al., 2011; CUBRY et al., 2012). Figura 1 História evolutiva do alotetraplóide C. arabica. Origem de C. arabica: os genomas dos progenitores estão representados pelos diplóides C. eugenioides e C. canephora. C. arabica surgiu cerca de 1 milhão de anos atrás (m.a.a) a partir do cruzamento de C. canephora (ou espécies relacionadas) e C. eugenioides. Fonte: VIDAL et al. (2010) adaptada. Tradicionalmente, a produção de café no Brasil e no mundo concentrava-se apenas na espécie C. arabica. Entretanto, entre os anos de 1870 e 1900, diante de uma epidemia de ferrugem no sudeste asiático causada por Hemileia vastatrix Berk. e Br que devastou culturas em diversos países produtores de C. arabica, o cafeeiro C. canephora passou a ser alvo de estudos científicos visando à sua exploração econômica, já que esta espécie apresentava resistência à doença. O café destaca-se econômica e socialmente no Brasil, desde a chegada das primeiras mudas vindas da Guiana Francesa em meados do século XVIII e, diante de sua rápida adaptação ao solo e clima, o produto adquiriu importância no mercado, transformando-se em um dos principais itens de exportação, desde o Império até os dias atuais (Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento-MAPA) 2. Considerado uma das commodities mais importantes de alimentos tanto para os produtores, ou seja, os países nas áreas tropicais e subtropicais que tem o café como principal produto de exportação agrícola, e para os fabricantes, que estão localizados principalmente na Europa e na América do Norte, onde o café é torrado, misturado, e embalado (ALONSO-SALCES et al., 2009). 2 Disponível em:

19 Produção total (milhões de sacas de 60Kg) 17 Segundo dados recentes disponibilizados pela ICO (2015), mais de 50% da produção mundial cafeeira é oriunda do Brasil, seguido por Vietnã, Colômbia e Indonésia (Figura 2) Brasil Vietnã Indonésia Colômbia Ano Figura 2 Produção total, em milhões de sacas (60 Kg), para Brasil, Vietnã, Colômbia e Indonésia, no período de 2010 a Fonte: ICO (2015) adaptada. A primeira estimativa da Companhia Nacional de Abastecimento-CONAB (2015) 3 para a produção da safra cafeeira (espécies C. arabica e C. canephora) indica que o país deverá colher aproximadamente 45 milhões de sacas de 60 Kg de café beneficiado (Figura 3). Pode-se observar, ainda na Figura 3, que a safra de 2014 representou uma quebra da tendência de crescimento da produção que, desde a safra de 2001, mantinha-se nos ciclos de alta bienalidade, inclusive ficando abaixo da safra de 2013 que foi de baixa. A bienalidade é própria da natureza fisiológica do cafeeiro que necessita vegetar em um ano para produzir bem no ano seguinte. Nos anos de alta carga, a planta direciona a produção de fotossintetizados para a formação e crescimento dos frutos. Nos anos de baixa carga, estes são direcionados a formação de novas gemas vegetativas que gerarão novos ramos (RENA e MAESTRI, 1985; PICINI, 1998). Para o ano de 2014, que seria de alta carga, a redução se deve principalmente a forte estiagem que ocorreu nos primeiros meses do ano, afetando diretamente o desenvolvimento do grão, favorecendo o aumento de frutos chochos e/ou mal granados (BELAN et al., 2011). 3 Disponível em:

20 Milhões de sacas de 60Kg 18 Figura 3 Evolução da produção brasileira de café beneficiado para o período de 2001 a Terceiro levantamento da safra agrícola cafeeira de Fonte: CONAB (2015) Coffea canephora C. canephora foi descrito por Louis Pierre, em 1895, e classificado em 1897 por Albrecht Froehner, durante uma revisão do gênero Coffea. A espécie possui caules lenhosos e múltiplos, folhas lanceoladas e grandes, com nervuras salientes e bordas onduladas (DE KOCHKO et al., 2010; MONTAGNON et al., 2012). Sua reprodução ocorre de forma alógama sendo facilitada através da floração gregária, ou seja, todas as plantas individuais de uma extensão geográfica florescem simultaneamente. No caso específico do cafeeiro, esse sincronismo do florescimento está associado com ciclos de déficit de água nas plantas, como períodos prolongados de estiagem, os quais quebrariam a dormência das gemas florais, levando ao florescimento após o retorno das chuvas ou irrigação (FERRÃO, M. A. G. et al., 2007; SILVA et al., 2009). A espécie possui um mecanismo de auto-incompatibilidade (self-incompatibility-si) genética, permitindo que as plantas reconheçam e rejeitem seu próprio pólen ou pólen com genótipo semelhante (NOWAK et al., 2011). No caso de C. canephora, o sistema de autoincompatibilidade é do tipo gametofítico (gametophytic self-incompatibility-gsi) controlado por um loco denominado S, no qual a formação do tubo polínico é impedida por S-RNases produzidas no pistilo, quando o alelo do loco-s do grão de pólen (haploide) é idêntico a um dos alelos do pistilo (diploide) (ASQUINI et al., 2011). Berthaud (1986) foi o primeiro a descrever a diversidade genética de C. canephora, identificando os grupos de diversidade Congolês e Guineano, em estudo com isoenzimas.

21 19 Com o mesmo tipo de marcador, Montagnon et al. (1992) incluíram, dentro do grupo Congolês, dois subgrupos, o SG1 e o SG2. Posteriormente, em 2003, Dussert et al. utilizando RFLP identificaram mais dois subgrupos dentro do grupo Congolês, denominados B e C Musoli et al. (2009), trabalhando com microssatélites, acrescentaram ao grupo Congolês um novo grupo de diversidade, formado por indivíduos selvagens de Uganda (Figura 4). Grupo Guineano Grupo Congolês Figura 4 Origem geográfica dos principais grupos genéticos de Coffea canephora. Em vermelho, origem geográfica do pool guineano. Em verde, origem geográfica dos grupos genéticos (circulados) do pool congolês. O grupo formado por cafeeiros selvagens de Angola (?) ainda está em estudo. As áreas hachuradas correspondem às zonas de refúgio durante o período de glaciação, ocorrido há anos. Fonte: MONTAGNON et al. (2012) adaptada. O grupo Guineano é formado por populações de Guiné e Costa do Marfim, na África Ocidental, caracterizados por possuir internódios, sementes e frutos pequenos com maturação precoce e altos teores de cafeína, suscetibilidade à ferrugem, tolerância à seca, coloração bronze dos brotos novos e bebida com qualidade inferior ao do grupo Congolês (MONTAGNON et al., 1998; CUBRY et al., 2008; MONTAGNON et al., 2012). Já o grupo Congolês é formado por populações da República Democrática do Congo, República Centro Africano e Camarões, apresentando dois subgrupos de maior importância, o subgrupo 1 (SG1) e o subgrupo 2 (SG2). O SG1 é tolerante à seca, localizado na região mais litorânea da bacia do rio Congo, com períodos de seca. Já o SG2 é sensível à seca, localizado na floresta equatorial com índices pluviométricos elevados e bem distribuídos ao longo do

