FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA PARA PRODUÇÃO DE PECTINASES UTILIZANDO BAGAÇO DE LARANJA SECO

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1 FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA PARA PRODUÇÃO DE PECTINASES UTILIZANDO BAGAÇO DE LARANJA SECO S. R. ALCÂNTARA 1, M. S. DE MEDEIROS 2, J. P. GOMES 2, S. F. M. SANTOS 1, F. L. H. DA SILVA 3, H. V. ALEXANDRE 4 1 Universidade Estácio de Sá, Faculdade Estácio de Sá de Ourinhos 2 Unidade Acadêmica de Engenharia Agrícola - Universidade Federal de Campina Grande - CEP: Campina Grande PB Brasil (serrano1205@hotmail.com; josivanda@gmail.com). 3 Departamento de Engenharia Química - Universidade Federal da Paraíba- Centro de Tecnologia - CEP: João Pessoa PB Brasil, Telefone: 55 (83) (flavioluizh@yahoo.com.br). 4 Programa Nacional de Pós-Doutoramento Programa de Pós Graduação em Engenharia de Processos - Universidade Federal de Campina Grande - Campina Grande PB; Telefone: 55 (83) (hofsky@gmail.com). RESUMO O objetivo deste estudo foi a produção de poligalactorunases por fermentação semissólida, usando como substrato o bagaço de laranja seco e como microrganismo Aspergillus niger CCT O processo fermentativo foi realizado em erlemmeyers fechados com tampão de algodão envolvidos com gaze. Um planejamento experimental fatorial 2 3 foi utilizado para maximizar a produção da enzima. As variáveis estudadas foram: a umidade inicial do bagaço de laranja (40 a 60%), concentração inicial de uma fonte de nitrogênio (1 a 2%) e temperatura de fermentação (25 a 35 C). A maximização da atividade enzimática (18,78 U/g) foi conseguida sob as condições de 60% de umidade inicial, 2% de concentração de sulfato de amônio e 25 C de temperatura de fermentação. PALAVRAS-CHAVE: resíduos; enzimas; Aspergillus niger. ABSTRACT The aim of this study was the polygalactorunases production in semisolid fermentation, using as substrate the dried orange peel and as microorganism Aspergillus niger CCT In the fermentation process, we used the fungus Aspergillus niger strain CCT The fermentation process was carried out in closed erlemmeyers with cotton wool wrapped in gauze was used. A factorial design 2 3 was used for optimization of the enzyme. Variables studied were: the initial moisture orange pulp (40 to 60%), initial concentration of a nitrogen source (1 to 2%) and fermentation temperature (25 to 35 C). The maximization of enzymatic activity (18.78 U / g) was achieved under the conditions of 60% initial moisture concentration of 2% ammonium sulfate and 25 C of fermentation temperature. KEYWORDS: residues; enzymes; Aspergillus niger. 1. INTRODUÇÃO Com relação à citricultura, na safra 2011/2012, o Brasil produziu cerca de 25% da produção mundial de laranja (428 milhões de caixas de 40,8 kg) que somaram US$ 2,276 bilhões em exportações para quase 90 países. Além de também ser responsável por mais da metade do suco de laranja produzido no mundo. O estado de São Paulo detém quase 80% da produção nacional de laranja constituindo-se como maior polo citrícola do mundo (Souza, 2013). Paralelo à importância do setor, observa-se a grande geração de resíduos. Tais resíduos possuem alto valor de reutilização. Dessa forma, nos últimos anos, uma atenção especial vem sendo dada ao

2 reaproveitamento dos mesmos em diferentes processos industriais. Estes resíduos envolvem quantidades apreciáveis de casca e caroço que, além de fonte de matéria orgânica, servem também como fontes de produção de diversas substâncias, como por exemplo, proteínas, enzimas e óleos essenciais, que são passíveis de recuperação e aproveitamento em processos, como os processos fermentativos (Pinto et al., 2006). Nas últimas décadas, tem-se observado um aumento na tendência do uso da fermentação semissólida (FSS) para a produção de algumas enzimas, em especial, aquelas envolvidas na degradação de macromoléculas vegetais complexas. A qualidade do produto obtido está