22 20 ano (MONTAGNON e LEROY, 1993; MONTAGNON et al., 1998; MONTAGNON, 2000; FAZUOLI et al., 2007). O maior estado produtor de C. canephora no Brasil é o Espírito Santo com aproximadamente 75% da produção nacional, cuja estimativa de produção para o ano de 2015 está em torno de 9 milhões de sacas de 60 Kg, representando um pequeno decréscimo em relação à safra anterior. O decréscimo na produção se deve a diversos fatores, por exemplo: grande safra em 2014; o efeito negativo da seca nesse mesmo ano; aumento da incidência de broca dos grãos devido à colheita mal feita em decorrência da falta de mão de obra; intenso vento frio por vários dias na época da florada, levando a queda de flores, desfolhamento das lavouras e, consequentemente, redução expressiva do número de frutos nas rosetas; incidência de cochonilhas das rosetas e broca das hastes e má distribuição de chuvas em muitas lavouras das principais regiões produtoras (CONAB, 2015). Observa-se que as lavouras têm sido renovadas com variedades superiores, por meio da multiplicação do material genético realizada por estacas, que são formadas por partes dos ramos ortotrópicos, denominadas mudas clonais (FERRÃO, R. G. et al., 2007), e com outras tecnologias associadas visando o aumento da produção e melhoria da qualidade final do produto (CONAB, 2015). Como consequência, uma remuneração mais adequada para o café de qualidade superior servirá como incentivo para que cafeicultores aumentem a produtividade e se insiram intensamente em programas para a melhoria da qualidade do C. canephora. 2.2 MELHORAMENTO GENÉTICO O melhoramento convencional do cafeeiro é um processo longo, necessitando de, no mínimo, 30 anos até a obtenção de uma nova cultivar. A identificação de cultivares mais produtivas baseia-se no processo de seleção e recombinação, mensurando as características fenotípicas cujas herdabilidades e correlações são variáveis, fazendo com que sempre exista um nível de incerteza associado à seleção direcional (MISHRA e SLATER, 2012). Além disso, um desafio do melhoramento genético é também a resistência a pragas e doenças, bem como a maior adaptabilidade edafoclimática (CECCARELLI et al., 2010). Para conduzir qualquer programa de melhoramento genético, um dos pré-requisitos é a existência e o conhecimento da diversidade genética da espécie, pois baseado nesta, são realizados os planejamentos e definidas as estratégias de trabalho, como a identificação e seleção fenotípica de indivíduos superiores em populações naturais, avaliações de indivíduos

23 21 de interesse para a obtenção de variedades clonais, seleção recorrente intrapopulacional, hibridação intraespecífica, entre outras (BERED et al., 1997; FERRÃO et al., 2000; FONSECA et al., 2001). Em programas de melhoramento envolvendo hibridações, o estudo da diversidade genética tem sido de grande importância, por fornecer parâmetros para a identificação de genitores mais divergentes, aumentando a probabilidade de segregação nas descendências e a recuperação de genótipos transgressivos. Deve-se considerar ainda os efeitos aditivos e não aditivos no controle das características alvo da seleção, sistema de cruzamento preferencial e modo de propagação prevista da cultura (FALCONER, 1981; DIAS et al., 1997; CRUZ et al., 2004). O conhecimento da diversidade pode auxiliar também no manejo dos bancos de germoplasma, oferecendo parâmetros para o estabelecimento de coleções nucleares e a otimização do tamanho efetivo de populações, entre outras aplicações (CRUZ, 2005). A estrutura populacional de uma espécie é o conjunto de suas características genéticas e demográficas, que é resultado da ação e das interações de uma série de mecanismos evolutivos e ecológicos (MARTINS, 1987). No âmbito genético, a estrutura de uma população pode ser definida pela frequência dos alelos que compõem os diferentes genótipos dos diferentes indivíduos integrantes da população (CRUZ, 2005). Para determinar a distância genética entre populações ou genótipos são utilizados métodos biométricos, onde se quantifica ou se estima o vigor híbrido, que são analisados pela estatística multivariada permitindo unificar múltiplas informações de um conjunto de caracteres. Vários métodos podem ser utilizados, dentre eles estão a análise por componentes principais, variáveis canônicas e métodos aglomerativos. A escolha do método depende da precisão desejada pelo pesquisador, da facilidade da análise e da forma como os dados são obtidos (CRUZ et al., 2004). A estatística multivariada tem sido amplamente utilizada para quantificar a diversidade genética. Tendo em mãos um banco de dados envolvendo diferentes variáveis de interesse para a espécie em estudo é possível integrar às múltiplas informações e escolher os progenitores mais divergentes que terão maiores probabilidades de promover resultados satisfatórios em um programa de melhoramento (FERRÃO, 2004). Na escolha de progenitores para programas de melhoramento é importante que eles tenham as seguintes características: bom desempenho, no que se refere às características de importância econômica, sejam divergentes, complementares, apresentem variabilidade genética, médias altas, principalmente quanto às características de interesse, alta adaptabilidade e estabilidade de comportamento.

24 22 A estimação da diversidade genética em C. canephora apresenta essencialmente duas importâncias: a identificação de progenitores divergentes para cruzamentos; a identificação de progenitores produtivos e similares que, ao serem propagados vegetativamente e agrupados, poderão resultar em uma população ou variedade sintética, uniforme e de alto rendimento (FERRÃO, 2004). Uma alternativa para o aumento na eficiência da seleção de genótipos superiores, para a realização de cruzamentos e redução do tempo, foi proposto por LANDE e THOMPSON (1990), por meio da Seleção Assistida por Marcadores (SAM). Essa técnica consiste em utilizar, simultaneamente, dados fenotípicos e marcadores moleculares associados com locos controladores de características quantitativas (QTL). QTLs podem ser detectados em cruzamentos biparentais com elevada extensão de desequilíbrio de ligação ou de forma mais precisa em populações mais diversas via genética de associação. LASHERMES et al. (2008) destacaram a utilização de marcadores moleculares como importante ferramenta para detecção de polimorfismos no DNA, oferecendo possibilidades para as análises genéticas em menor tempo. Recentemente um mapa genético de C. canephora com 236 marcadores microssatélites foi construído com o objetivo de identificar QTLs relacionados à produtividade e qualidade da bebida. Nesse estudo, os QTLs foram identificados para aproximadamente metade das características avaliadas, com efeito de 6% a 80% na variação fenotípica (LEROY et al., 2014). Entretanto, uma vez que a grande maioria das características de interesse do melhoramento é multifatorial e complexa, controlada por vários genes, com elevada interação com o meio ambiente, o sucesso da abordagem de primeiro identificar e depois utilizar QTLs na seleção direcional tem sido raro e geralmente restrito ao uso de QTLs de grande efeito em culturas com base genética estreita (DEKKERS e HOSPITAL, 2002; KUMAR et al., 2012). A introdução direta de genes por engenharia genética é uma alternativa promissora para agregar características fenotípicas de interesse como resistência a patógenos, tolerância à seca ou a qualidade da bebida (DUNWELL, 2000; WANG et al., 2003; RIBAS, PEREIRA, et al., 2006). Embora até o momento não exista nenhuma tecnologia além das duas que perfazem hoje praticamente 100% dos transgênicos em culturas agrícolas: a tecnologia de genes Bacillus thuringiensis para resistência a lepidópteros (LEROY et al., 2000) e a tecnologia de resistência ao herbicida glifosato de amônia (RIBAS, KOBAYASHI, et al., 2006) para melhor manejo de ervas daninhas. Com os estudos contínuos no sentido de entender os mecanismos pelos quais as plantas percebem e transmitem sinais ambientais para a maquinaria celular

25 23 ativando respostas adaptativas, é possível que novas tecnologias venham a ser desenvolvidas em apoio ao melhoramento (AGARWAL et al., 2006). Nos últimos anos, novas abordagens vem sendo utilizadas para a prática da seleção assistida, desta vez utilizando um grande número de marcadores distribuídos por todo o genoma de forma a capturar a maioria dos efeitos. Esta abordagem denominada seleção genômica utiliza as informações de DNA na seleção, de forma a permitir alta eficiência seletiva, grande rapidez na obtenção de ganhos genéticos com a seleção e baixo custo, em comparação com a tradicional seleção baseada em dados fenotípicos (RESENDE et al., 2008). Em estudo com RFLP e SSR, Gomez et al. (2009) analisaram a diversidade e a estrutura genética de C. canephora em populações na África e Prakash et al. (2005) verificaram a diversidade da mesma espécie na Índia utilizando SSR e AFLP. No germoplasma sul-americano, o uso de marcadores RAPD demonstrou uma elevada diversidade e estrutura genética na coleção de germoplasma do IAC (SILVESTRINI et al., 2008). Por outro lado, estudos envolvendo marcadores RAPD e SSR nas populações que originam as variedades clonais do programa de melhoramento genético conduzido no estado do Espírito Santo apontaram para uma menor estruturação e redução na diversidade (FERRÃO, R. G. et al., 2007). Outros trabalhos, tendo como foco a qualidade da bebida (LEROY et al., 2011), a resistência a patógenos e insetos, (BERTRAND et al., 2001; ROMERO et al., 2014) e a tolerância ao estresse hídrico tanto em C. arabica (FREIRE, 2010; MARRACCINI et al., 2011; VIDAL et al., 2012; FREIRE et al., 2013) como em C. canephora; (MARRACCINI et al., 2012) foram desenvolvidos. Freire (2010) analisou a diversidade nucleotídica de alguns genes candidatos, identificando SNPs em várias cultivares e clones de Coffea sp. Marraccini et al. (2012) e Vieira et al. (2013) demonstraram que vários genes de C. canephora, entre eles os relacionados a percepção e transdução de sinal de estresse CcPYL3, CcPYL7, CcPP2C, os fatores transcricionais CcABI5, CcAREB1, CcDREB1, o relacionado a fotossíntese CcRBCS1, entre outros, apresentam expressão diferencial em condições de déficit hídrico entre clones tolerantes e suscetíveis à seca. 2.3 MARCADORES MOLECULARES Marcador molecular é definido como todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA, expresso ou não que diferencie

26 24 dois ou mais indivíduos e que sejam herdados geneticamente (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998; MILACH, 1998). Diversas técnicas de biologia molecular estão disponíveis atualmente para a detecção da variabilidade genética ao nível de DNA, ou seja, detecção de polimorfismo genético (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). Esses polimorfismos estão no centro da genética moderna e podem ser medidos em uma ou mais populações, além de serem herdáveis, sendo comumente utilizados em estudos de genética de populações, genética ecológica e evolução (DAVEY et al., 2011). A introdução do uso de marcadores moleculares em estudos genéticos ocorreu no início da década de 80 e desde então passou a ser utilizado para diversas finalidades, como por exemplo: estudos de diversidade genética, caracterização de bancos de germoplasma, genealogia, construção de mapas, mapeamento comparativo, mapeamento gênico, seleção de genitores, certificação de cruzamentos, predição de fenótipos, fingerprinting, análises de pureza genética de sementes, melhoramento assistido, proteção varietal, mapeamento físico de genomas, integração de mapas genéticos e físicos, clonagem posicional, estudos de desequilíbrio de ligação, mapeamento de associação, filogenia, estudo de pedigree, isolamento de genes e diagnose (BORÉM e CAIXETA, 2009). Diferentes classes de marcadores moleculares vem sendo aplicados no melhoramento genético vegetal. Os marcadores de DNA são versáteis e possuem inúmeras vantagens quando comparados aos marcadores fenotípicos convencionais, pois estão presentes em maior número, são estáveis em todos os estádios de desenvolvimento da planta e são neutros, ou seja, não variam de acordo com o ambiente (RESENDE et al., 2012). A primeira geração de métodos utilizados para a geração de marcadores moleculares se baseou essencialmente em duas técnicas para a detecção de polimorfismos (Tabela 1) (VIJAYAN, 2005): Marcadores baseados em hibridização, como o Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP) ou Marcadores baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), como Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Simple Sequence Repeats (SSR) ou microssatélites, Inter Simple Sequence Repeats (ISSR).

27 25 Tabela 1 Diferentes marcadores moleculares e informações como: dependem de PCR (sim ou não), nível de detecção de polimorfismo (baixo, médio, alto ou muito alto) e natureza do marcador (dominante-não identifica heterozigotos ou codominante-identifica heterozigotos). Fonte: VIJAYAN (2005) adaptada. Marcador Baseado em Polimorfismo Natureza PCR RFLP Não Médio Codominante RAPD Sim Alto Dominante SSR Sim Alto Codominante ISSR Sim Alto Dominante AFLP Sim Alto Dominante Isoenzima Não Baixo Codominante STS Sim Alto Dominante EST Sim Alto Codominante SCAR Sim Alto Codominante CAPS Sim Alto Codominante SNP Sim Muito alto Codominante Vários estudos da diversidade genética em C. canephora já foram desenvolvidos com estas diferentes classes de marcadores moleculares, geralmente utilizando algumas poucas dezenas de marcadores. Berthaud (1986) e Montagnon; Leroy; Yapo (1992) utilizaram isoenzimas, Dussert et al. (2003) utilizaram RFLP, e trabalhos mais recentes foram com microssatélites (PONCET et al., 2006; PONCET et al., 2007; CUBRY et al., 2008; MUSOLI et al., 2009; LEROY et al., 2011; CUBRY et al., 2012; CUBRY et al., 2013). Estudos mais avançados de genômica populacional e seleção genômica, entretanto, demandam uma cobertura genômica consideravelmente mais ampla. Para isso métodos de mais alto desempenho e elevada reprodutibilidade são necessários. Uma nova geração de metodologias para a genotipagem de marcadores moleculares surgiu nos últimos anos com o advento das novas tecnologias de sequenciamento. Com base em NGS, foram desenvolvidos novos métodos para descobrir, sequenciar e genotipar uma grande quantidade de marcadores em praticamente qualquer genoma de interesse em uma única etapa, mesmo em populações com pouca ou nenhuma informação genética disponível (DAVEY et al., 2011). Estas metodologias estão começando a revolucionar a genômica aplicada ao melhoramento e genética de populações (POLAND e RIFE, 2012). Da mesma forma que a identificação de polimorfismos utilizando RFLPs e AFLPs requerem o uso de enzimas de restrição, muitos desses métodos NGS também dependem dessas enzimas para reduzir a complexidade do genoma, excluindo regiões repetitivas e

28 26 focando em regiões de baixa cópia simplificando assim o alinhamento de sequências em espécies com alta diversidade genética (DAVEY et al., 2011; ELSHIRE et al., 2011). A empresa Roche foi a primeira a lançar no mercado, em 2005, uma nova tecnologia de sequenciamento de DNA em larga escala, baseada na tecnologia do pirosequenciamento. No início de 2007, foi a vez da empresa Illumina a disponibilizar a sua primeira plataforma (Solexa GA). Posteriormente as plataformas SOLiD, HeliScope e Pacific foram apresentadas pelas empresas Applied Biosystem, Helicos e Pacific Bioscience respectivamente (METZKER, 2010) SNPs Com o crescimento dos projetos de sequenciamento em larga escala, tem se tornado cada vez mais fácil analisar diretamente os polimorfismos de base individual. Embora os polimorfismos revelados pelas técnicas de RFLP, AFLP e RAPD em grande parte se devem a SNPs além de indels, estas técnicas somente permitiam a análise indireta de SNPs pela observação de diferenças de tamanho ou de presença/ausência de fragmentos ou segmentos amplificados. Resultantes da substituição de uma única base ou pequenos eventos de inserção e deleção, os SNPs representam a fonte mais abundante de variação genética em genomas, podendo ser usados como marcadores genéticos simples, identificados ao longo de todo o genoma sejam em regiões transcritas ou não (RAFALSKI, 2002; FALEIRO, 2007). Marcadores SNPs são hoje os mais versáteis e eficientes para o estudo de associações entre polimorfismos ao longo de todo o genoma e fenótipos quantitativos e qualitativos, construção de mapas genéticos e mapeamento de locos controladores de características quantitativas, diagnósticos genéticos, análise da estrutura genética de populações, análise filogenética, entre outras (RAFALSKI, 2002). Considerado o tipo mais comum de polimorfismo de DNA, sua ocorrência e distribuição ao longo do genoma varia entre as espécies em função de diversos aspectos relacionados com o sistema preferencial de reprodução, história evolutiva da espécie e da população alvo do estudo. Embora presentes em regiões gênicas ou não, geralmente o maior nível de polimorfismo é observado em regiões não codantes, de mais rápida evolução e menos sujeitas à pressão de seleção (SOLEIMANI et al., 2003; LANNES et al., 2007; LI et al., 2009). Os SNPs mais comuns são os de transição, onde uma purina é substituída por outra purina ou uma pirimidina por outra pirimidina, em comparação às transversões em que uma purina é substituída por uma pirimidina ou vice-versa.