diretamente relacionada com fatores do processo fermentativo semissólido, sendo os mais importantes a aeração, transferência de oxigênio, temperatura, transferência de calor, atividade de água, umidade e a escolha adequada do microrganismo e do substrato (Couto e Sanromàn, 2005). O nível de umidade do substrato é um dos fatores que mais influenciam o processo FSS e varia de acordo com a natureza do substrato, tipo de produto final e necessidade do microrganismo. Um nível de umidade muito alto resulta em diminuição da porosidade, baixa difusão de oxigênio, aumento no risco de contaminação, redução no volume de gás e redução de troca gasosa. Reduzidos níveis de umidade levam a um menor grau de crescimento em relação ao ótimo e baixo grau de substrato realmente utilizado (Pinto et al., 2006). O nitrogênio é constituinte essencial do tecido fúngico, já que está presente em todas as moléculas de aminoácidos e consequentemente nas proteínas. Observa-se que os fungos apresentam diferenças na habilidade da utilização das diversas fontes de nitrogênio. Nenhum fungo conhecido fixa nitrogênio atmosférico, portanto, é necessário fontes de nitrogênio para a síntese de aminoácidos, vitaminas, purinas e pirimidinas dos ácidos nucléicos e para síntese de glicosamina para montagem de quitina, polímero que é o principal componente estrutural da parede celular fúngica (Pastore et al. 2011). Pectinase é uma enzima que degrada a pectina. As pectinases têm sido usadas em vários processos industriais, tais como têxteis, fibras de plantas de processamento, o chá, o café, as frutas, na extração de petróleo, tratamento de águas residuais industriais, na clarificação de sucos (Pasha et al., 2013). Diante deste contexto, este trabalho teve como objetivo o estudo do processo de produção de poligalacturonases, através da fermentação semissólida, usando como substrato o bagaço seco de laranja pêra (Citrus sinensis L. Osbeck), e como agente da fermentação o microrganismo Aspergillus niger CCT Para isso, como primeira etapa, foi realizada a caracterização do substrato e, em seguida, foi observada a influência dos fatores umidade inicial do meio, temperatura de fermentação e concentração inicial de sulfato de amônio, executando um planejamento experimental fatorial 2 3, observando como resposta a atividade poligalacturonásica. 2. MATERIAL E MÉTODOS As laranjas foram higienizadas com uma solução de hipoclorito de sódio a 2%. Em seguida, feita a extração do suco em espremedor elétrico. Sobrando então o resíduo constituído pelas cascas, albedos e o bagaço da laranja. O resíduo foi moído em moedor mecânico, após esse processo, levado a estufa com circulação de ar a 55 C por 48 h, para secagem. Em seguida o material foi triturado. Para a caracterização físico-química, foram determinadas a granulometria do resíduo seco (ABNT, 1984), densidade aparente, densidade real, porosidade, ph (Brasil, 2005), cinzas (Brasil, 2005), umidade (Brasil, 2005), sólidos solúveis totais (SST), Brix (Brasil, 2005), açúcares redutores totais (ART) (Correia, 2004), açúcares redutores (AR) (Miller, 1959), pectina (Rangana, 1979) e proteína total (Le Poidevin e Robinson, 1964), sendo as análises realizadas em triplicata. Para a realização do processo fermentativo, foi utilizado o fungo filamentoso da linhagem Aspergillus niger CCT 0916, pertencente à coleção da Embrapa Agroindústria Tropical, com sede em Fortaleza - CE. Os mesmos foram cultivados no Laboratório de Engenharia Bioquímica