29 27 Dentre as diferentes formas para a detecção de SNPs, a abordagem baseada em PCR possui características como eficácia, baixo custo e necessita de pequena quantidade de DNA para genotipagem sendo, portanto, adequada em todas as fases do crescimento da planta, incluindo as fases precoces de mudas. Recentemente, SNPs foram identificados em cafeeiro utilizando bibliotecas ESTs (Expressed Sequence Tag) geradas no Brasil (VIEIRA et al., 2006; VIDAL et al., 2010; MONDEGO et al., 2011). Em outros trabalhos, utilizando Indels, Marraccini et al. (2011) estudaram a expressão dos diferentes alelos do gene que codifica a subunidade menor da ribulose 1,5-bis-fosfato carboxilase (Rubisco), em folhas de C. arabica e C. canephora, e Cotta et al. (2014) analisaram a expressão dos genes homeólogos de nsltp durante a maturação de frutos de C. arabica. Finalmente, com o advento das novas tecnologias de sequenciamento, a identificação de marcadores SNPs tende a aumentar exponencialmente e proverão a base para o estabelecimento de um programa de seleção ampla em cafeeiro (REZENDE et al., 2012). 2.4 DESEQUILÍBRIO DE LIGAÇÃO Para que um determinado marcador molecular possa ser utilizado em um programa de melhoramento por meio da seleção assistida por marcadores, é necessário que a população esteja em desequilíbrio de ligação; senão, a probabilidade de ocorrência de determinada classe de marcador seria independente da segregação dos alelos de QTLs de interesse. Entende-se por desequilíbrio de ligação (DL), ou desequilíbio gamético ou associação alélica, qualquer desvio das frequências alélicas em relação às frequências esperadas sob segregação independente, indicando a existência de associação não aleatória, ou preferencial, entre alelos de diferentes locos em uma população (ROSA, 2011). Esse conceito pode ser estendido as associações não aleatórias que ocorrem entre dois marcadores moleculares, dois genes, dois QTLs ou entre um gene e um loco marcador (GUPTA et al., 2005). Para estudos populacionais, a força de associação alélica depende do número de indivíduos fundadores, o tempo desde a fundação, ou seja, número de gerações sobre as quais a recombinação tem ocorrido, além de fatores como a mutação, deriva, seleção, dentre outros (GUPTA et al., 2005; COLLINS, 2009). Estudos de associação entre polimorfismos e fenótipo foi explorada inicialmente na área humana, com a finalidade de mapear os genes envolvidos em doenças comuns, como asma, doenças cardíacas, diabetes, mal de Alzheimer e fibrose cística (FLINT-GARCIA et al., 2003; COLLINS, 2009), e posteriormente passou a ser

30 28 utilizada em plantas, impulsionado especialmente pelo desenvolvimento de grande número de marcadores moleculares (MACKAY e POWELL, 2007). A extensão do DL pode ser investigada em nível de haplótipo, cromossômico ou do genoma total (XU et al., 2012), cujos valores de DL entre os genes de interesse e os marcadores que estão fisicamente ligados representam o ponto-chave para o mapeamento de associação. O decaimento desse DL determinará o número e a densidade de marcadores necessários para a análise. Por exemplo, se o DL decai rapidamente, uma densidade mais elevada de marcadores é necessária para identificar esses genes de interesse. Por este motivo, é importante compreender e determinar a extensão do DL na espécie estudada (FLINT- GARCIA et al., 2003; YU e BUCKLER, 2006). Do ponto de vista estatístico, o DL corresponde à covariância dos polimorfismos exibidos entre dois genes/ marcadores. As estatísticas comumente utilizadas para estimá-lo são o D e o r 2 e o princípio básico para o cálculo é fundamentado na diferença entre a frequência de haplótipos esperados e observados (FLINT-GARCIA et al., 2003). Considerando-se um par de locos com os alelos A e a, para o loco um, e B e b, para o loco dois, e suas respectivas frequências alélicas de π A, π a, π B e π b, o DL entre esses locos pode ser quantificado usando a expressão: Onde: D ab corresponde ao DL entre os locos A e B e π AB corresponde a frequência do haplótipo AB. A estatística r 2 é calculada por meio da equação: De forma geral, o r 2 leva em consideração mutações e recombinações, enquanto que o D mede apenas as diferenças de recombinação. Além disso, o r 2 indica como os marcadores podem estar correlacionados com o QTL de interesse, o que possibilita sua utilização em estudos de mapeamento associativo. O valor de r 2 varia de 0 a 1, sendo que valores próximos a zero representam equilíbrio e valores próximos a 1 sugerem associação, ou desequilíbrio. Poucos trabalhos de DL foram descritos para o gênero Coffea, dentre eles, Cubry et al., (2013) identificaram uma grande variação do DL entre os grupos de diversidade de C. canephora (Congolês e Guineano), o que possibilitou-os observar que o estudo de associação é mais viável dentro de cada população do que a nível de diversidade global e que a densidade de marcadores que devem ser utilizados são variáveis, dependendo da população analisada.

31 29 Souza (2011) verificou um baixo nível de DL em estudos com germoplasmas de C. canephora proveniente de lavouras de Rondônia, no entanto, parte desse desequilíbrio pode ser atribuída a outras causas, além da ligação genética, uma vez que foi detectado considerável percentual de pares de locos SSR não ligados, que apresentaram significativo DL. 2.5 GENOTIPAGEM POR SEQUENCIAMENTO A descoberta de SNPs é um passo importante na genômica aplicada, pois dela depende a capacidade de genotipar efetivamente todo o genoma com tecnologias de alto desempenho e baixo custo (VAN ORSOUW et al., 2007). Por algum tempo, essa identificação era limitada devido a poucas informações de sequências genômicas disponíveis quando comparadas a outras espécies com o genoma concluído (VAN ORSOUW et al., 2007). Entretanto, essa barreira foi removida devido aos avanços nas técnicas de NGS que abriram caminho para novas abordagens nessa área, produzindo informações de sequências em uma escala jamais vista (THUDI et al., 2012). Ainda nesse contexto, com o avanço dessas metodologias houve a necessidade de uma nova geração de ferramentas de bioinformática como pré-requisito para a análise dos dados obtidos (PAREEK et al., 2011). Os recentes avanços em tecnologias de sequenciamento de DNA tem facilitado o desenvolvimento de estratégias eficientes e de baixo custo, que permitem a descoberta simultânea de SNPs e a genotipagem em vários indivíduos (DE DONATO et al., 2013). Esses métodos utilizam a capacidade do NGS de gerar um enorme número de sequências de DNA, a partir de fragmentos obtidos com diferentes técnicas de redução de complexidade genômica, em geral via endonucleases de restrição. Adaptadores de DNA com códigos de barras permitem indexar cada amostra individualmente, produzir bibliotecas de multiplex e com isso aumentar muito a eficiência de genotipagem (ELSHIRE et al., 2011; POLAND e RIFE, 2012; DE DONATO et al., 2013). O uso de enzimas de restrição, para redução seletiva da complexidade do genoma, combinado com o NGS foi descrito primeiramente por Baird et al. (2008) e denominado Restriction Associated DNA (RAD) sequencing. Conforme ilustrado na Figura 5, esse método gera pequenos fragmentos de DNA, de acordo com a enzima de restrição selecionada, que serão ligados a adaptadores contendo sítio de amplificação do primer forward, sítio do primer da plataforma de sequenciamento (Illumina) e código de barras de 4 ou 5 pb para identificação de cada amostra, permitindo a multiplexagem de várias amostras na mesma pista

32 30 de sequenciamento. Após a ligação entre fragmento-adaptador, as amostras são reunidas e selecionadas de acordo com o tamanho, obtendo fragmentos uniformes. Um segundo adaptador em Y é também ligado, garantindo que apenas os fragmentos que estejam ligados ao primeiro adaptador sejam amplificados (BAIRD et al., 2008; POLAND e RIFE, 2012).

33 31 A Ligação do adaptador P1 para digestão do DNA genômico DNA genômico Sítio do primer de sequenciamento Illumina Sítio de restrição Sítio de ampfificação do primer forward Código de barras Adaptador P1 B Diferentes amostras fragmentadas e com código de barras C Ligação do adaptador P2 aos fragmentos cortados Adaptador P2 Adaptador em Y D Amplificação seletiva de RAD tags Fragmento sequenciado por Illumina Figura 5 Tecnologia RAD. (A) DNA genômico digerido com enzimas de restrição e ligação do adaptador P1. O adaptador P1 contém o sítio de amplificação do primer forward, sítio do primer utilizado no sequenciamento Illumina e código de barras. (B) Adaptador ligado aos fragmentos são combinados (multiplex) e cortados. (C) Ligação do segundo adaptador (P2). O P2 é um adaptador em Y, contendo o complemento reverso do sítio de amplificação do primer reverse, evitando a

34 32 amplificação de fragmentos genômicos que não possuem o adaptador P1. (D) RAD tags que possuem o adaptador P1 serão selecionados e enriquecidos. Fonte: BAIRD et al. (2008) adaptada. Elshire et al. (2011) desenvolveram a técnica de GbS (Figura 6) com a finalidade de aumentar a eficiência e o custo-benefício através de uma estratégia de sequenciamento multiplex utilizando código de barras de baixo custo. Ao incluir o código de barras na sequência do adaptador reduzem-se os custos com reagentes para a construção das bibliotecas que serão sequenciadas. Figura 6 Etapas da genotipagem por sequenciamento. Extração de DNA das amostras, digestão com enzimas de restrição, montagem de multiplex de amostras após a ligação de adaptadores (comuns e com código de barras), amplificação por PCR, sequenciamento utilizando tecnologia de próxima geração, remoção do código de barras, mapeamento de sequências no genoma de referência e identificação de polimorfismos em cada amostra. Fonte: KHAN e KORBAN (2012) adaptada. O protocolo de GbS, descrito por Elshire et al. (2011), originalmente desenvolvido para plantas agrícolas, como por exemplo milho e cevada, e semelhante ao método RAD, vem se tornando uma abordagem promissora por ser simples e altamente multiplexável com base na plataforma de sequenciamento Illumina (DE DONATO et al., 2013). Embora resulte em

35 33 uma proporção elevada de dados faltantes, em geral da ordem de 40 a 80%, o que demanda a utilização de metodologias de imputação (POLAND e RIFE, 2012) além de reprodutibilidades de genótipos não maiores do que 90% (SCHILLING et al., 2014). Sua flexibilidade no que diz respeito às espécies, populações e objetivos da pesquisa, bem como a capacidade de produzir dezenas de milhares a centenas de milhares de marcadores moleculares a tornam uma ferramenta apropriada para estudos populacionais, caracterização de germoplasma, melhoramento genético e mapeamento de características em uma variedade de organismos, especialmente em melhoramento e genômica de plantas (POLAND e RIFE, 2012; DE DONATO et al., 2013). Comparada à metodologia RAD, a GbS é mais simples pelo fato de não utilizar os adaptadores em Y, utiliza-se um adaptador com código de barras e um adaptador comum, ocorre apenas uma digestão do DNA genômico e a seleção de fragmentos pelo tamanho é eliminada (ELSHIRE et al., 2011; POLAND e RIFE, 2012). Entretanto a qualidade dos dados de GbS em geral é inferior em termos de proporção de dados faltantes e reprodutibilidade de genótipos (GRATTAPAGLIA, comunicação pessoal) Metodologia de genotipagem nextrad Vários protocolos, incluindo RAD, DArT (JACCOUD et al., 2001), CRoPS (VAN ORSOUW et al., 2007) e GbS são hoje disponíveis para a genotipagem de SNPs em larga escala via sequenciamento (DE DONATO et al., 2013). Recentemente, uma técnica derivada do método RAD foi desenvolvida pela empresa SNPsaurus, fundada por um dos inventores do método RAD sequencing. Esta empresa oferece a genotipagem por sequenciamento usando a preparação de bibliotecas com o sistema Nextera em um método denominado nextrad, que difere de outras técnicas de GbS por utilizar um método rápido de preparação de bibliotecas de sequenciamento e não utilizar enzimas de restrição para a redução da complexidade genômica, mas sim se basear em PCR seletiva (RUSSELLO et al., 2015). A preparação da biblioteca é realizada com o sistema Nextera da Illumina que funciona de forma muito diferente das preparações de bibliotecas via fragmentação. Em vez da fragmentação, reparação de terminais e ligação de adaptadores, esta tecnologia utiliza uma reação de transposição modificada chamada "tagmentação" (tagmentation) que se baseia em transposases que catalizam a inserção aleatória de transposons no DNA com elevada eficiência (ADEY et al., 2010).

36 34 O complexo de transposase e transposon, denominado "transposomo" têm extremidades de DNA livres as quais se inserem aleatoriamente no DNA em uma reação de "cortar e colar. Uma vez que as extremidades de DNA são livres, este processo fragmenta eficazmente o DNA e ao mesmo tempo adiciona as sequências necessárias para a amplificação por PCR e sequenciamento em uma etapa única (Figura 7). Dois transposomos são misturados em proporções equimolares e cada um transporta uma das duas sequências necessárias para a produção da biblioteca pronta para a amplificação via PCR (SYED et al., 2009). A B Figura 7 Preparação de biblioteca Nextera. O DNA é fragmentado aleatoriamente (indicado pela seta vermelha) pelas transposases que inserem transposons (indicado em cinza) com extremidades de DNA livres (indicado em alaranjado e roxo) que permitirão a amplificação e sequenciamento dos fragmentos. Fonte: SYED et al. (2009) adaptada. O processo de tagmentação é aleatório, e ambos os eventos de inserção são necessários para produzir uma molécula amplificável via PCR. A reação é tratada para remover as transposases ligadas e, em seguida, o DNA é amplificado via PCR e posteriormente sequenciado. A redução da complexidade genômica do nextrad (Figura 8) é realizada por meio de um iniciador de sequência arbitrária amplificando somente os locos que apresentam sequências complementares em um processo semelhante ao RAPD. Este iniciador é utilizado na etapa de amplificação da biblioteca produzida via tagmentação, minimizando assim o número de etapas e reduzindo a perda de DNA durante a criação da biblioteca, permitindo a utilização do método com quantidades muito menores de DNA inicial, da ordem de nanogramas, em comparação a outros métodos GbS que demandam quantidades de

37 35 microgramas de DNA. Isto permite a genotipagem de SNPs de alta qualidade em locos distribuídos por todo o genoma com apenas 10 ng de DNA total (RUSSELLO et al., 2015). Figura 8 Primers seletivos permitem amplificar fragmentos com apenas a sequência específica no final. O sequenciamento posterior da biblioteca permite a determinação da variação genética nesses locos. Fonte: SNPsaurus (2014).