3 (LEB/UAEQ/UFCG), em tubos de ensaio com tampas rosqueadas, contendo solo estéril e estocados a - 18 C. Os conídios foram ativados em duas etapas, usando meio básico, conforme Couri (1993). A quantificação da suspensão de esporos foi feita através de contagem em Câmara de Neubauer espelhada. A densidade de suspensão de esporos foi ajustada de modo a ter-se um inóculo com 10 7 esporos por grama de substrato sólido. Os esporos foram inoculados em meio previamente esterilizado. As fermentações ocorreram em erlemmeyers fechados com tampão de algodão envolvidos com gaze. O meio com bagaço de laranja foi umidificado com solução de sulfato de amônio, de forma que a concentração deste fator e a umidade inicial do meio estivessem de acordo com o planejamento experimental executado. Após inoculação dos esporos, os meios foram levados para a estufa úmida, com temperatura controlada, de acordo com o planejamento. Foi realizado um planejamento experimental fatorial 2 3 com três repetições no ponto central, totalizando 11 ensaios, sendo estes realizados de forma aleatória. As variáveis dependentes foram a concentração de sulfato de amônio (N), umidade inicial do meio (U) e temperatura de fermentação (T). Os valores adotados para os níveis das variáveis foram com base nos valores definidos no trabalho de Santos et al. (2008), que estudaram a influência da concentração da fonte de nitrogênio (0, 0,5 e 1%) e da umidade (40, 50 e 60%) sobre a produção de pectinases, utilizando o pedúnculo do caju. Tais níveis servem como ponto de partida no estudo desenvolvido, que tem como objetivo principal a verificação das influências das variáveis independentes em reação a resposta. Na Tabela 1 se encontram os níveis utilizados no planejamento experimental. Tabela 1 Níveis do planejamento experimental 2 3 Fatores Níveis U (%) N (%) 1 1,5 2 T ( C) Amostras de meio foram retiradas periodicamente durante o processo (5, 21, 29, 46, 54, 70 e 78 h de fermentação), determinando-se a atividade poligalacturonásica (PG). No período de tempo adotado, o pico de atividade poligalacturonásica máximo pode ser detectado. O procedimento para extração do extrato enzimático foi baseado em Castilho (1997). Após retirada das amostras, foi adicionado tampão acetato de sódio 200 mm, ph 4,5, na concentração de 5 ml/g de meio. A medida da atividade poligalacturonásica foi determinada conforme Couri (1993), adaptado por Embrapa Agroindústria Tropical - Fortaleza/CE. Foi definido que uma unidade de atividade poligalacturonásica corresponderia a quantidade de enzima que libera 1 μmol de ácido poligalacturônico por minuto de reação, a 35 C por 30 minutos. Para a validação do modelo estatístico, obtido pela regressão linear dos dados experimentais foram utilizados os parâmetros de coeficiente de determinação (R 2 ) e razão do F calculado por F tabelado (teste F), com 90% de confiança. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Caracterização físico-química do bagaço seco de laranja

4 A caracterização do substrato foi realizada com o intuito de conhecer a composição do resíduo utilizado, determinar quais nutrientes foram disponibilizados para o microrganismo e suas concentrações, além de definir a concentração do indutor pectina. Os parâmetros determinados, os valores médios e os desvios padrões das medidas encontram-se na Tabela 2. Tabela 2 Valores médios e desvios padrão dos parâmetros do bagaço de laranja em base seca Parâmetro Valor Parâmetro Valor Umidade (%) 10,3 ± 0,138 ph 4,03 ± 0,020 Cinzas (%) 3,56 ± 0,025 ART (%) 22,3 ± 1,07 Proteína total (%) 3,43 ± 0,367 AR (%) 17,87 ± 0,327 Pectina (%pectato de cálcio) 4,25 ± 0,288 SST ( Brix) 40,0 ± 0,001 Densidade aparente 0,66 ± 0,011 Na análise granulométrica do resíduo seco, verificou-se que mais de 80% das partículas possuem tamanho entre 20 e 35 mesh, o que corresponde a valores de diâmetro entre 0,84 e 0,425 mm. De acordo com Santos et al. (2008), estudando a produção de pectinases por fermentação em estado sólido, utilizando pedúnculo de caju como substrato, nos resíduos secos a granulometria apresentou cerca de 70% das partículas com tyler de 20-35, semelhante ao valor encontrado neste trabalho Produção de poligalacturonases usando planejamento experimental Na Tabela 3, encontram-se os valores de atividade poligalacturonásica obtidos a partir dos extratos enzimáticos coletados dos 11 ensaios realizados, em seus respectivos