38 36 3 OBJETIVO GERAL Avaliar e caracterizar a diversidade e a estrutura genética de uma população de melhoramento de C. canephora Conilon por meio de genotipagem ampla com marcadores moleculares SNPs. 3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Verificar a eficiência da genotipagem em escala genômica utilizando a metodologia nextrad em C. canephora Conilon; Analisar a estrutura e a diversidade genética dos indivíduos selecionados; Identificar os possíveis parentais dos indivíduos de C. canephora Conilon pertencentes à população da Embrapa Cerrados; Estimar o DL na população estudada.

39 37 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 MATERIAL VEGETAL Em uma população de melhoramento com aproximadamente 3500 indivíduos de C. canephora Conilon, advinda de um pool de sementes por polinização aberta coletadas de 48 genitores (Apêndice A) provenientes do banco ativo de germoplasma (BAG) do INCAPER, estabelecida em 2009/2010 em um campo experimental da Embrapa Cerrados (Planaltina/DF) (Figura 9) foram selecionados 420 indivíduos (Apêndice A). Os indivíduos foram selecionados de acordo com algumas características fenotípicas relevantes, com a finalidade de garantir diversidade para os seguintes parâmetros: tolerância à seca, vigor da planta, ramificação secundária, produtividade, seca de ponteiros, suscetibilidade à ferrugem e precocidade do fruto (CARNEIRO et al., 2013; CARNEIRO et al., 2014). Figura 9 Indivíduos de C. canephora Conilon estabelecidos em um campo experimental localizado na Emprapa Cerrados em Planaltina/DF. Para os 420 indivíduos, foram coletadas folhas frescas da terceira axila foliar (sem a nervura principal). Em seguida, esse material foi devidamente identificado e acondicionado à temperatura ambiente por um período de sete dias em tubos de 50 ml contendo silicagel (para desidratação) até a data da extração do DNA (Figura 10A).

40 38 Para os 48 genitores que deram origem a população estabelecida na Embrapa Cerrados, o material vegetal (folhas frescas) também foi coletado diretamente do BAG do INCAPER, com o intuito de realizar a análise de parentesco. Após a coleta, as folhas foram imediatamente envoltas em embalagens de papel alumínio, devidamente identificadas e acondicionadas em gelo. Em laboratório, as amostras foram armazenadas em ultra freezer, a uma temperatura de -80ºC, até a realização da extração de DNA. 4.2 EXTRAÇÃO DE DNA FOLIAR O DNA genômico de C. canephora foi extraído utilizando o protocolo de extração proposto por Doyle e Doyle (1990), modificado para extração em rack de 96 mini-tubos como descrito a seguir: Uma vez que as folhas estavam completamente desidratadas, foram fragmentadas e transferidas (aproximadamente 50 mg de amostra) para os mini-tubos de 1,1 ml (Axygen) com cinco micro esferas de aço inox (diâmetro 3mm) e 500 µl de tampão de extração (NaCl 1,4 M; Tris-HCl 100 mm; CTAB 2%; EDTA 0,05 M; PVP 1%; β- mercaptoetanol 2%) (Figura 10B). No equipamento Mini-BeadBeater 96 (Biospec), o tecido foi macerado por 90 segundos (Figura 10C) e, em seguida, a rack foi incubada a 65 C por 1 hora. Após o período de incubação, foram adicionados 400 µl da solução clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) e as tiras de mini-tubos foram agitadas por aproximadamente 30 segundos. O material foi centrifugado por 20 minutos a 1760 g, a fase aquosa superior foi transferida para uma placa Deep Well contendo 600 µl de isopropanol e misturada com auxílio de uma pipeta. A placa foi deixada a -20 C por 1 hora e, logo após, centrifugada por 30 minutos, a 1760 g. O sobrenadante foi descartado e adicionou-se 700 µl de etanol 70%, misturando com auxílio de uma pipeta, para lavar o pellet. Após centrifugar (20 minutos, 4ºC, 1760 g), o etanol foi descartado e o pellet foi seco no equipamento Concentrator Plus (Eppendorf) selecionando a opção Dry-AL por 30 minutos. O DNA foi ressuspendido em 160 μl de TE ph 8 (Tris-HCl 1M, EDTA 500 mm) autoclavado e acrescido com 1,6 μl de RNAse A (10 mg.l -1 ). Após a extração, foi realizada a quantificação do DNA em espectrofotômetro de microplaca Multiskan Go (Thermo Scientific) pela leitura da absorbância nos comprimentos de onda de 260, 280 e 230 nm (Figura 10D). Em seguida, o DNA genômico foi submetido à eletroforese em gel de agarose para a avaliação da integridade.

41 39 A B C D Figura 10 A - Acondicionamento da folha de C. canephora em sílicagel. B - Amostras, em etapa posterior, em tira de mini-tubos com tampão de extração e esferas de aço inox. C - Equipamento Mini-BeadBeater 96 (Biospec) utilizado para pulverizar as amostras de C. canephora. D - Espectrofotômetro de microplaca Multiskan Go (Thermo Scientific). 4.3 GENOTIPAGEM POR SEQUENCIAMENTO Para a realização da genotipagem nextrad, foram utilizados 50 µl de DNA genômico a uma concentração de 10 ng/µl. Após o sequenciamento, um pipeline para a identificação e genotipagem de SNPs foi realizado utilizando o genoma do clone 22 de C. canephora como referência. Inicialmente foi feita uma contagem da ocorrência de cada leitura de sequência (read), filtrando as sequências repetitivas e os erros, em seguida os reads foram alinhados no genoma de referência para identificar os alelos de cada loco. Em seguida esses alelos foram selecionados e uma lista de referência de loco e de todos os reads foi obtida. A tabela de genótipos com bons SNPs (Figura 11) foi gerada após o alinhamento e a identificação dos mismatches que ocorrem em alta frequência. SNP# Tabela de genotipagem SNPsaurus Tabela de genotipagem SNPsaurus Seus dados estão resumidos pela tabela de genotipagem, que é modelado após o padrão vcf para relatar polimorfismos Locos Locos de controle de controle interno interno Locos nextrad Posição do SNP Alinhamento no genoma referência, se disponível Alelo de referência O status alélico é listado para cada amostra. 1/1 significa que a amostra é homozigota para o alelo referência. 1/2 significa que é heterozigoto para o referência e primeiro alelo alternativo. 2/2 significa que a amostra é homozigota para o alelo alternativo. m/m está ausente ou não possui dados. Alelo 1 Alelo 2 Figura 11 Esquema ilustrativo para compreensão dos dados fornecidos pela SNPsaurus.

42 40 Fonte: SNPsaurus (2014-não disponibilizado). 4.4 SELEÇÃO DOS SNPs Com a finalidade de validar os resultados obtidos, os dados foram então mapeados com o genoma de C. canephora (DENOEUD et al., 2014) utilizando o Software Geneious v Um total de SNPs foram identificados com call rate acima de 80%. Destes, estavam em equilíbrio de Hardy Weinberg (EHW) com call rate acima de 90%. Para as análises de parentesco e de estrutura, foram selecionados 573 marcadores em EHW com call rate acima de 90% e frequência alélica mínima (MAF) igual ou superior a 15%. utilizando os programas Cervus (KALINOWSKI et al., 2007), adegenet e Structure. Posteriormente, as análises realizadas pelo adegenet foram repetidas utilizando os e SNPs. 4.5 GENOTIPAGEM DOS CLONES 14, 22, 73 E 120 DE C. canephora Nas análises de parentesco e estrutura genética também foram incluídos 04 clones de C. canephora, sendo três tolerantes (14,73 e 120) e um sensível (22) ao déficit hídrico (FONSECA et al., 2004; MARRACCINI et al., 2012; VIEIRA et al., 2013). Para estes clones, foi realizada a identificação dos 573 SNPs selecionados anteriormente. O genoma destes clones foi sequenciado por shotgun, as bibliotecas foram preparadas com o kit da Kapa Biosystems e os fragmentos gerados possuem em média, 500 pb, variando de 300 pb a 700 pb. 4.6 ÍNDICE DE DIVERSIDADE E ANÁLISE DE PARENTESCO Para os 573 marcadores SNPs analisados, os dados de genotipagem foram analisados pelo software Cervus (KALINOWSKI et al., 2007), a partir do qual foram obtidos os dados de frequências alélicas e, por meio dessas, os dados de heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He), calculada a partir da equação 8.4 (Nei, 1987) e de conteúdo de informação de polimorfismo (PIC). O valor de PIC é obtido com base no número de alelos, das suas frequências e do tamanho da amostra (Botstein et al., 1980). Para o presente trabalho, como os marcadores 4

43 41 SNPs são bialélicos, o valor máximo de PIC é de 0.5, considerando que ambos os alelos tenham a mesma frequência. A identificação dos possíveis parentais da população estudada foi realizada também com o software Cervus. Para realizar a análise de parentesco foi informado os 44 indivíduos parentais do INCAPER e os indivíduos descendentes, que se buscava identificar os pais, sendo 388 indivíduos do campo experimental da Embrapa Cerrados e os 4 clones de C. canephora e utilizou-se, no mínimo, 500 locos de identidade, o que corresponde a aproximadamente 85%. 4.7 DESEQUILÍBRIO DE LIGAÇÃO A estimativa do DL para cada cromossomo de C. canephora foi obtida por meio do parâmetro r 2, calculando o coeficiente de correlação entre cada par de SNP utilizando o pacote do software TASSEL. 4.8 ESTRUTURA GENÉTICA As análises da estrutura e da diversidade genética da população de C. canephora foram realizadas por meio de duas abordagens, pelo método Bayesiano implementado pelo software Structure v (PRITCHARD et al., 2000) e pela análise discriminante de componentes principais (DAPC) do software adegenet (JOMBART, 2008; JOMBART et al., 2010). Em ambas as abordagens, foram utilizados os mesmos marcadores e os mesmos indivíduos Structure O método Bayesiano implementado no Structure dispõe de poderosas ferramentas analíticas para verificar a estrutura genética dentro de um conjunto de dados, no entanto, esta abordagem assume que as populações estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg e que não existe equilíbrio de ligação entre o loco, ou seja, pré-requisitos que são frequentemente violados em populações naturais e em acessos de germoplasma. Além disso, requer tempo computacional considerável ao analisar grandes conjuntos de dados (OLIVEIRA et al., 2014). A estimativa do número de populações mais prováveis (K) no Structure foi realizada com burn-in fixado em seguido de repetições de MCMC (Markov Chain Monte Carlo) e K variando de 3 a 5. Os testes foram aplicados com base no admixture model

44 42 (modelo de miscigenação) com as frequências alélicas correlacionadas (FALUSH et al., 2003) e foi estimado o melhor K com uma estatística ad hoc denominada Delta K (EVANNO et al., 2005) Adegenet A DAPC é um método recente e alternativo ao método Bayesiano do Structure, que identifica os grupos genéticos em grandes conjuntos de dados, dentro do tempo computacional reduzido e na ausência de qualquer suposição sobre o modelo genético da população em estudo (JOMBART et al., 2010). Utilizando algumas variáveis sintéticas, denominadas funções discriminantes, a análise prioriza as diferenças entre os grupos e minimiza a variação dentro dos mesmos. Com base nas funções discriminantes retidas, é calculada a probabilidade de cada indivíduo pertencer a cada um dos diferentes grupos (ROULLIER et al., 2013). Para definir o número de grupos na DAPC é utilizado o algorítimo K-means e o critério de informação Bayesiana (BIC) onde o menor valor de BIC representa o número mais provável de grupos para o conjunto de dados analisados (JOMBART et al., 2010).

45 43 5 RESULTADOS 5.1 SELEÇÃO DOS INDIVÍDUOS Para auxiliar na escolha dos indivíduos analisados neste trabalho, foram utilizadas características como produção, suscetibilidade à ferrugem e tolerância ao déficit hídrico. Como ilustrado na Tabela 2, as plantas selecionadas apresentaram variabilidade para as características descritas. Ao avaliar as características em intervalos, foi possível verificar a existência de plantas distribuídas em todos os intervalos. Para produção, foram encontradas 21 plantas pouco produtivas (2 5 L), 336 plantas com produção intermediária (5 15 L) e 46 altamente produtivas (15 20 L). O mesmo ocorre para ferrugem e tolerância à seca. Em qualquer programa de melhoramento é primordial que haja diversidade entre os indivíduos e também que as características de interesse estejam presentes em um maior número de indivíduos. Desta maneira, observa-se na Tabela 2 que 223 plantas são altamente produtivas, produzindo de 10 a 15 L, 241 possuem baixa suscetibilidade à ferrugem e 218 apresentavam o maior potencial hídrico foliar de antemanhã ou seja, são tolerantes ao estresse hídrico. Tabela 2 Características avaliadas para os indivíduos selecionados na população da Embrapa Cerrados. Média da produção (apresentada em intervalo), em litros, obtida nas safras 2011/2012 e 2012/2013. Escala para suscetibilidade à ferrugem (0 imune; 1 baixa; 2 média e 3 alta). Intervalo de potencial hídrico foliar de antemanhã. Produção (L) Número de plantas Suscetibilidade à ferrugem Número de plantas Tolerância à seca* (MPa) 0,31 1,0 1,0 2,0 2,0 3,0 3,0 3,5 Número de plantas * Avaliação de tolerância à seca realizada por meio do potencial hídrico foliar de antemanhã, conforme descrito em Marraccini et al., Observação: Os intervalos para essa medida são valores negativos. 5.2 GENOTIPAGEM nextrad Um total de SNPs foram identificados para C. canephora Conilon utilizando a genotipagem por sequenciamento nextrad. Conforme apresentado na tabela 3 é possível observar a quantidade de reads mapeados nos diferentes cromossomos do genoma de referência de C. canephora (DENOEUD et al., 2014). Também foi possível observar dados

46 44 em um cromossomo extra, denominado Cromossomo 0, no qual estão localizados os contigs que não puderam ser alocados aos 11 cromossomos durante a montagem do genoma de referência de C. canephora. A partir desses dados foi observado que o maior número de marcadores SNPs foi identificado no cromossomo 0, com marcadores, seguido pelo cromossomo 2, com SNPs. O menor número de SNPs foi identificado no cromossomo 9, apenas 497. Tabela 3 Tamanho aproximado dos cromossomos de C. canephora, em Mbp, e número de marcadores SNPs mapeados por cromossomo. Cromossomos (Chr) Tamanho total dos cromossomos (Mbp) Número de marcadores Chr 0 ~ Chr 1 ~ Chr 2 ~ Chr 3 ~ Chr 4 ~ Chr 5 ~ Chr 6 ~ Chr 7 ~ Chr 8 ~ Chr 9 ~ Chr 10 ~ Chr 11 ~ Total Utilizando a análise de regressão linear, foi possível inferir sobre a comparação entre o número de marcadores identificados e o tamanho dos cromossomos (em Mbp), conforme ilustrado na Figura 12. O que possibilitou observar que o número de SNPs agrupados em cada cromossomo é proporcional ao tamanho do mesmo, ou seja, cromossomos maiores possuem um maior número de SNPs identificados, apresentando um R 2 de aproximadamente 95%.