tempos de fermentação. Os maiores valores, por tempo de fermentação, encontram-se em negrito. A partir dos valores apresentados na Tabela 3, foi feita análise de variância para todos os tempos de fermentação, com o intuito de definir os modelos empíricos (regressão linear dos dados experimentais do planejamento) significativos e/ou preditivos. Com isso, foram calculados os coeficientes de correlação (R 2 ) e foi realizado o Teste F, para cada modelo. Os modelos empíricos encontram-se descritos na Tabela 4. Tabela 3 Valores da atividade poligalacturonásica por tempo de fermentação Tempo (h) Ensaios/Atividade poligalacturonásica (U/g) ,00 0,00 1,08 0,00 0,73 0,00 0,00 0,00 0,00 0,96 0, ,26 2,10 1,38 0,76 5,06 5,15 2,11 6,43 5,50 7,14 4, ,99 7,59 3,12 1,40 3,95 3,81 2,92 6,39 5,09 6,74 4, ,00 7,94 5,12 0,56 10,85 8,27 5,54 7,93 6,54 6,54 6, ,59 8,74 5,44 12,80 1,32 9,80 5,43 7,85 9,10 7,02 8, ,11 9,19 5,61 18,78 5,91 9,23 6,56 8,81 7,63 4,68 8, ,18 8,26 2,94 10,96 6,26 9,79 4,27 9,21 6,50 11,03 10,32 Os modelos (Tabela 4) foram obtidos sem interações com 90% de confiança. Os termos em negrito são significativos com este nível de confiança (p<0,1). Os modelos para 46, 54 e 78 h de fermentação foram significativos, observando-se o Teste F, que foi maior que do 1. Contudo, verificando-se o coeficiente de determinação (R 2 ), apenas o tempo de 54 h apresenta um valor acima de 0,8, o que é considerado de razoável para bom. De acordo com os modelos significativos, observa-se que a umidade inicial tem efeito positivo sobre a atividade poligalacturonásica, independente do tempo de fermentação, ou seja, atividade poligalacturonásica segue a tendência de aumentar com o aumento da umidade no meio.

5 Tabela 4 Modelos empíricos para as atividades PG Modelos empíricos R 2 Teste F PG (5)= 0,30-0,23U + 0,04N - 0,04T 0,229 0,23 PG (21)= 3,79 + 0,58U - 0,36N + 1,66T 0,488 0,72 PG (29)= 4,34 + 0,90U - 0,44N + 0,37T 0,232 0,23 PG (46)= 6,29 + 0,02U - 1,36N + 2,00T 0,613 1,20 PG (54)= 7,20 + 2,93U + 1,01N - 0,77T 0,821 3,49 PG (70)= 8,30 + 2,73U + 1,16N - 1,15T 0,553 0,94 PG (78)= 7,70 + 2,45U - 0,26N + 0,27T 0,614 1,21 F tabelado (3,7) = 3,07. Os valores dos coeficientes em negrito apresentam p<0,1. A partir do modelo significativo no tempo de 54 h, construiu-se a superfície de resposta. Segue abaixo representada pela Figura 2. Para construção da superfície, fixou-se a variável que mais influência apresentou entre as três, no caso umidade, no nível +1 (60%). Observa-se, Figura 2, que operando o processo, fixando a umidade do meio semissólido em 60%, o maior valor está em aproximadamente 12 U/g, para temperatura no nível -1 (2%) e fonte de nitrogênio no nível +1(25 C). Verificando-se pontualmente os experimentos da Tabela 3, no tempo de 70 h, ocorreu a maior atividade poligalacturonásica (18,78 U/g), sob as condições de 60% (nível +1) de umidade inicial, 2% (nível +1) de concentração de sulfato de amônio (fonte de nitrogênio) e 25 C (nível -1) de temperatura de fermentação. Estes dados dos níveis das variáveis independentes do processo em estudo corroboram com o estudo da superfície de resposta para o tempo de 54 h (modelo matemático estatisticamente significativo, ao nível de confiança de 90% - Figura 2). Ou seja, mesmo o modelo matemático de processo fermentativo no tempo de 70 h não apresentar significância estatística, analisando pontualmente o experimento 4, Tabela 3, pode-se observar tendência de atividade da enzima máxima de 18,78 U/g, operando a fermentação com os níveis que aumentam o processo em estudo. Figura 2 Superfície de resposta para atividade poligalacturonásica no tempo de 54 h de fermentação. Li et al. (2015) utilizaram a metodologia de superfície de resposta para otimizar a produção de pectinases, em processo de fermentação submersa, tendo como substrato cascas de laranja em pó. A caracterização do substrato forneceu as concentrações: cinzas 3,94%, proteína 6,25% e pectina 22,10%.