47 Número de marcadores y = 12,016x + 370,06 R² = 0, Tamanho do cromossomo Figura 12 Correlação entre número de marcadores SNPs mapeados e tamanho dos cromossomos de C. canephora (Mbp). Os resultados descritos acima (Tabela 3 e Figura 12) permitem afirmar que a técnica nextrad mostrou-se eficiente para este trabalho, uma vez que identificou marcadores em todos os cromossomos, permitindo considerar que quanto maior o cromossomo maior o número de locos mapeados. No resultado final da genotipagem nextrad foram eliminados 36 indivíduos, sendo 32 pertencentes à população da Embrapa Cerrados e 4 parentais do INCAPER (Apêndice A), em decorrência da condição do DNA enviado para a genotipagem, revelando uma susceptibilidade do método nextrad em relação à qualidade do DNA. 5.3 DIVERSIDADE GENÉTICA Os índices de diversidade genética para os 573 SNPs analisados pelo software Cervus estão apresentados no Apêndice B. A média de Ho foi de 0.41 e variou de a Em aproximadamente 85% dos locos, a Ho estimada foi menor que A He variou de a 0.5 com média de Neste caso, aproximadamente 41% dos SNPs apresentaram He maior ou igual a Além da heterozigosidade, os valores de PIC também permitiram quantificar o polimorfismo genético dos locos em análise, este conhecimento é importante na identificação dos marcadores mais informativos. Os valores de PIC variaram de a e com valor

48 46 médio de Mais de 64% dos SNPs analisados apresentaram valores de PIC maiores que DESEQUILÍBRIO DE LIGAÇÃO Os resultados apresentados de desequilíbrio de ligação para cada cromossomo de C. canephora (Figuras 13, 14, 15 e 16) mostram, de maneira geral, um decaimento do DL em relação à distância, exceto para o cromossomo 0 (Chr 0), como já era esperado, pois este é formado pela união de scaffold que não mapearam nos 11 cromossomos de C. canephora, portanto, não está de acordo com o mapa genético. Especificamente para o cromossomo 5 (Chr 5), conforme apresentado na Figura 14, esse decaimento ocorre por volta de 2,5 kb. Já para os demais cromossomos, esse declínio é mais lento. Para os cromossomos 10 e 11 (Figura 16), verifica-se marcadores em desequilíbrio (r 2 =1) a uma distância de aproximadamente 7,5 kb. Essa distância é ainda maior, aproximadamente 10 kb, para os cromossomos 2 e 4, conforme apresentado nas figuras 13 e 14, respectivamente.

49 47 Chr 0 Chr 1 Chr 2 Figura 13 Decaimento do desequilíbrio de ligação, estimado com r 2, para o cromossomo 0 (Chr 0), cromossomo 1 (Chr 1) e cromossomo 2 (Chr 2) de C. canephora.

50 48 Chr 3 Chr 4 Chr 5 Figura 14 Decaimento do desequilíbrio de ligação, estimado com r 2, para o cromossomo 3 (Chr 3), cromossomo 4 (Chr 4) e cromossomo 5 (Chr 5) de C. canephora.

51 49 Chr 6 Chr 7 Chr 8 Figura 15 Decaimento do desequilíbrio de ligação, estimado com r 2, para o cromossomo 6 (Chr 6), cromossomo 7 (Chr 7) e cromossomo 8 (Chr 8) de C. canephora.

52 50 Chr 9 Chr 10 Chr 11 Figura 16 Decaimento do desequilíbrio de ligação, estimado com r 2, para o cromossomo 9 (Chr 9), cromossomo 10 (Chr 10) e cromossomo 11 (Chr 11) de C. canephora. 5.5 ANÁLISE DE PARENTESCO

53 51 A análise de parentesco, ao nível de confiança de 80/95%, possibilitou identificar os possíveis pais para a maioria dos indivíduos da população (Apêndice C). Foi possível observar que alguns indivíduos parentais eram bastante frequentes nessa população, possuindo um grande número de descendentes, como verificado para o cruzamento dos parentais PAR 148 e PAR 60, que possivelmente geraram 43 descendentes (Figura 17). Os parentais PAR 29 e PAR 60 geraram 39 descendentes (Figura 18). Os parentais PAR 148 e PAR 29 originaram 35 descendentes (Figura 19). E os parentais PAR 31 e PAR 60 geraram 34 descendentes (Figura 20). Figura 17 Possíveis 43 descendentes originados do cruzamento entre os parentais 148 e 60.

54 52 Par 29 Par 60 X L1P19 L1P26 L1P32 L1P34 L1P47 L1P49 L2P13 L2P19 L2P21 L2P42 L3P21 L3P35 L4P39 L4P53 L7P17 L7P52 L8P17 L8P48 L8P50 L8P69 L8P82 L9P66 L10P14 L10P23 L10P30 L10P95 L11P3 L11P46 L11P47 L11P55 L12P13 L12P65 L13P35 L13P60 L15P22 L15P35 L16P8 L19P59 L21P36 Figura 18 Possíveis 39 descendentes originados do cruzamento entre os parentais 29 e 60. Figura 19 Possíveis 35 descendentes originados do cruzamento entre os parentais 148 e 29.

55 53 Par 31 Par 60 X L1P10 L1P11 L1P15 L1P37 L2P1 L2P8 L2P24 L2P30 L2P65 L2P70 L3P17 L3P22 L3P37 L3P38 L4P9 L4P70 L5P45 L6P55 L6P66 L6P73 L7P67 L8P37 L8P66 L8P80 L9P91 L10P11 L11P56 L11P58 L13P6 L13P15 L13P21 L14P23 L14P24 L15P9 Figura 20 Possíveis 34 descendentes originados do cruzamento entre os parentais 31 e 60. Os cruzamentos entre o PAR 19 e PAR 28, e o PAR 17 e PAR 18, provavelmente deram origem somente a um único descendente, clone 14 (Figura 21A) e clone 120 (Figura 21B), respectivamente. Para o clone 22 observou-se a existência de possíveis irmãos (L9P23, L10P66, L14P2 e L18P22) oriundos do cruzamento entre os parentais 1 e 29 (Figura 21D). Do resultado do cruzamento entre o PAR 1 e PAR 70 tem-se o clone 73 e a planta L18P88 (Figura 21C). Par 19 Par 28 X Par 17 Par 18 X Par 1 Par 70 X CL14 CL120 CL73 L18P88 A B C Par 1 Par 29 X CL22 L9P23 L10P66 L14P2 L18P22 D Figura 21 Possíveis cruzamentos que deram origem aos clones 14, 22, 73 e 120 de C. canephora. A Parentais 19 e 28 originando clone 14. B PAR 17 e PAR 18 originando o clone 120. C PAR 1 e PAR 70 originando o clone 73 e a planta L18P88. D Cinco descendentes (clone 22, L9P23, L10P66, L14P2 e L18P22) do cruzamento entre os parentais 1 e 29.

56 54 Vale ressaltar que devido ao número mínimo de 500 locos de identidade, foram excluídos desta análise seis indivíduos pertencentes à população da Embrapa Cerrados e os parentais PAR 1111 e PAR ESTRUTURA GENÉTICA DE C. canephora Na seleção de indivíduos para o melhoramento, deve-se levar em consideração os estudos de diversidade genética, produtividade e a estabilidade de produção, associados a características de interesse para o produtor, indústria e consumidor. Muitas vezes não é tarefa simples eleger materiais genéticos para serem incluídos em programas de melhoramento. Portanto, os estudos de diversidade genética servem como um instrumento auxiliar na tomada de decisão Análises com 573 marcadores SNPs A análise com os 573 SNPs foi realizada utilizando dois software diferentes: o Structure e o adegenet. Primeiramente, por meio do software Structure, foi possível a alocação dos 436 indivíduos em três diferentes grupos, conforme apresentado na Figura 22 e Tabela 4. Figura 22 Resultado da atribuição dos 436 indivíduos de C. canephora em três grupos majoritários definidos pelo software Structure. As cores vermelha, verde e azul representam os grupos 1, 2 e 3, respectivamente. Observando os resultados apresentados na Tabela 4, é possível observar que dos três grupos formados, o primeiro grupo é representado por 85 indivíduos, possuindo apenas um indivíduo parental, PAR148. O segundo grupo é composto por 103 indivíduos, incluindo 9 parentais, e o terceiro e maior grupo, inclui os 4 clones de C. canephora e 34 parentais, agrupando um total de 248 indivíduos.