6 Além disso, o planejamento fatorial Plackett-Burman executado definiu que a temperatura e a concentração de NH 4 Cl possuíam significativa influência sobre a atividade da enzima exo-pectinase. A temperatura ótima de produção enzimática (36,88 U/mL) foi igual a 36,5 C, com 1,12 g/l de concentração de NH 4 Cl. 4. CONCLUSÕES No processo de fermentação, a umidade teve influência significativa em todos os tempos da fermentação, assim como a temperatura. Contudo, a adição de sulfato de amônio não foi relevante para o processo. O modelo matemático de regressão dos dados experimentais para 54 h de fermentação apresentou significância estatística. A melhor atividade enzimática (18,78 U/g) foi obtida sob as condições de 60% de umidade inicial, 2% de concentração de sulfato de amônio e 25 C de temperatura de fermentação. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Brasil. Instituto Adolfo Lutz (2005). Métodos físico-químicos para análise de alimentos. Brasília: Ministério da Saúde. Castilho, L. R. (1997). Recuperação de pectinases produzidas por Aspergillus niger em fermentação semisólida. (Dissertação de mestrado). Universidade do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. Correia, R. T. P. (2004). Estudo do cultivo semi-sólido de Saccaharomyces cerevisiae e Rhizopus oligosporus em resíduo de abacaxi. (Tese de Doutorado). Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal. Couri, F. (1993). Efeito de cátions na morfologia do agregado e na produção de poligalacturonase por Aspergillus niger mutante 33T5B8. (Tese de doutorado), Universidade do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. Couto, S. R., & Sanroman, M. A. (2005). Application of solid-state fermentation to food industry- a review. Journal of Food Engineering, 22, Le poidevin, N., & Robinson, L. A. (1964). Métodos ou diagnósticos foliar utilizados nas plantações do grupo booken na Guiana Inglesa: amostra geral e técnica de análises. Fertilité, 21, Li, P., Xia, J., Shan, Y., Nie, Z., Su, D., Gao, Q., Zhang, C., & Ma, Y. (2015). Optimizing production of pectinase from orange peel by Penicillium oxalicum PJ02 using response surface methodology. Waste biomass Valor, 6, Miller, G. L. (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, v. 31, p Pasha, K. M., Anuradha, P., & Subbarao, D. (2013). Applications of Pectinases in Industrial Sector. International Journal of Pure and Applied Sciences and Technology, 16(1), Pastore, N. S., Hasan, S. M., & Zempulski, D. A. (2011). Produção de ácido cítrico por Aspergillus niger: avaliação de diferentes fontes de nitrogênio e de concentração de sacarose. Engevista, 13, Pinto, G. A. S., Brito, E. S., Silva, F. L. H., Santos, S. F. M., & Macedo, G. R. (2006). Fermentação em estado sólido: Uma alternativa para o aproveitamento e valorização de resíduos agroindustriais. Revista de Química Industrial, 74, Rangana, S. (1979). Manual of analysis of fruit and vegetable products. New Delhi: Tata McGraw-Hill. Santos, S. F. M., Macedo, G. R., Silva, F. L. H., Souza, R. L. A., & Pinto, G. A. S. (2008). Aplicação da metodologia de superfície de resposta no estudo da produção e extração da poligalacturonase. Química Nova, 31, Souza, C. D. (2013). Análise da pesquisa científica no setor citrícola a partir de indicadores bibliométricos. (Dissertação de mestrado). Universidade Federal de São Carlos, São Carlos.